Schnell Fluorescent In-situ- Hybridisierung Protokoll für Xist-RNA in Kombination mit Immunfluoreszenz von Histonmodifikationen in X-Chromosom-Inaktivierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik der langen nicht-kodierenden RNA und der damit verbundenen epigenetischen Modifikation während der Inaktivierung des X-Chromosoms unter Verwendung einer schnellen fluoreszierenden in situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunfluoreszenz zu untersuchen. Dieses Protokoll erfordert die Cytosin-Präparation von Objektträgern mit differenzierenden embryonalen Körperzellen, die durchdringt und dann für die Färbung fixiert werden. Als nächster fluoreszierender Marker, lokalisiert durch einen Antikörper gegen Histon H, reichert sich drei Trimethyllysin 27 auf dem inaktiven X-Chromosom an.

Im letzten Schritt werden Oligonukleotidsonden verwendet, die eine Fünf-Prime-Aminomodifikation enthalten und mit einem AM-Mittelwert reaktiven Fluorophor markiert sind, um eine vorhandene Existenz durchzuführen. RNA-Fische. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Lokalisierung der vorhandenen RNA-Wolke und der Histonmodifikation während der Differenzierung von E-Es-Zellen zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass wir mehrere einzigartige Oligonukleotide verwenden, die mit einem einzigen Fluorvier markiert sind. Dies ermöglicht uns eine trans-spezifische Detektion, die den Hintergrund reduziert, und dies erhöht auch die Durchdringung des Zellkerns und erhöht oder verstärkt die Intensität der Signale. Wenn wir die Konzentration der Sonden erhöhen, können wir außerdem die Zeit, die für die Durchführung dieses Immunfischexperiments benötigt wird, erheblich reduzieren.

Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Lokalisierung der vorhandenen RA auf dem inaktiven Ex-Chromosom und die damit verbundene Chromo-Modifikation geben. Es kann auch auf andere biologische Systeme zur Detektion von RAs und der damit verbundenen epigenetischen Modifikation, Kernlokalisierung und transgenerationalen Regulation angewendet werden. Um die Sonden vorzubereiten, erhalten Sie zunächst mehrere Oligos mit einer Länge von 20 bis 30 Nukleotiden mit einer Schmelztemperatur von 63 bis 65 Grad Celsius, die eine einzigartige Antisense-Sequenz zu einer existierenden RNA und einer Modifikation von fünf Prim-Aminosäuren enthalten.

Suspendieren Sie diese Oligos in äquimolaren Mengen der verschiedenen Oligos in einem Reinwasserpool, um insgesamt 4,5 Mikrogramm DNA zu erhalten. Markieren Sie dann gemäß den Anweisungen des Herstellers die Oligos mit einem am mittleren reaktiven Fluoreszenzfarbstoff, nachdem die Oligos markiert wurden. Führen Sie sie durch eine Spalte G 25.

Dann werden die Oligos mit Ethanol und Natriumacetat ausgefällt. Dafür braucht es eine halbstündige Periode bei minus 80 Grad Celsius, bevor man sich bei vier Grad Celsius um 21.000 G dreht. Waschen Sie das Pellet anschließend nach dem Waschen einmal mit 70 % Ethanol.

Bei der Reanimation werden die Oligos in 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser oder Tris-EDTA bis zu einer Endkonzentration von 10 mikromolaren DNA suspendiert. Dies führt dazu, dass die Sondenstammlösung zur Verwendung der Sonde auf 250 Nanomolar in einem Hybridisierungspuffer rekonzentriert wird. Lassen Sie zunächst ES- oder EB-differenzierende Zellen in sechs Vertiefungsschalen wachsen, saugen Sie das Kulturmedium aus den Vertiefungen ab und waschen Sie die Zellen dann bei Raumtemperatur.

PBS saugen das PBS gründlich an. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Trypsinlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte fünf bis 10 Minuten lang. Stoppen Sie die Tripsin-Reaktion, indem Sie fünf Milliliter Medien in jede Vertiefung geben und vorsichtig pipettieren.

Übertragen Sie dann die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie nun die Zellen fünf Minuten lang bei 200 G bei Raumtemperatur herunter, entfernen Sie den gesamten Überstand und resuspendieren Sie die Zellpalette in zwei Millilitern PBS. Zählen Sie dann die Zellen und verdünnen Sie die Suspension auf 400.000 Zellen pro Milliliter in PBS.

Bauen Sie nun jeden Objektträger mit einer Filterkarte, einer Kammer und einem Clip zusammen. Stellen Sie so viele her, wie Sie benötigen, und positionieren Sie sie in den Rotor eines Zytospins. Geben Sie 250 Mikroliter Zellsuspension zu jedem Objektträger und drehen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1500 U/min.

Dann dauerwellen und fixieren. Übertragen Sie die Objektträger zunächst schnell für fünf Minuten als Spülschritt in eiskaltes PBS. Zweitens, übertragen Sie die Objektträger für eine Minute in eiskalten CSK-Puffer, um zu quellen, und bewegen Sie die Objektträger für fünf Minuten in CSKT-Puffer, um die Zellen zu permatieren.

Viertens waschen Sie die Zellen eine Minute lang in eiskaltem CSK-Puffer. Und zum Schluss fixieren Sie sie 10 Minuten lang in Raumtemperatur 4% Paraformaldehyd in PBS. Entfernen Sie zunächst die Objektträger aus der PFA-Lösung.

Füllen Sie sie dann für einige Sekunden in ein Coplan-Glas mit PBST und stellen Sie sie dann zum Abtropfen schräg auf. Befüllen Sie als Nächstes eine leere Pipettenspitzenbox mit Wasser unter dem Spitzenhaltereinsatz. Wischen Sie dann die Rückseiten der Dias ab und übertragen Sie sie in diese Box.

Überlagern Sie nun jeden Objektträger mit 40 Mikrolitern Blockierlösung und bedecken Sie die Objektträger vorsichtig mit Deckgläsern. Lassen Sie sie in der Box 10 Minuten auf der Bank inkubieren. Entfernen Sie dann die Deckgläser und stellen Sie die Objektträger schräg auf.

Geben Sie nun 40 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu. Setzen Sie die Deckgläser wieder auf und lassen Sie die Objektträger nach einer halben Stunde 30 Minuten lang auf der Bank inkubieren. Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper, indem Sie die Objektträger zweimal in PBST in Coplan-Gläsern waschen.

Schütteln Sie es leicht und lassen Sie jede Wäsche fünf Minuten lang laufen. Stellen Sie dann die Objektträger wieder in eine Schräge und lassen Sie den PBST abtropfen. Wischen Sie anschließend die überschüssige Lösung von den Rückseiten der Objektträger ab und legen Sie die Objektträger wieder in die Schachtel zurück.

Tragen Sie nun 40 Mikroliter einer bis 500 Sekundärantikörperlösung auf jeden Objektträger auf. Decken Sie die Objektträger mit Deckgläsern ab und lassen Sie sie 15 Minuten lang lichtgeschützt auf der Bank inkubieren. Die Dias sollten immer vor Licht geschützt werden.

Entfernen Sie die Antikörper wie zuvor mit PBST und stellen Sie dann die Objektträger schräg ein, damit sie abtropfen können. Wenn Sie Immunfluoreszenz durchführen, erwärmen Sie eine Box mit Wasser auf 37 Grad Celsius. Nachdem Sie den Waschpuffer von den Rückseiten der Objektträger abgewischt haben, legen Sie ihn in eine Pipettenspitzenbox mit warmem Wasser und tragen Sie 500 Mikroliter Fischwaschpuffer auf jeden Objektträger auf.

Lassen Sie sie fünf Minuten lang inkubieren. Nach fünf Minuten wird die Lösung aus den Objektträgern neben jedem Objektträger bei acht Mikrolitern der Arbeitssonde bei Raumtemperatur abgesaugt und ein Deckglas aufgebracht. Übertragen Sie nun die Objektträger in die vorwarme Objektträgerbox und inkubieren Sie sie für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Baden Sie die Objektträger nach der Inkubation in Fischwaschpuffer in einem Coplan-Glas bei 37 Grad Celsius. Wenn die Deckgläser abfallen, was in der Regel einige Minuten dauert, entfernen Sie die Deckgläser und lassen Sie die Objektträger fünf Minuten lang inkubieren. Übertragen Sie die Objektträger dann in ein Glas mit Fischwaschpuffer mit 0,5 Nanogramm Feuchtfleck pro Milliliter, ebenfalls bei 37 Grad Celsius.

Lassen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in dieser Lösung inkubieren. Waschen Sie nun den Objektträger in zwei XSSC fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Zum Schluss setzen Sie die Schieber auf einen schrägen Abfluss von zwei XSSC

Wischen Sie sie ab und montieren Sie sie mit vier Mikrolitern Antifa-Lösung, die dpi enthält. Quick Immuno Fish wurde verwendet, um die Lokalisation der vorhandenen RNA und die Histonmodifikation zu beobachten. Bei der Differenzierung weiblicher EB-Zellen existiert die RNA wie eine grüne Wolke, die die gesamte Länge des einen inaktivierten X-Chromosoms bedeckt. In diesen Zellen ist die Histon-H-Trimethyl-Lysin-27-Modifikation rot dargestellt und die Zellkerne sind durch DPI in blau gegengefärbt.

Differenzierende weibliche Maus-EB-Zellen wurden am Tag 12 der Differenzierung verarbeitet. Zu diesem Zeitpunkt zeigten mehr als 90 % der Zellen eine vorhandene Wolke in den Zellkernen, in die kurze Oligonukleotidsonden effizient eindringen konnten, was zur Färbung fast aller Histon-H-Trimethyllysin-27-Signale führte. Mit vorhandenen RNA-Wolken in 150 Zellkernen wurde festgestellt, dass 97 % der vorhandenen RNA-Signale mit diesen methylierten Histonen kolokalisiert sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als fünf Stunden durchgeführt werden, um eine leichte Vorbereitung abzuschließen.

Die Immun-Immunfluoreszenz für seine liegt bei drei Trimestern bei 27 und es gibt RA. Wenn wir richtig gearbeitet haben, kann dieses Immunfisch-Protokoll auf andere epigenetische RNA-Modifikationen und Proteine von Interesse angewendet werden. Um dieses Protokoll auf ein anderes biologisches System anzuwenden, benötigen Sie möglicherweise einige Optimierungen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.