Name: Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Larven-RNAi-Technik zur effizienten Gen-Knockdown in Tribolium castaneum. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genstudien in der Entwicklungsbiologie und Insektenphysiologie.

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Wir danken dem Zentrum für Bioinformatik und Funktionelle Genomik (CBFG) an der Miami University für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Miami University Gründungszuschuss (YT) und der National Science Foundation (: IOS 0.950.964 YT) unterstützt.

1. T. castaneum Aktien und Anzucht <ol><li> Entscheiden Sie sich für eines T. castaneum Stamm für das Experiment zu verwenden. HINWEIS: Mehrere Labor etablierten T. castaneum Stämme sind verfügbar. Ga-1 (Georgia-1) ist der elterliche Stamm von Ga-2, die für die Genomsequenzierung 3 verwendet wurde. Da Ga-1 teilt die meisten DNA-Polymorphismen (wie Single-Nukleotid-Polymorphismen, SNPs) mit Ga-2 und ist gesünder als Ga-2 durch weniger Inzucht, ist es ideal für RNAi-Experimente. Pu-11 ist eine weitere Belastung bequem zu bedienen , als seine einzigartige verbesserte gelb fluoreszierende Protein (EYFP) Ausdruck in der Zukunft Flügel Primordia erlaubt uns, die letzten Larvenstadium von anderen Stadien zu unterscheiden (siehe Abbildung S4 der Clark-Hachtel et al. 2013 12). Es ist wichtig zu dokumentieren, welche Käfer-Stamm in dem Experiment verwendet wurde, wie genetischen Hintergründen erscheinen deutlich affect die RNAi Phänotypen 13. </li><li> Bereiten T. castaneum Kultur Mehl durch Zugabe von 5% (nach Gewicht) von Pre-gesiebt Bierhefe zu Bio-Vollkornmehl (nach dem Mischen, speichern Sie die Kultur Mehl bei -20 ° C). Aliquot der Kultur Mehl (bei ​​Raumtemperatur) in 6 Unzen Kunststoff Drosophila Vorratsflaschen (ca. 40 g / Flasche). </li><li> Kultur T. castaneum bei 30 ° C mit 70% Feuchtigkeit. Verwenden Sie eine feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator, wenn möglich. Fügen 30-40 Erwachsene pro Kulturflasche (männlich: weiblich Verhältnis 1: 1), um die Kultur zu starten. HINWEIS: Obwohl Form ist selten ein Problem bei 30 ° C niedrigere Temperaturen (wie 25 ° C) mit 70% Luftfeuchtigkeit kann Schimmelpilzwachstum in der Kultur Mehl verursachen. Senken Sie die Luftfeuchtigkeit, wenn dies geschieht. </li><li> Übertragen Sie die Erwachsenen zu einer neuen Kulturflasche alle zwei Wochen zur Subkultivierung (siehe Schritt 5,2-5,5 damit wie Erwachsene aus Kultur Mehl zu isolieren). HINWEIS: Es dauert etwa drei Wochen, um die letzten Larvenstadium zu erhalten. Alternathungsweise, T. castaneum Kulturen bei einer niedrigeren Temperatur (20-25 ° C) mit einer längeren Kultivierung Zeitraum aufbewahrt werden, wenn auch (Entwicklungszeit bei 25 ° C etwa doppelt so bei 30 ° C). </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Instrumente zum Larven dsRNA Injektion <ol><li> Synthese von dsRNA-Moleküle homolog zu der Ziel-Gens durch in vitro-Transkription. Bei -80 ° C. Siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte molekularbiologische Verfahren. Siehe auch Diskussion für eine Anzahl von Parametern, die berücksichtigt werden müssen bei der Entwicklung dsRNA-Moleküle. </li><li> Machen 10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C) durch Mischen von 8,5 ml 1 M Na 2 HPO 4 mit 1,5 ml 1 M NaH 2 PO 4. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter und entsprechend anpassen. </li><li> Auffüllen auf 1 ml 10x Injektionspuffer durch Mischen von 10 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C), 100 _6; l 0,5 M KCl, 100 ul grüne Lebensmittelfarbe, und 790 ul doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Verdünnen Sie die 10x Injektionspuffer auf 2x Injektionspuffer (200 ul 10x Injektionspuffer + 800 ul ddH 2 O) zu machen. Lagern, 10x und 2x Injektionspuffer bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sticky Glasobjektträger. <ol><li> Decken eine ganze Glasträger mit einer Form von Haftkleber für Larven Injektionen. Für Erwachsene oder Puppen Injektionen, machen zwei dünne Streifen von Kleber entlang den längeren Kanten der Folie. </li><li> Der Kleber für mehrere Tage, was sicherstellt, dass der Kleber klebrig bleibt genug Käfer zu der Folie haften zu trocknen, aber auch biegsam genug ist, um deren Entfernung nach der Injektion erleichtern bleibt. HINWEIS: Wenn der Kleber bleibt zu klebrig, mit einem Finger, und tippen Sie auf den Leim, die die Klebrigkeit verringern. Jede Folie kann bis zu 40 oder 50 Käfer zu halten, und kann wiederverwendet werden, bis es nicht sicher zu halten, die Tiere. Alterntiv kann doppelseitiges Klebeband verwendet werden, wobei das Band manchmal nicht genug, um die Larven zu halten Klebstoff. </li></ol></li><li> Machen Sie ein etherization Korb. <ol><li> Entfernen Sie den Kolben aus einer 10 ml Einwegspritze, und schneiden Sie die Spritze in die Hälfte der ganzen Linie 6 ml. </li><li> Entsorgen Sie die untere Hälfte der Spritze. Kurz erhitzen die Schnittfläche des oberen Teils der Spritze, die mit einem Gasbrenner, und schnell schieben der geschmolzene Kunststoff auf einem Stück Nylonnetz, das Netz auf die Spritze zu kleben. Schneiden Sie den über Mesh, sobald der Kunststoff aushärtet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Äther-Flasche. 30 ml Äther in einen schmalen Mund-100 oder 250 ml Glasflasche. Fügen mehrere Stücke von Tissue-Papier, um die Verdampfung des Ethers zu verbessern. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Immer Äther behandeln unter einer Abzugshaube. Schließen Sie den Deckel fest, während nicht in Gebrauch ist. HINWEIS: Ice kann als sicherere Alternative (wie in einem Klassenzimmer) verwendet werden, obwohl die sedation ist weniger effektiv. </li></ol> 3. Herstellung von Larven Pritzvorrichtung <ol><li> Ein XY-Kreuztisch auf einem Binokular. HINWEIS: XY Kreuztische sind über führende Unternehmen Mikroskop. Alternativ können kostengünstig Mikroskoptische auch für die meisten Sezieren Mikroskope mit einigen Modifikationen verwendet werden (siehe Tabelle Werkstoffe zum Beispiel). </li><li> Legen Sie eine mechanische Nadel Manipulator in der Nähe der XY-Kreuztisch. </li><li> Montieren Sie eine Injektionsspritze. Verwendung einer Vierwegehahn (mit Luer-Verbindungen), um eine 30 ml Einwegspritze auf eine Glasnadelhalter zu verbinden, so dass Manipulation der Injektionsspritze, ohne den Druck in der Injektionsnadel (siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für die detaillierte Injektionsspritze Montage). </li></ol> 4. Ziehen Injektionsnadeln <ol><li> Ziehen Borosilikatglas Nadeln (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm Länge), die durch einNadelmagnet. HINWEIS: Sutter P-87 oder P-97, verwenden Sie die Einstellung &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90&quot; oder folgen Sie Kapitel 2 der Pipette Cookbook: adhärenten Zell, C. elegans, Drosophila, Zebrafisch und - Empfohlene Programme. Die optimalen Einstellungen variieren je nach Modell von der Nadel abziehen. Die Einstellung für eine generische Drosophila Injektionsnadel ist ein guter Ausgangspunkt. </li><li> Shop gezogen Nadeln in einem Kunststoffgehäuse (zB ein Kunststoff CD-Hülle) und mit abnehmbaren Montage Kitt. </li></ol> 5. Isolierung und Selektion von Larven <ol><li> Legen Sie ein # 25-Sieb auf ein Sieb Empfänger. </li><li> Legen Sie die Inhalte der Kulturflasche (Käfer und Kultur Mehl) auf dem Sieb und sichten den Inhalt sofort. Die Inhalte auf dem Sieb ohne Sichtung Lassen Sie nicht, wie Larven werden schnell versuchen, durch das Sieb zu graben und nicht weiterkommen. Aggressiv zu sichten den Inhalt in das Mehl fallen lassendurch und lassen ältere Larven (in der Regel 6 und 7. Larvenstadium), Puppen und Erwachsene (zusammen mit ihren abgelegten Nagelhaut, exuviae) hinter auf dem Sieb. </li><li> Übertragen Sie die auf dem Sieb verbleibenden (Käfer und exuviae) auf den Samen Pfanne Materialien. Klopfen Sie die Pfanne, um die Käfer an der Flucht zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die exuviae und die Mehlpartikel auf der Oberfläche verbleibenden der Käfer durch sanft weht über dem Samen Pfanne. </li><li> Tippen Sie auf das Saatgut Pfanne, um den Inhalt auf den Boden der Pfanne zu bewegen. Dann lassen Sie die Pfanne ungenutztes für einige Sekunden. Warten Sie, bis die Erwachsenen, die mobiler als andere Stufen sind, um aus dem Stapel heraus. Erwachsene zu entfernen, indem ein Kunst Pinsel (beispielsweise 1 cm Breite). </li><li> Separate Puppen durch leichtes Klopfen den Samen Pfanne, während die Mündung der Pfanne leicht nach unten, als Puppen sind in der Regel schneller zum Mund rollen. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Puppen zu entfernen, so dass nur die Larven auf dem Saatgut Pfanne. </li><li> PlAce den Larven isoliert in einem sauberen Petrischale. Wählen Sie einen geeigneten Stadium der Larven für die Injektion und legen Sie sie in einem separaten Petrischale. HINWEIS: Anfang letzten Larvenstadium (1-2 Tage nach der letzten Häutung der Larven) sind oft geeignet, wenn die Analyse der RNAi-Effekt auf die Erwachsenen Morphologien sowie Metamorphose. Es ist jedoch manchmal notwendig, RNAi bei der vorletzten zuführen (oder früher) Stufe zur frühen Gen-Funktion zu bewerten (beispielsweise, 3E-3H. Siehe auch Clark-Hachtel et al. 2013 12). Verwenden Puppen als Referenzgröße, um die Larvenstadium der Larven zu identifizieren. Das letzte Larvenstadium sind etwas länger als Puppen. Alternativ können PU-11 verwendet, um die letzten Larvenstadium zu identifizieren sowie den zeitlichen Verlauf der Entwicklung des letzten Larvenstadium (Abbildung S4 in Clark-Hachtel et al. 2.013 12) zu bestimmen. </li><li> Halten Sie die ausgewählten Larven in einer Petrischale bis etherization. Legen Sie den Restder Larven und auf anderen Stufen der Käfer (wie Puppen und Erwachsene) wieder in eine Kulturflasche mit Mehl und bringen Sie es in den Inkubator. </li></ol> 6. Herstellung von Injektionsnadeln <ol><li> Legen Sie eine zuvor zog Glas Nadel auf einen Glasobjektträger entweder klebrig oder doppelseitiges Klebeband. Mit einer Pinzette, testen Sie die zog Ende der Nadel während Sie durch den Binokular, wo die Spitze biegt sehen. Besorgen Sie sich die Fläche, die etwas in Richtung der Spitze der Seite, wo die Nadel biegt mit der Zange und Wendung zu brechen. </li><li> Halten gute Nadeln und verwerfen andere. Betrachten wir eine gute Nadel mit einer Öffnung, die weder zu groß noch zu klein (etwa 0,05 mm Durchmesser. 1A und 1B) und ist abgewinkelt, um das Eindringen der Larvencuticula einfacher (1B und 2A-2B) zu machen. Betrachten Sie eine schlechte Nadel (i) zu klein, so dass die Aufnahme der dsRNA-Lösung in die Nadel schwieKult (Schritt 7) (1D und 2D), (ii) zu groß ist, was zu Verletzungen und Larven möglich Letalität bei der Injektion (1C und 2F), (iii) stumpf, so dass das Eindringen der Nagelhaut schwierig und zunehmende Verletzung. </li><li> Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter. <ol><li> Zuerst schrauben Sie die Spitze des Nadelhalters und legen Sie das hintere Ende der Nadel in die Halterung Spitze. Legen Sie dann die Gummidichtung unter dem Halter Spitze (mindestens 1 cm vom hinteren Ende des Glas Nadel). </li><li> Die Rücken der Nadel in die Halterung, mit der Gummidichtung vollständig in die Öffnung des Nadelhalters eingeführt. Schrauben Sie die Spitze zurück auf den Halter. </li></ol></li><li> Legen Sie die zusammengebauten Nadelhalter auf die Nadel Manipulator. Halten Sie den Nadelhalter in der Nähe von horizontal. Stellen Sie die Position des Manipulators, so dass die Spitze der Nadel in der Mitte der Ansicht befindet, wenn Sie durch den MICRoscope. </li></ol> 7. Frontloading dsRNA-Lösung in die Nadel <ol><li> Bereiten Sie die dsRNA Injektionslösung unmittelbar vor der Injektion durch Einstellen der Konzentration mit ddH 2 O und Mischen des dsRNA-Lösung mit gleichen Volumina 2x Injektionspuffer (Schritt 2.3). Halten Sie die Mischlösung auf Eis. Siehe Diskussion über die dsRNA-Konzentration. </li><li> Schneiden Sie die Spitze eines 20 ul Einweg-Pipettenspitze. Je 10 ul der Lösung in die Pipettenspitze getrimmt. Entfernen Sie vorsichtig den Pipettenspitze aus der Pipette, während die Flüssigkeit an der Spitze durch Gegendruck. Alternativ entfernen Sie vorsichtig die Spitze und bewegen Sie dann die Lösung für das Ende der Spitze durch Druck mit einem Finger. </li><li> Die Pipettenspitze mit der dsRNA-Lösung auf dem Mikroskoptisch mit klebrig mit der Öffnung nach die Spitze der Nadel. </li><li> Blick durch das Mikroskop, langsam bewegen die geladene Spitze in Richtung der Nadel, bis die Spitze desNadel ist nur innerhalb des geladenen Pipettenspitze und in die Lösung. </li><li> Während der Blick durch das Mikroskop, ziehen Sie den Kolben der Injektionsspritze langsam ziehen die dsRNA-Lösung in die Nadel. HINWEIS: Überladen Sie die Nadel. Als das Ende der dsRNA Lösungsansätze die Spitze der Nadel, verlangsamen die Rate zu ziehen und das Laden der Lösung vor der Spitze der Nadel würde Luft zu erreichen. Wenn Luft die Spitze erreicht, wird die Lösung schnell in den Nadelhalter gezogen werden, was zu schweren Kontamination Fragen. Detaillierte Reinigungsverfahren des Nadelhalters in Philip und Tomoyasu 2011 11 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie den Druck aus der Injektionsspritze und Nadelhalter durch das Öffnen der Hahn. Dann bewegen Sie die Pipettenspitze von der Spitze der Nadel. Heben Sie die Nadel aus der Bühne, um nicht versehentlich zu beschädigen die Nadel beim Aufsetzen der Larven auf der Bühne. Entfernen Sie die geleert Pipettenspitze von der Bühne. </li></ol&gt; 8. dsRNA Injektion <ol><li> Legen Sie die Larven in die etherization Korb. Nutzen weniger als 10 Larven, wenn das Erlernen der Technik. Verwenden Sie 30-40 Larven in einer Runde einmal bequem mit der Technik. </li><li> Platzieren Sie den Korb mit Larven im Äther-Flasche und den Deckel schließen. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Führen Sie diesen Schritt unter einer Abzugshaube. </li><li> Etherize Larven für etwa 3 min. Überprüfen Sie die Larven für die Bewegung nach 3 min. Legen Sie sie zurück in den Äther-Flasche für weitere 30 sec, wenn sie noch in Bewegung sind. Nicht länger als 5 min Etherize da dies Letalität erhöhen. HINWEIS: Die optimale etherization Zeit kann je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren. </li><li> Übertragen Sie die veretherte Larven aus dem Korb auf die Antihaft-Kante einer Glas klebrige Folie. Mit einer Pinzette und, während Sie durch das Mikroskop, nehmen Sie jede Larven eine nach der anderen und legen Sie sie auf die Folie. Legen Sie sie seitlich und klopfen Sie leicht nach unten ihre Körper from Kopf bis Schwanz mit der Zange, leicht Stretching ihnen, wie Sie gehen, um sicherzustellen, dass sie auf der Folie gesichert. </li><li> Legen Sie die klebrige Rutsche mit Larven auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Legen Sie die dsRNA geladen Nadel vorsichtig in die dorsale Seite der Larven verhindert die Beschädigung des ZNS. Vermeiden Sie auch die Rückenmittellinie, da die Larven Herz befindet sich hier. In dieser und den folgenden Schritten immer die Bühne, um die Larven zu der Nadel (anstatt die Nadel Manipulator, um die Nadel zu bewegen) zu bewegen. HINWEIS: Die spezifische Injektionsstelle nicht als RNAi Rolle in T. castaneum erscheint systemischen sein. Jedoch ist es üblicherweise am einfachsten in die dorsale Seite der Brust-und Bauchsegmente injizieren. </li><li> Nach dem Einlegen der Nadel in die Larven, ziehen Sie die Nadel leicht wieder auf Raum ermöglichen die dsRNA die Larvenkörperhöhle zu gelangen. </li><li> Drücken Sie leicht auf die Injektionsspritze, bis die Larven wiederum grün (oder der Farbe des Injektionspuffer) und suchen stretched und voll. Hinweis: Wenn das Erlernen der Technik versuchen, so viel wie möglich zu injizieren, um die Menge der Lösung, die in eine Larve ohne signifikante Letalität injiziert werden kann bestimmen. Es ist im allgemeinen etwa 0,5-0,7 ul. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Larven. Beim Entfernen der Nadel leicht wieder auf die Injektionsspritze auf dsRNA Verlust zu vermeiden ziehen (auch darauf achten, nicht in der Luft zu ziehen). </li><li> Injizieren alle Larven auf der Folie. Achten Sie darauf, Larven, die nicht erfolgreich injiziert wurden, zu entfernen. Vollständige Injektion vor Larven aufwachen (in ca. 10 min). </li><li> Entfernen Sie den Schlitten mit eingespritzt Larven aus der Einspritz Mikroskop und lassen Sie die Folie noch 5 Minuten, bis alle Larven erholen sich von der etherization. </li><li> Mit Pinzette und unter einem Binokular, heben die Larven von Kopf bis Schwanz, um sie von der klebrigen Schieber freizugeben. Legen Sie die neu veröffentlichten Larven in einer sauberen Petrischale. Verlassen Sie die Larven auf der Petrischale für 10-15 min, um die Injektion w ermöglichenound gerinnen. </li><li> Legen Sie die Larven in eine neue Flasche mit sauberem Mehl und Etikett entsprechend der Belastung einschließlich Name, die Art der dsRNA injiziert, der Konzentration der dsRNA, die Anzahl der Larven injiziert und das Datum. </li><li> Kultur der injizierte Larven bei 30 ° C mit 70% Luftfeuchtigkeit. Beachten Sie die Larven für RNAi-Phänotypen regelmäßig. Hinweis: Die letzten Larvenstadium verpuppen sich innerhalb von 7 Tagen. Dann werden die Puppen zu Erwachsenen nach 7 Tagen schlüpfen (wenn es keine Abnormalität in Zeit durch RNAi verursacht). </li></ol> 9. Bestätigung des Knockdown und phänotypische Analysen <ol><li> Sehen Beurteilung Effizienz RNAi knock down von verschiedenen molekularbiologischen Techniken, wie quantitative reverse Transkription-PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Siehe Miller et al. 2012 7 und Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte qPCR und Western Blot-Protokoll auf. </li><li> Analysieren RNAi-Phänotypen im Zusammenhang. HINWEIS: RNAi verwandtenPhänotypen können in verschiedenen Stadien und bei verschiedenen Kulturbedingungen beobachtet werden, abhängig von den Genen, die gezielt wurden. RNAi kann den Käfer Morphologie, Metamorphose, Physiologie und Verhalten beeinflussen. Wie oft die Anwesenheit von Phänotyp wird überprüft und unter welchen Bedingungen die Käfer aufgezogen werden sollten, um den spezifischen Fragen zugeschnitten werden sie durch RNAi untersucht. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Es gibt eine Reihe von wichtigen Fragen, die berücksichtigt, um den Erfolg zu garantieren RNAi werden müssen, einschließlich der Länge und Konzentration der dsRNA-Moleküle, Wettbewerb zwischen verschiedenen dsRNA-Moleküle (bei dem Versuch mehrere knock down), und die Möglichkeit der Off-Target-Effekte (OTE). dsRNA Länge Die Länge der dsRNA Moleküle beeinflusst die Effizienz der systemischen RNAi-Antwort, wobei eine längere dsRNA in dem effizienteren RNAi 7,14,15 auslösen (obwohl die längere Begrenzung der dsRNA ist derzeit unbekannt). Die dsRNA Länge braucht länger als 50 bp sein, um effektive RNAi in T. induzieren castaneum 7. dsRNA zwischen 150 bp und 500 bp scheint für RNAi-Experimente ideal. Obwohl längere dsRNA-Moleküle können auch verwendet werden, müssen sie eine erhöhte Chance OTE und das Gen-Klonierung Schritt wird zunehmend schwieriger. dsRNA Konzentration ve_content &quot;&gt; verschiedene Grade der Zuschlags Gen kann in Abhängigkeit von der Konzentration der dsRNA erreicht werden. 1 ug / ul scheint ein vernünftiger Ausgangskonzentration, die häufig erzeugt ein nahezu Null-Phänotyp sein (je nach Gen (en) von Interesse variieren ). RNAi kann mit einer höheren Konzentration (beispielsweise 7-8 ug / ul) durchgeführt, um eine stärkere RNAi-Phänotyp. RNAi mit einer seriellen Verdünnung der dsRNA erhalten kann manchmal vorteilhaft sein, eine Reihe von Phänotypen hypomorphen (Zusatzdaten von Tomoyasu erzeugen et al. 2009 8, und Borràs-Castells unveröffentlichte Daten). RNAi-Wettbewerb Mehrere Gen Knockdown in T. erreicht werden castaneum durch Injektion von verschiedenen dsRNA-Moleküle gleichzeitig. Es ist jedoch auch bekannt, dass mit mehreren dsRNA Moleküle im Organismus vorhandene oft in Konkurrenz zwischen den dsRNAs für den Zugriff auf die RNAi-Komponenten <sbis&gt; 7,14. Es ist wichtig, die gleiche Länge und die gleiche Konzentration für alle dsRNA zu verwenden, wenn versucht mehrere Gen Zuschlags einer dsRNA aus konkurrierenden die andere (obwohl vermeiden, weitere Anpassungen der dsRNA Länge und Konzentration erforderlich, wenn die Expressionsniveaus erheblich zu unterscheiden Zielgene). Wir, als auch andere, haben erfolgreich doppelt und dreifach durchgeführt Zuschlags (zB Tomoyasu et al. 2.005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, und Yang et al. 2009 18). Obwohl machbar, Vierbett-RNAi (oder mehr) könnte eine Herausforderung sein, da es wahrscheinlich zu erheblichen Reduktion der RNAi Effizienz für alle vier Zielgene. Off-Targeting OTE ist eine inhärente Interesse für RNAi-basierte Ansätze. Ein Weg, um OTE zu minimieren ist es, Regionen in der Ziel-Gens, die ähnliche Sequenzen mit anderen Genen teilen erkennen und zu vermeiden, diese Regionen bei der Gestaltung dsRNA. Eine einfache BLAST-Analyse gegen die T. castaneum vorhergesagt Gen-Set können solche Regionen zu identifizieren. Mehrere Online-Tools ermöglichen auch Bewertung potenzieller OTE (zB E-RNAi-19). Ausführen RNAi für zwei nicht-überlappenden Bereichen des Target-Gens ist eine einfache und effiziente Weise, um die Möglichkeit, die Phänotypen von OTE konstatiert beseitigen. Die Möglichkeit der OTE wird minimiert, wenn RNAi für zwei nicht-überlappenden Regionen zu den gleichen Phänotyp (es sei denn, die beiden nicht überlappenden Regionen eine ähnliche Sequenz). Auswertung Gen durch andere als phänotypische Analysen mittels Knockdown ist oft entscheidend, um effektiv vorhanden RNAi-Daten. Zwei große Möglichkeiten, um Gen-Knockdown zu bewerten sind qRT-PCR und Western-Blot-Analyse. qRT-PCR ist ein bequemer Weg, um das Niveau der Ziel-mRNA zu messen, und hat sich in vielen RNAi bezogenen Studien einschließlich der in T. verwendet castaneum (siehe Miller et al. 2012 7 zum Beispiel). HowevER ist Vorsicht eingenommen werden, da wir in letzter Zeit einige Fälle, in denen das Ziel-mRNA-Ebene hochreguliert durch RNAi (obwohl das Proteinprodukt herunterreguliert) (Borràs-Castells unveröffentlichte Daten) zu sehen. Es ist derzeit nicht bekannt, ob diese RNAi induzierte mRNA Hochregulation kann verbreitet oder eindeutig bestimmte Gene sein. Western-Blot-Analyse ist ein weiterer Weg, um Gen-Knockdown bestätigen. Dieses Verfahren ist sehr zuverlässig, da sie die Menge der endgültigen Proteinprodukt mißt. Das Erfordernis eines spezifischen Antikörpers gegen das Proteinprodukt des Zielgens ist ein Nachteil dieses Ansatzes. Verwendung von mehreren unabhängigen Messungen zusätzlich zu phänotypische Analyse wird das Vertrauen der von RNAi-basierten Analyse erhaltenen phänotypischen Daten zu erhöhen. Seit seiner Vorstellung in T. castaneum, RNAi wurde in erster Linie verwendet, um Gen-Funktion in der Entwicklung und Musterbildung zu studieren. Diese T. castaneum Entwicklungsstudien wurden in CHARAC sehr erfolgreichzeichnenden evolutionär konserviert und auseinander Funktionen von Genen (in Denell 2008 1 und 2004 2 Klingler überprüft). Allerdings RNAi-basierte Studien in T. castaneum sind nicht auf die Entwicklungsbiologie beschränkt. So kann beispielsweise genutzt werden, um RNAi Gen-Funktion in einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensreaktionen, einschließlich Stresstoleranz, Plünderung, Aggression, Partnerwahl, Aktivitätsmuster und Abwehrmechanismen zu studieren. Eine Schwierigkeit der Anwendung von RNAi auf diesen Zusammenhängen ist die Wahrscheinlichkeit, pleiotrope Effekte. Oft Gene von Interesse wird eine Vielzahl von Rollen in der gesamten T. haben castaneum Lebenszyklus, wodurch die Entfernung von Genen, ohne unbeabsichtigte phänotypischen Wirkungen schwierig. Allerdings kann die Fähigkeit, leicht durchzuführen RNAi bei einer Vielzahl von Phasen oft eine wirksame Strategie zur Vermeidung dieser pleiotropen Effekte. Zum Beispiel, die Durchführung von RNAi bei Erwachsenen statt Larven oder Puppen könnte es uns ermöglichen, zu umgehen unbeeher durch Gen-Knockdown Letalität verursacht während der frühen Entwicklung. Die Flexibilität des RNAi-Antwort in T. castaneum macht somit dieses Modell eine attraktive Wahl für die Anpassung RNAi Experimente der Genfunktion in physiologischen und Verhaltensreaktionen. Die T. castaneum System ist auch ideal für die Verwendung in einem Lehrlabor. T. castaneum auf einem Mehl / Hefe-Mischung bei Raumtemperatur (25 ° C) ohne häufige Subkultivierung leicht kultiviert werden, und RNAi-Techniken in T. castaneum sind einfach genug, um zu einem Labor mit kleinen Lern Wissenschaftler angepasst werden. RNAi ist zu einem wesentlichen Technik in einer Vielzahl von biologischen Bereich, ist es wichtig, dass die Schüler auf diese Technik ausgesetzt. Die geradlinige Art der Larven RNAi-Technik in T. castaneum fördert auch mehr Studenten in die Forschung einbezogen werden, so dass T. castaneum ein heißer Kandidat für ein Klassenzimmer ausgerichtet genetisches System. &lt;/ P&gt;

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Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Der rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum, ist an Popularität gewinnt in verschiedenen Bereichen der Biologie zum Teil aufgrund der einfachen Durchführung der RNA-Interferenz (RNAi) 1-3. RNAi-basierte Gen-Knockdown-Techniken den Wissenschaftlern ermöglichen, führen loss-of-function-Analysen ohne Verwendung komplexer genetischer Methoden. T. castaneum zeigen eine robuste systemischen RNAi-Antwort, die es ermöglichen, RNAi in jeder Phase durch einfache Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in der Käfer Körperhöhle 4-6 durchzuführen. Gleichzeitige Knockdown von mehreren Genen ist auch denkbar, in T. castaneum durch Einspritzen von zwei oder mehr verschiedenen dsRNA-Moleküle gleichzeitig 7,8. Darüber hinaus kann eine Reihe von Phänotypen hypomorphen durch Verringerung der Konzentration der dsRNA injiziert 8 erzeugt werden. Diese Eigenschaften machen RNAi-basierten Reverse genetische Techniken attraktive Alternativen zu herkömmlichen vorwärts Genetik in T. castaneum. Da praktischalle T. castaneum Gewebe sind anfällig für extrazellulären dsRNA-Moleküle 9, diese Technik können Forscher eine Vielzahl von Geweben in verschiedenen Kontexten zu untersuchen. Darüber hinaus, obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Durchführung von RNAi in T. castaneum, sind hier beschrieben viele Verfahren auf andere Insekten. Daher ist dieses Protokoll nützlich für diejenigen führen möchten Verlust-Funktion analysiert in ihren Zusammenhängen von Interesse in T. castaneum, als auch für Forscher, die ein RNAi-basierte Technik, um andere Insekten gelten. Einspritzen von dsRNA in Larven ermöglicht Funktionsanalyse bei einer Vielzahl von Käferlebensstadien, einschließlich der Larven, Puppen und adulte Stadien 4,5,10. Wir haben bereits berichtet unser Gesamtlarven RNAi-Protokoll einschließlich Molekularbiologie Verfahren 11. Im vorliegenden Bericht konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der dsRNA Injektionsverfahren, die am besten mit visuellen Hilfen erläutert werden. Wir bietenausführliche Schritt-für-Schritt-Einspritzverfahren sowie gute und schlechte Beispiele Injektion. Diese visuelle Protokoll ergänzt unsere bisherigen Protokoll, und wenn sie kombiniert, bieten sie eine umfassendere Sicht der Larven RNAi Verfahren in T. castaneum. Darüber hinaus diskutieren wir Parameter für dsRNA-Moleküle, die den Erfolg der RNAi, die Anwendung von RNAi-basierten Assays für physiologische Forschung, sowie die Anwendbarkeit des Larven RNAi-Protokoll in einer Lehre Labor beeinträchtigen könnten.

<table><tbody><tr><td>Bio-Vollkornmehl&nbsp;</td><td>Heartland Mill Inc. Kansas</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Brauerei s Hefe</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>Hefe vor Gebrauch mit einem #35 Edelstahlsieb sieben. Tragen Sie eine Schutzmaske und decken Sie das Sieb mit Frischhaltefolie ab, da die gesiebte Hefe ein Feinstaub und eine Gefahr für die Atemwege darstellt.</td></tr><tr><td>6 oz Plastik Drosophila Vorratsflaschen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>Sieb</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-881N</td><td>Ø 8 Zoll x 2 Zoll Verwendung #25 (Nennöffnung 710 & Mikro; m) für Larven, Puppen und adulte Tiere.</td></tr><tr><td>Sieve</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04 881 10P</td><td>8 Zoll Durchmesser #35 (Nominale Sichtöffnung: 600 &Mikro; m)&nbsp; Edelstahlsiebe, 8 Zoll Durchmesser x 2 Zoll Dieses Sieb ist ideal, um Klumpen aus Hefepulver zu entfernen.</td></tr><tr><td>Siebbehälter</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-866B</td><td>8 Zoll Durchmesser</td></tr><tr><td>1,5 Quart Probenwanne mit Ausguss</td><td>Seedburo Ausrüstung Co.</td><td>Modell 33</td><td>Auffangwanne</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>BioCold Environmental Inc</td><td>BC26-IN</td><td>Halten Sie es 30 > C mit 70% Luftfeuchtigkeit.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Lebensmittelfarbe&nbsp;</td><td>Kroger</td><td></td><td>grün, blau oder rot bevorzugt</td></tr><tr><td>Objektträger aus Mikroskopglas&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Tack-It Über& Über</td><td>Aleenes repositionierbarem</td><td></td><td>Kleber für klebrige Folien. Als Alternative kann doppelseitiges Klebeband verwendet werden, wir haben jedoch festgestellt, dass die Haftfähigkeit variiert.</td></tr><tr><td>Kunststoff-CD-Hülle</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boroslilicat Glaskapillare</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-15</td><td>Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,5 mm, 15 cm. Ohne Filament</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-87 oder P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Abnehmbarer Montagekitt&nbsp;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Druckluftgas-Staubwedel</td><td>OfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tool</td><td>11231-30</td><td>Dumoxel #3 (zur Manipulation von Käfern)</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-20</td><td>INOX #5 (zum Brechen von Nadelspitzen)</td></tr><tr><td>Ethylether, wasserfrei&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh</td><td>Flystuff/Genessee Scientific</td><td>57-102</td><td>120 &micro; m Porengröße/49% offene Fläche</td></tr><tr><td>Medienflasche, 100 ml</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V12. Mikroskop für Injektionen.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Fisher/Zeiss</td><td>12-070-513&nbsp;</td><td>Stemi2000. Verwenden Sie die Nadel, um die Nadel zu brechen und die Larven auf den klebrigen Objektträger zu legen.</td></tr><tr><td>X-Y mechanischer Tisch&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>43546000000000000</td><td></td></tr><tr><td>X-Y mechanischer Tisch&nbsp;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>Preiswerter alternativer</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>Narishige</td><td>GJ-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillarhalter</td><td>Narishige</td><td>IM-H1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Einmalspritze</td><td>BD Spritze</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lok Spitze</td></tr><tr><td>Vierwegehahn&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Instrument Co.</td><td>EW-30600-03</td><td>Absperrhähne mit Luer-Anschlüssen; 4-Wege; männlicher Slip</td></tr><tr><td>Art Pinsel</td><td>Amazon</td><td>Art Advantage Öl- und Acrylpinsel-Set, 24-teilig</td><td>Jeder gängige Pinsel funktioniert.</td></tr></tbody></table>

larven rna-interferenz in das rote mehlkäfer, tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Der rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum bietet ein Repertoire von Versuchswerkzeugen für genetische und Entwicklungsstudien, inklusive einer vollständig annotierte Genomsequenz, Transposon-basierten Transgenese und effektive RNA-Interferenz (RNAi). Unter diesen Vorteilen sind RNAi-basierte Gen-Knockdown-Techniken im Mittelpunkt der Tribolium Forschung. T. castaneum zeigen eine robuste systemischen RNAi-Antwort, die es ermöglichen, RNAi jederLebensPhase durchführen, indem Sie einfach die Injektion doppelsträngiger RNA (dsRNA) in die Körperhöhle des Käfers. In diesem Bericht stellen wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in T. castaneum. Das Protokoll umfasst (i) Isolieren der richtigen Phase des T. castaneum Larven zur Injektion, (ii) Vorbereitung für den Einspritzeinstellung und (iii) dsRNA-Injektion. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die uns mit den schnellen Zugriff auf Verlust-of-function Phänotyp bietetES, darunter mehrere Gen-Knockdown-Phänotypen sowie eine Reihe von Phänotypen hypomorphen. Da fast alle T. castaneum Gewebe sind anfällig für extrazellulären dsRNA kann der Larven RNAi-Technik Forscher eine Vielzahl von Geweben in verschiedenen Zusammenhängen, einschließlich genetischer Grundlage organismal Antworten auf die Außenumgebung zu studieren. Darüber hinaus ist die Einfachheit dieser Technik stimuliert mehr Beteiligung der Studierenden in die Forschung, so dass T. castaneum ideale genetisches System für die Verwendung in einem Klassenzimmer.

Einer der wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Injektion ist, um eine gute Nadel machen. Wie in Schritt 6 beschrieben, wird die Spitze der Nadel muß vor dem Injizieren T. gebrochen castaneum. Beispiele für gute und schlechte Nadeln sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein guter Nadel hat eine scharfe Spitze und steif, mit einem etwa 0,05 mm Durchmesser Öffnung (Abbildung 1B). Figur 2 zeigt eine erfolgreiche Injektion (2A und 2B) als auch in mehreren Fällen erfolglos Injektionen (2C-2F). Mit einer richtigen Größe Injektionsnadel dringt die Nadelspitze die Larvencuticula mit minimalem Widerstand (2A), und die dsRNA-Lösung (grün) fließt in die Larven ohne Leckage (2B). Nicht zu spritzen, da es Überlauf des dsRNA-Lösung sogar mit einem richtigen Größe Injektionsnadel (Abbildung verursachen2C). Wenn die Spitze der Nadel zu dünn ist, die Nadelspitze oft nicht die Larvencuticula und Biegungen zu durchdringen, so dass die Injektion schwierig (2D). Wenn dies geschieht, Beschneiden der Nadelspitze hilft manchmal. Größere Nadeln sind oft noch brauchbar, wenn auch mit einigen Schwierigkeiten bei der Durchdringung des Larvencuticula (2E). Jedoch wird eine große Menge der dsRNA Lösung leicht aus der Nadel geschoben auch mit leichtem Druck auf die Injektionsspritze, was häufig zu einem Überlauf des dsRNA-Lösung (2F). Bei der Durchführung von RNAi, ist es wichtig, eine positive Kontrolle zu haben, um zu beurteilen, dass RNAi ordnungsgemäß funktioniert, und eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, dass der beobachtete Effekt nicht eine unspezifische Wirkung von dsRNA oder eine Folge von Einspritzverfahren (wie Schädigung durch Injektion oder einer Missbildung von etherization). Injektion von dsRNA Targeting EYFP kann als dienengute positive Kontrolle bei der Verwendung der PU-11-Stamm 5,7. Wenn EYFP dsRNA ist in der letzten Larvenstadium injiziert wird, kann eine signifikante Reduktion der EYFP-Signal in der Zukunft Flügel Primor Bereits einen Tag nach der Injektion (3A) beobachtet werden. Die Knockdown von EYFP abgeschlossen zwei Tage nach der Injektion des EYFP dsRNA (3B) und das Zuschlags besteht durch das Puppenstadium (3C und 3D) und während der gesamten Lebensdauer des Käfers wenn die dsRNA Konzentration hoch genug ist (wie 1 ug / ul). 7 EYFP dsRNA auch als negative Kontrolle verwendet, da es ein nicht-endogenes Gen-Sequenz und nicht morphologischen oder physiologischen Störungen (3A-3D) verursachen. Wir stellten Bilder Larven RNAi für Rest (VG), ein kritisches Gen Flügel 12, als ein weiteres Beispiel, wie efdefekt Diese Injektion basierende RNAi-Technik ist in T. castaneum. Wenn dsRNA für vg in vorletzten Larven (eine Stufe vor dem letzten Larvenstadium) injiziert wird, kann ein vollständiger Verlust der Flügelstrukturen im Puppenstadium (3E und 3F) beobachtet werden. Die daraus resultierende Erwachsenen auch ganz fehlt Flügelstrukturen (Abbildungen 3g und 3h). Die RNAi-Ergebnis für vg beispielhaft sowohl die Robustheit und die systemische Natur der RNAi in T. castaneum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> Abbildung 1: (A) Beispiele für ungebrochen, gute und schlechte Nadeln (B) Die Spitze eines gut gebrochen gute Nadel (C) Die Spitze eines gebrochenen Nadel, die zu groß und stumpf ist (D) Die Spitze... einer pleite n Nadel, die zu dünn ist. Maßstabsbalken (rot) sind 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> Abbildung 2:... (A) Eine richtig große Injektionsnadel in den letzten Larvenstadium eingesetzt (B) Larve entsprechend mit dem grünen dsRNA injizierten Lösung (C) Überlauf des dsRNA-Lösung an der Injektionsstelle durch Über Injektion verursacht (D ) Eine dünne Nadel Falls Sie die Larvencuticula eindringen. (E) Eine große Injektionsnadel in den letzten Larvenstadium eingesetzt. (F) eingespritzt Larve mit einer großen Nadel, was zu Überlauf und ein Auslaufen des dsRNA-Lösung. Pfeile zeigen die Nadeln.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> Abbildung 3: Beispiele erfolgreicher RNAi in T. castaneum. (AD) letzten Larven Injektion der EYFP-dsRNA zu einer Verringerung der Expression EYFP. (A) Larven einen Tag nach der Injektion. (B) Larven zwei Tage nach der Injektion. (C) Steuer Puppen. (D) Puppen entstehende Larven EYFP dsRNA Injektion. Die negativen Kontrollen Pufferinjektion (A, B) und dsRed dsRNA-Injektion (C, D). Pfeilspitzen und Pfeile zeigen EYFP Ausdruck oder deren Fehlen in der Flügelprimor und Augen auf. (EH) Penultimative Larven RNAi für vg. (E) Wildtyp-Puppe. (F) vg RNAi Puppe. Das Fehlen von Flügelstrukturen bereits am Puppenstadium (Pfeil). G) Wildtyp Erwachsenen. (H) vg RNAi Erwachsenen sichtbar. Flügel verwandte Strukturen sind vollständig fehlt (Pfeil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

RNA-Interferenz (RNAi) basierten Gen-Knockdown-Techniken sind der Kern der Tribolium Forschung. Hier geben wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in Tribolium castaneum. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die den schnellen Zugriff auf Verlust-Funktion Phänotypen bietet, so dass die Forscher Gen-Funktionen in verschiedenen Kontexten zu studieren.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein interessierendes Gen über RNA-Interferenz im Roten Blumenkäfer Trium cadium auszuschalten, indem doppelsträngige RNA-Lösung in die Körperhöhle der Larve injiziert wird. Dies wird erreicht, indem zuerst das richtige Stadium der Larven von der Kultur isoliert wird, indem die Kulturblüte gesiebt und die Larven von anderen Käferstadien auf einer Samenschale getrennt werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Injektionsnadel vorzubereiten, indem die Spitze der Nadel gebrochen, auf einen Nadelhalter gelegt und eine doppelsträngige RNA-Lösung mit der gewünschten Konzentration von vorne in die Nadel geladen wird.Als nächstes autorisieren Sie die isolierten Larven und legen die Larven auf einen klebrigen Objektträger. Der letzte Schritt besteht darin, den Larven unter einem Präpariermikroskop eine doppelsträngige RNA-Lösung zu injizieren. Letztendlich werden RNAi-bezogene Phänotypen im gewünschten Stadium analysiert, um die Funktion des Zielgens zu bestimmen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Neurogenese oder Transgenese, besteht darin, dass nur eine einfache Injektion einer dublettsträngigen RNA-Lösung in die Körperhöhle des Käfers einen effizienten und lang anhaltenden Gen-Knockdown in jedem gewünschten Stadium der Bedo-Entwicklung induzieren kann. Obwohl sich das hier beschriebene Protokoll mit einigen Modifikationen auf Trium-Castin-Larven konzentriert, können die Injektionsverfahren auf andere Stadien von Trium-, Castin- und anderen Insekten angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, eine gute Nadel herzustellen und die richtige Menge an Doppelstrang-RNA-Lösung zu injizieren, ohne die Larven zu töten.Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Injektion von Dubletten-RNA und zur Nadelvorbereitung schwer zu beschreiben sind und nur durch Beobachtung und Übungskultur erlernt werden können. Der Teegussstamm der Wahl, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Leeren Sie eine Kulturflasche der Käfer sofort auf ein Sieb mit der Nummer 25 und sieben Sie aggressiv, um die älteren Larven, Puppen und erwachsenen Tiere zu sammeln.Setzen Sie dann die Käfer zusammen mit den Exus in eine Saatschale um und klopfen Sie sie ab, um ein Entweichen der Käfer zu verhindern. Pusten Sie nun vorsichtig über die Saatschale, um die Ausscheidungen und die Blütenpartikel von der Oberfläche der Käfer zu entfernen. Tippe auf die Saatpfanne, um dich zu setzen.Der Inhalt. Warten Sie, bis die beweglicheren Erwachsenen aus dem Stapel herauskommen, und entfernen Sie sie, um den Winkel der Puppe zu trennen, die Pfanne leicht nach unten gerichtet. Klopfen Sie vorsichtig an, um die Puppe zu rollen und zu entfernen, so dass nur die Larven auf der Saatschale verbleiben.Legen Sie nun die isolierten Larven in eine saubere Petrischale. Wählen Sie das gewünschte Larvenstadium für die Injektion unter einem Mikroskop aus und bewahren Sie sie bis zur Genehmigung in einer Petrischale auf. Kombinieren Sie die restlichen Stadien der Käfer und geben Sie sie zurück in eine Kulturflasche.Befestigen Sie eine gezogene Glasnadel an einem Glasmikroskop. Gleiten Sie unter ein Präpariermikroskop. Lokalisieren Sie die Stelle, an der sich die Spitze biegt.Fassen Sie den Bereich leicht zur Spitzenseite hin und drehen Sie ihn, um ihn zu brechen, um eine optimale Penetration der Nagelhaut der Larve zu gewährleisten, und wählen Sie eine Nadel mit einer abgewinkelten Öffnung von etwa 0,05 Millimetern Durchmesser. Schrauben Sie nun die Spitze des Nadelhalters ab. Stecken Sie das hintere Ende der Nadel in die Halterspitze und die Gummidichtung unter die Halterspitze.Führen Sie dann die Rückseite der Nadel in den Halter ein und achten Sie darauf, dass die Gummidichtung in die Öffnung eingeführt wird. Schrauben Sie die Spitze wieder auf die Halterung. Setzen Sie nun den zusammengebauten Nadelhalter auf den Nadelmanipulator.Stellen Sie die Position so ein, dass die Spitze der Nadel unter dem Sichtfeld des Mikroskops zentriert ist. Bereiten Sie die doppelsträngige RNA-Lösung kurz vor der Injektion vor. Schneiden Sie die Spitze einer 20-Mikroliter-Einwegpipettenspitze ab.Pipettieren Sie nun 10 Mikroliter der Lösung in die getrimmte Pipettenspitze. Entfernen Sie die Pipettenspitze vorsichtig von der Pipette, während Sie die Flüssigkeit an der Spitze halten, indem Sie Gegendruck erzeugen. Legen Sie die Pipettenspitze mit der doppelsträngigen RNA-Lösung auf den Mikroskoptisch.Schauen Sie durch das Mikroskop und bewegen Sie die geladene Spitze langsam in Richtung Nadel, bis sich die Spitze der Nadel gerade in der geladenen Pipettenspitze und in der Lösung befindet. Ziehen Sie dann den Kolben der Injektionsspritze vorsichtig zurück, um die Lösung langsam in die Nadel zu ziehen, ohne die Nadel zu überlasten. Wenn sich das Ende der DS-RNA-Lösung der Nadelspitze nähert, verlangsamen Sie die Zuggeschwindigkeit und stoppen Sie das Laden der Lösung, bevor die Spitze der Nadel die Luft erreicht, um eine schnelle Aufnahme in den Nadelhalter zu vermeiden.Öffnen Sie den Absperrhahn, um den Druck von der Injektionsspritze und dem Nadelhalter zu nehmen. Bewegen Sie dann die Pipettenspitze von der Nadelspitze weg. Heben Sie nun die Nadel auf dem Tisch an und entfernen Sie die entleerte Pipettenspitze vom Mikroskoptisch.Legen Sie die Larven in den e-Autorisierungskorb, legen Sie den Korb in die Ätherflasche und schließen Sie den Deckel. Überprüfen Sie nach drei Minuten die Larven auf Bewegung. Wenn sie sich noch bewegen, lege sie für weitere 30 Sekunden zurück in die Ätherflasche.Übertragen Sie die E-zugelassenen Larven aus dem Korb auf den antihaftbeschichteten Rand eines klebrigen Objektträgers. Übertragen Sie die Larven nacheinander auf den Objektträger. Legen Sie jedes Stück seitlich hin.Klopfen Sie mit einer Pinzette vorsichtig vom Kopf bis zum Schwanz auf den Körper und dehnen Sie ihn leicht, um die Larven auf dem Objektträger zu sichern. Positionieren Sie nun den vorbereiteten Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Führen Sie die doppelsträngige RNA-beladene Nadel vorsichtig in die dorsale Seite der Larven ein und bewegen Sie die Larven mit dem Tisch zur Nadel.Ziehen Sie dann die Nadel für die DS-RNA leicht zurück. Um in die Körperhöhle der Larve einzudringen, drücken Sie vorsichtig auf die Injektionsspritze, bis die Larven grün werden und gestreckt und voll aussehen. Entfernen Sie anschließend die Nadel von den Larven, während Sie die Injektionsspritze leicht zurückziehen.Injizieren Sie alle Larven auf den Objektträger. Achten Sie darauf, Larven zu entfernen, die nicht erfolgreich injiziert wurden. Die injizierten Larven sind beiseite zu legen, bis sich alle Larven von der E-Zulassung erholt haben.Heben Sie nun die Larven vorsichtig vom Kopf bis zum Schwanz an, geben Sie sie in eine saubere Petrischale und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten einwirken, damit die Injektionswunde gerinnen kann. Dann kultiviert man die injizierten Larven bei 30 Grad Celsius und 70% Luftfeuchtigkeit. Beobachten Sie die Larven regelmäßig auf RNAI-Phänotypen.Diese Beispiele zeigen unterschiedliche Erfolgsniveaus von Injektionen mit grüner doppelsträngiger RNA-Lösung in die letzte Larve im Stadium mit einer richtig dimensionierten Injektionsnadel. Die Nadelspitze dringt mit minimalem Widerstand in die Kutikula der Larve ein, und die grüne DS-RNA-Lösung fließt ohne Austritt in die Larven. Im PU 11-Stamm kann das verstärkte gelb fluoreszierende Protein als gute Positivkontrolle für doppelsträngige RNA-Injektionsexperimente dienen.Bei der Injektion von EYFP DS RNA im letzten Larvenstadium kann bereits einen Tag nach der Injektion eine signifikante Verringerung des EYFP-Signals im zukünftigen Flügelprimordial beobachtet werden. Der Knockdown der EYFP-Expression ist in der Regel zwei Tage nach der Injektion beobachtbar, und wenn die DS-RNA-Konzentration hoch genug ist, bleibt sie während des Pupillenstadiums und während des gesamten Lebens des Käfers bestehen. Da es sich bei EYFP um eine nicht-endogene Gensequenz handelt, kann dieses Gen auch als Negativkontrolle verwendet werden, die keine morphologischen oder physiologischen Störungen verursachen sollte.In diesem Experiment wurde die doppelsträngige RNA für vestigial, ein kritisches Flügelgen, in Larven im vorletzten Stadium injiziert. Es ist zu beachten, dass im Pupillenstadium ein vollständiger Verlust der Flügelstrukturen zu beobachten ist. Dem daraus resultierenden Erwachsenen fehlen auch die Flügelstrukturen vollständig.Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Andere Methoden, wie z.B. quantitative real-time PCR, in situ Hybridisierung oder Immunhistochemie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. welche Gene nach seiner Entwicklung durch das Zielgen reguliert werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, Funktionsverlustanalysen und postembryonale Stadien in Traum casten durchzuführen, ohne komplexe genetische Techniken zu verwenden.Die Einfachheit dieser Methode macht sie auch sehr gut für den Unterricht geeignet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das geeignete Stadium der Liebe zur Injektion auswählen, wie Sie eine Injektionsnadel herstellen und die zulässige Injektion von Doppelstandard-RNA erfolgreich durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, die Funktion des Gens bis zur RNI-Ebene in Trium zu bewerten.

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße...

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Dieses Video beschreibt die Prinzipien hinter der RNAi-Behandlung in C. elegans und demonstriert ein Protokoll zum Knockdown von lin-35 in einem transgenen Wurmstamm.

RNAi-Plating für die Fütterung von C. elegans: Eine Technik zur Induktion der Ziel-dsRNA-Expression in E. coli

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

RNA-Interferenz ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in bestimmten Entwicklungsstadien. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Umsetzung dieser Technik im Wassertauchkäfer Thermonectus marmoratus, vom Erwerb von Gensequenzen bis zum Knockdown von Genen, die Struktur oder Verhalten beeinflussen.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

Wir liefern ein detailliertes Protokoll für elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzen bei Insekten der Ordnung Odonata (Libellen und Damselflies) mit dem Blauschwanz-Dammselbst (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) und der pied Skimmer Libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata

Hier stellen wir ein Protokoll zur Gewinnung entomopathogener Pilze aus einem Waldholzzünsler vor und eine substituierende Methode zur Bewertung ihrer entomopathogenen Aktivitäten anhand eines Coleoptera-Modellinsekts. Diese Methode ist effizient und praktisch, um entomopathogene Pilzressourcen von holzbohrenden Schadinsekten in natürlichen Wäldern zu erforschen.

Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .

RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT...

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Lernen Sie die Larven-RNAi-Technik zur effizienten Gen-Knockdown in Tribolium castaneum. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genstudien in der Entwicklungsbiologie und Insektenphysiologie.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum

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