Die histologische Färbung von Nervengewebe

Histological Staining of Neural Tissue

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Histological Staining of Neural Tissue

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08:55 min

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April 30, 2023

Overview

Um die zelluläre, strukturelle und molekulare Anordnung der Gewebe und Organe zu untersuchen, verwenden Forscher ein Verfahren bekannt als die histologische Färbung. Bei dieser Technik wird ein Gewebe von Interesse mit einem chemischen Fixiermittel konserviert und aufgeteilt oder in sehr dünne Schnitte geschnitten. Danach wird eine Vielzahl von Färbetechniken angewendet, um einen Kontrast zu den optisch gleichmäßigen Schnitten zu erhalten. In der Studie der Neuroanatomie werden histologische Techniken häufig angewendet, um das Gewebe des Nervensystems zu visualisieren und zu studieren.

Dieses Video konzentriert sich auf die histologischen Färbetechniken für das Nervengewebe. Eine Übersicht über die häufigen Färbungen des Gehirns wird bereitgestellt, einschließlich solcher, die speziell neuronale Zellkörper markieren, wie die Nissl-Färbung und solche, die selektiv myelinisierte Axone markieren, wie die Fast Blue Färbung. Immunhistologische Techniken, die den Vorteil der spezifischen Wechselwirkungen zwischen Antikörper und einzigartigen zellulären Proteine nutzen werden ebenfalls diskutiert. Als nächstes wird die Vorbereitung von Gehirnproben zum Färben beschrieben, einschließlich der Grundschritte für die Fixierung, der Einbettung, das Schneiden und die Rehydratisierung des Gewebes. Dieser Überblick bietet auch ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die immunhistologische Färbung, gefolgt von der Nissl-Färbung, zusätzlich werden praktische Anwendungen dieser Techniken besprochen.

Procedure

Die Schnitte oder Querschnitte von Gehirngewebe sind ein reichhaltiges Material für die Untersuchung der Struktur und Funktion des Gehirns. Jedoch ist unbehandeltes Gehirn ein optisch einheitliches Gewebe, wie eine leere Leinwand. Die Färbung ist eine Möglichkeit, das Gehirn “anzumalen”, um die zellulären, strukturellen und molekularen Komponenten des Organs deutlich sichtbar zu machen. Während die meisten Färbungen gemeinsame histologische Methoden teilen, hat jede Methode ein einzigartiges morphologisches Ziel. Dieses Video liefert einen Überblick über die allgemeinen Prinzipien der Histologie des Gehirns, zeigt ein paar gebräuchliche Färbetechniken und bespricht einige Anwendungen dieser Methoden in den heutigen neurowissenschaftlichen Laboren.

Bevor wir besprechen wie neurologische Färbeverfahren durchgeführt werden, wollen wir die Ziele dieser Techniken überblicken.

Die histologischen Färbungen werden üblicherweise verwendet um einen Kontrast zu liefern, wodurch aufschlussreiche Besonderheiten, die in ungefärbtem Gewebe nicht unterschieden werden können, gefunden werden. Zum Beispiel um den Zellkörper von Nervenzellen oder Somata sichtbar zu machen, die die graue Substanz des Nervensystems bilden, sind mehrere Färbungen vorhanden. Die Farbstoffe, die bei der Nissl-Färbung verwendet werden, binden an die Nukleinsäuren, Färben das Somata lila und geben Aufschluss auf die neuronale Organisation.

Alternativ zum Betrachten der weißen Substanz kann man die Myelin – die Fettsäurehülle umgibt die Axone – mit Farbstoffen wie z.B. Luxol Fast Blue färben. Alternativ können immunhistochemische Färbungen molekulare Ziele bei bestimmten Zelltypen markieren. Diese Technik nutzt die Vorteile der Spezifität von Antikörpern und den molekularen Zielen, die als Antigene bekannt sind. Die Verwendung von Antikörpern, die mit Enzymen oder fluoreszierenden Verbindungen fusioniert sind, ermöglicht Forschern ihre Bindungsstellen zu visualisieren mit der Verwendung enzymatischer Reaktionen oder Fluoreszenz.

Da wir nun das Konzept der Färbung von Schnitten eingeführt haben, wollen wir uns die allgemeinen histologischen Schritte, die bei der Gehirngewebefärbung vorausgehen, anschauen und sicherstellen, dass optimale Bedingungen für die Visualisierung vorhanden sind.

Um die Gewebestruktur zu bewahren wird das Gehirn zuerst durchschwemmt – das bedeutet, das das Blut aus dem Gehirn abgeflossen wird und das Gefäßsystem des Tieres verwendet wird, um ein chemisches Fixiermittel zuzuführen. Nach dem Sezieren ist das Gehirn vollständig in Fixiermittel getaucht, um den Konservierungsprozess abzuschließen.

Als nächstes wird die Probe in ein Medium mit ähnlichen mechanischen Eigenschaften wie die des Gehirngewebes eingebettet, wie z.B. Paraffinwachs. Nach der Einbettung wird das Gehirn mit einem Gerät, bekannt als Mikrotom, dünn geschnitten. Die Schnitte werden dann auf Objektträger aufgebracht und trocknen gelassen.

Da die meisten Farbstoffe auf Wasserbasis sind, muss das Gewebe entwachst und rehydriert werden bevor man die Färbung beginnen kann. Um dies zu erreichen, werden die Objektträger in Xylol gewaschen, um das Wachs aufzulösen bevor eine schrittweise Rehydratisierung mit einer Reihe von zunehmend verdünntem Ethanol durchgeführt wird. Dieser Prozess sollte in einem Abzug beim Tragen der persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden.

Nachdem vorbereiten des Gehirngewebes, sind wir nun bereit das Färbungsverfahren zu beginnen.

Der erste Schritt, als Blockierung bekannt, reduziert die Hintergrundfärbung, die durch unspezifische Antikörper-Bindung verursacht wird. Das Freilegen der Schnitte zum Serum wird durch das Zuführen von nicht-markierten Antikörpern die an unspezifische Bindungsstellen binden erreicht. Nach einer 30-minütigen bis zu einer über Nacht Blockierung ist das Gewebe bereit für die Inkubation mit dem primären Antikörper, der an spezifische molekulare Zielregionen bindet.

Die Antikörper werden in der Regel in einer Blockierungslösung, die Detergenzien enthalten, verdünnt, die die Zellmembran zerstören und ermöglichen, dass die Antikörper das Zytoplasma durchdringen können.

Nach einer Inkubation über Nacht werden die überschüssigen Primärantikörper durch kurzes Waschen in einem Puffer entfernt. Als nächstes werden die Sekundärantikörper, die mit Enzyme oder Fluorophore konjugiert sind, zugeführt, um spezifisch die primären Antikörper zu markieren. Einige Stunden später werden die überschüssigen Antikörper mit mehreren Pufferwechseln entfernt.

Da nun die Zielregion markiert wurde, wollen wir darüber reden, wie man sie nachweisen kann. Für enzym-konjugierte Sekundärantikörper wird dies durch die Einführung eines chromogenen Substrats erreicht. Wenn das Substrat mit dem Enzym in Interaktion tritt erfolgt eine Farbänderung, daher der Begriff “Chromogen”. Sobald die gewünschte Färbung erreicht ist, in der Regel nach ca. 2 Minuten, wird die Reaktion durch schnelles Eintauchen der Schnitte in Wasser gestoppt.

Nach der Antikörperfärbung kann ein zweiter Schritt immer noch erforderlich sein, um einige neuroanatomische Zusammenhänge der Ergebnisse bereitzustellen. Zum Beispiel kann man die Nissl-Färbung wählen um den Teilkontrast zu verbessern. Dieses Verfahren beruht auf basische Farbstoffe wie Kresylviolett, die mit Nukleinsäuren interagieren.

Der erste Schritt ist die Filterung der Farbstofflösung, um ungelöste Kristalle zu entfernen. Die Objektträger werden dann im Farbstoff inkubiert bis der gewünschte Kontrast erreicht wird. Danach werden die Schnitte mit mehreren Wasserwechseln gewaschen um die Färbung zu stoppen.

Die Objektträger werden danach in einer Alkoholreihe eingetaucht um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und um die Schnitte zu dehydratisieren. Nach der Dehydratisierung werden die Schnitte mit Xylol gereinigt, das den Alkohol entfernt und das Abbilden verbessert, da es Lichtbeugungseigenschaften ähnlich denen des Gewebes hat.

Um die gefärbten Schnitte für eine spätere Analyse zu konservieren, werden sie mit einem Deckglas mit einem permanenten Eindeckmittel versehen und über Nacht getrocknet.

Da wir nun die Verfahren und Ziele der Färbung behandelt haben, wollen wir uns einige Anwendungen ansehen.

Die histologische Färbung wird erst einmal routinemäßig verwendet, um einzelne Neuronen zu visualisieren. Im Gegenzug wird die Visualisierung für Techniken wie die Laser-Mikrodissektion benötigt, wobei die Forscher einen Laser verwenden, um spezifische Zellen zu isolieren, die auf einer dünnen Schicht gewachsen sind. Das genetische Material kann von den gefärbten und sezierten Zellen extrahiert werden, so dass die Forscher neuronen-spezifische Genexpression untersuchen können.

Die Färbung kann auch verwendet werden, um morphologische Merkmale der einzelnen Neuronen zu charakterisieren. In diesem Experiment wird die Immunhistochemie bei Zellen, die GFP exprimieren durchgeführt, um synapsenbildende Dendriten zu visualisieren. Die Färbung wird zwischen normalen und aktivierten Zellen verglichen, die Aufdeckt, dass Dendriten mehrfache Veränderungen als Reaktion auf auslösende Reize eingehen.

Schließlich kann dank der Spezifität der IHC, die Expression von individuellen Proteinen verwendet werden, um den Ort und die Identität von einzigartigen Zellpopulationen im Nervensystem zu identifizieren. Zum Beispiel zeigt die Färbung der Maus Cerebellum mit Zebrin 2 Antikörpern die Position von spezialisierten Neuronen bekannt als Purkinjezellen.

Das war die JoVE Einführung zur gezielter Färbung von Gehirnschnitten. In diesem Video haben wir die allgemeinen Methoden und die Ziele der Färbung gezeigt, zusätzlich zu spezifischen Verfahren für die IHC und die Nissl-Färbung. Danke für das Aufpassen!

Transcript

Slices, or sections, of brain tissue are a rich material for studying the structure and function of the brain. However, untreated brain is a visually uniform tissue, like a blank canvas. Staining is a way of “painting” the brain to clearly visualize the cellular, structural, and molecular components of the organ. While most stains share common histological methods, each approach has a unique morphological target. This video will provide an outline of the general principles of brain histology, demonstrate some common staining techniques, and review a few applications of these methods in neuroscience labs today.

Before discussing how neurological staining procedures are carried out, lets review the goals of these techniques.

Histological stains are commonly used to provide contrast, thereby revealing features that cannot be distinguished in unstained tissue. For instance, to visualize the neuron cell bodies, or somata, that make up the gray matter of the nervous system, multiple stains are available. The dyes used in Nissl stains attach to nucleic acids, coloring the somata purple and revealing neuronal organization.

Alternatively, to look at white matter, you can stain myelin – the fatty acid sheath surrounding axons – with dyes like Luxol Fast Blue. Alternatively, immunohistochemical staining can highlight molecular targets found on specific cell types. This technique takes advantage of the specificity between antibodies and molecular targets known as antigens. The use of antibodies fused to enzymes or fluorescent compounds allows researchers to visualize their binding sites using enzymatic reactions or fluorescence.

Now that you’ve been introduced to the idea of staining sections, lets look at the common histological steps that precede brain tissue staining and ensure optimal conditions for visualization.

To preserve tissue structure, the brain is first perfused – meaning the blood is drained from the brain and the animal’s vasculature is used to deliver a chemical fixative. After dissection, the brain is fully immersed in fixative to complete the preservation process.

Next, the specimen is embedded in a medium with similar mechanical properties to brain tissue, like paraffin wax. After embedding, the brain is thinly sectioned using an instrument known as a microtome. The slices are then mounted on slides and allowed to dry.

Since most dyes are water-based, the tissue needs to be dewaxed and rehydrated before staining can begin. To accomplish this, the slides are rinsed in xylene to dissolve the wax prior to gradual rehydration through a series of increasingly diluted ethanol. This process should be carried out in a fume hood while wearing the appropriate personal protective equipment.

Having prepared your brain tissue, you are now ready to begin the staining procedure.

The first step, known as blocking, reduces background staining caused by nonspecific antibody binding. Exposing the section to serum accomplishes this by introducing unlabeled antibodies that bind to non-target sites. After a 30-minute to overnight block, the tissue is ready for incubation with primary antibody, which binds to specific molecular targets.

Antibodies are usually diluted in a blocking solution containing detergent, which disrupts cell membranes and allows antibodies to enter the cytoplasm.

After an overnight incubation, excess primary antibodies are removed by brief washes in buffer. Next, the secondary antibodies, conjugated to enzymes or fluorophores, are introduced to specifically label the primary antibodies. Several hours later, excess antibodies are removed with multiple changes of buffer.

Now that the targets have been labeled, let’s talk about how to detect them. For enzyme-conjugated secondaries, this is accomplished by introduction of a chromogenic substrate. When the substrate interacts with the enzyme, a color change occurs, hence the term “chromogenic”. Once the desired staining is achieved, typically after about 2 minutes, the reaction is stopped by quickly immersing the sections in water.

After antibody staining, a second step may still be required to provide some neuroanatomical context to the results. For example, you may choose to enhance tissue contrast using a Nissl stain. This procedure relies upon on basic dyes like Cresyl violet, which interact with nucleic acids.

The first step is to filter the dye solution to remove undissolved crystals. The slides are then incubated in stain until the desired contrast is achieved. Then, wash the sections in multiple changes of water to stop the staining.

The slides are then immersed in a series of alcohol to clear excess stain and dehydrate the slices. After dehydration, the slices are cleared with xylene, which removes the alcohol, and improves imaging since it has light diffraction properties similar to those of the tissue.

To preserve the stained sections for later analysis, coverslip with a permanent mounting medium and let dry overnight.

Now that we have outlined the procedures and goals of staining lets look at some applications.

First off, histological staining is routinely used to visualize individual neurons. In turn, visualization is required for techniques like laser capture microdissection, in which researchers use a laser to isolate specific cells grown on a thin film. Genetic material can be extracted from the stained and dissected cells, allowing researchers to investigate neuron-specific gene expression.

Staining may also be employed to characterize morphological features of individual neurons. In this experiment, immunohistochemistry is performed on cells expressing GFP to visualize synapse-forming dendrites. Staining is compared between normal and activated cells, revealing that dendrites undergo multiple changes in response to activating stimuli.

Finally, thanks to the specificity of IHC, the expression of individual proteins can be used to identify the location and identity of unique cell populations in the nervous system. For example, staining of the mouse cerebellum with zebrin 2 antibodies reveals the location of specialized neurons known as Purkinje cells.

You’ve just watched JoVE’s introduction to targeted staining of brain slices. In this video we have demonstrated the general methods and goals of staining, in addition to specific procedures for IHC and Nissl staining.

Thanks for watching!

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