Die histologische Färbung von Nervengewebe

Die Schnitte oder Querschnitte von Gehirngewebe sind ein reichhaltiges Material für die Untersuchung der Struktur und Funktion des Gehirns. Jedoch ist unbehandeltes Gehirn ein optisch einheitliches Gewebe, wie eine leere Leinwand. Die Färbung ist eine Möglichkeit, das Gehirn "anzumalen", um die zellulären, strukturellen und molekularen Komponenten des Organs deutlich sichtbar zu machen. Während die meisten Färbungen gemeinsame histologische Methoden teilen, hat jede Methode ein einzigartiges morphologisches Ziel. Dieses Video liefert einen Überblick über die allgemeinen Prinzipien der Histologie des Gehirns, zeigt ein paar gebräuchliche Färbetechniken und bespricht einige Anwendungen dieser Methoden in den heutigen neurowissenschaftlichen Laboren.

Bevor wir besprechen wie neurologische Färbeverfahren durchgeführt werden, wollen wir die Ziele dieser Techniken überblicken.

Die histologischen Färbungen werden üblicherweise verwendet um einen Kontrast zu liefern, wodurch aufschlussreiche Besonderheiten, die in ungefärbtem Gewebe nicht unterschieden werden können, gefunden werden. Zum Beispiel um den Zellkörper von Nervenzellen oder Somata sichtbar zu machen, die die graue Substanz des Nervensystems bilden, sind mehrere Färbungen vorhanden. Die Farbstoffe, die bei der Nissl-Färbung verwendet werden, binden an die Nukleinsäuren, Färben das Somata lila und geben Aufschluss auf die neuronale Organisation.

Alternativ zum Betrachten der weißen Substanz kann man die Myelin - die Fettsäurehülle umgibt die Axone - mit Farbstoffen wie z.B. Luxol Fast Blue färben. Alternativ können immunhistochemische Färbungen molekulare Ziele bei bestimmten Zelltypen markieren. Diese Technik nutzt die Vorteile der Spezifität von Antikörpern und den molekularen Zielen, die als Antigene bekannt sind. Die Verwendung von Antikörpern, die mit Enzymen oder fluoreszierenden Verbindungen fusioniert sind, ermöglicht Forschern ihre Bindungsstellen zu visualisieren mit der Verwendung enzymatischer Reaktionen oder Fluoreszenz.

Da wir nun das Konzept der Färbung von Schnitten eingeführt haben, wollen wir uns die allgemeinen histologischen Schritte, die bei der Gehirngewebefärbung vorausgehen, anschauen und sicherstellen, dass optimale Bedingungen für die Visualisierung vorhanden sind.

Um die Gewebestruktur zu bewahren wird das Gehirn zuerst durchschwemmt - das bedeutet, das das Blut aus dem Gehirn abgeflossen wird und das Gefäßsystem des Tieres verwendet wird, um ein chemisches Fixiermittel zuzuführen. Nach dem Sezieren ist das Gehirn vollständig in Fixiermittel getaucht, um den Konservierungsprozess abzuschließen.

Als nächstes wird die Probe in ein Medium mit ähnlichen mechanischen Eigenschaften wie die des Gehirngewebes eingebettet, wie z.B. Paraffinwachs. Nach der Einbettung wird das Gehirn mit einem Gerät, bekannt als Mikrotom, dünn geschnitten. Die Schnitte werden dann auf Objektträger aufgebracht und trocknen gelassen.

Da die meisten Farbstoffe auf Wasserbasis sind, muss das Gewebe entwachst und rehydriert werden bevor man die Färbung beginnen kann. Um dies zu erreichen, werden die Objektträger in Xylol gewaschen, um das Wachs aufzulösen bevor eine schrittweise Rehydratisierung mit einer Reihe von zunehmend verdünntem Ethanol durchgeführt wird. Dieser Prozess sollte in einem Abzug beim Tragen der persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden.

Nachdem vorbereiten des Gehirngewebes, sind wir nun bereit das Färbungsverfahren zu beginnen.

Der erste Schritt, als Blockierung bekannt, reduziert die Hintergrundfärbung, die durch unspezifische Antikörper-Bindung verursacht wird. Das Freilegen der Schnitte zum Serum wird durch das Zuführen von nicht-markierten Antikörpern die an unspezifische Bindungsstellen binden erreicht. Nach einer 30-minütigen bis zu einer über Nacht Blockierung ist das Gewebe bereit für die Inkubation mit dem primären Antikörper, der an spezifische molekulare Zielregionen bindet.

Die Antikörper werden in der Regel in einer Blockierungslösung, die Detergenzien enthalten, verdünnt, die die Zellmembran zerstören und ermöglichen, dass die Antikörper das Zytoplasma durchdringen können.

Nach einer Inkubation über Nacht werden die überschüssigen Primärantikörper durch kurzes Waschen in einem Puffer entfernt. Als nächstes werden die Sekundärantikörper, die mit Enzyme oder Fluorophore konjugiert sind, zugeführt, um spezifisch die primären Antikörper zu markieren. Einige Stunden später werden die überschüssigen Antikörper mit mehreren Pufferwechseln entfernt.

Da nun die Zielregion markiert wurde, wollen wir darüber reden, wie man sie nachweisen kann. Für enzym-konjugierte Sekundärantikörper wird dies durch die Einführung eines chromogenen Substrats erreicht. Wenn das Substrat mit dem Enzym in Interaktion tritt erfolgt eine Farbänderung, daher der Begriff "Chromogen". Sobald die gewünschte Färbung erreicht ist, in der Regel nach ca. 2 Minuten, wird die Reaktion durch schnelles Eintauchen der Schnitte in Wasser gestoppt.

Nach der Antikörperfärbung kann ein zweiter Schritt immer noch erforderlich sein, um einige neuroanatomische Zusammenhänge der Ergebnisse bereitzustellen. Zum Beispiel kann man die Nissl-Färbung wählen um den Teilkontrast zu verbessern. Dieses Verfahren beruht auf basische Farbstoffe wie Kresylviolett, die mit Nukleinsäuren interagieren.

Der erste Schritt ist die Filterung der Farbstofflösung, um ungelöste Kristalle zu entfernen. Die Objektträger werden dann im Farbstoff inkubiert bis der gewünschte Kontrast erreicht wird. Danach werden die Schnitte mit mehreren Wasserwechseln gewaschen um die Färbung zu stoppen.

Die Objektträger werden danach in einer Alkoholreihe eingetaucht um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und um die Schnitte zu dehydratisieren. Nach der Dehydratisierung werden die Schnitte mit Xylol gereinigt, das den Alkohol entfernt und das Abbilden verbessert, da es Lichtbeugungseigenschaften ähnlich denen des Gewebes hat.

Um die gefärbten Schnitte für eine spätere Analyse zu konservieren, werden sie mit einem Deckglas mit einem permanenten Eindeckmittel versehen und über Nacht getrocknet.

Da wir nun die Verfahren und Ziele der Färbung behandelt haben, wollen wir uns einige Anwendungen ansehen.

Die histologische Färbung wird erst einmal routinemäßig verwendet, um einzelne Neuronen zu visualisieren. Im Gegenzug wird die Visualisierung für Techniken wie die Laser-Mikrodissektion benötigt, wobei die Forscher einen Laser verwenden, um spezifische Zellen zu isolieren, die auf einer dünnen Schicht gewachsen sind. Das genetische Material kann von den gefärbten und sezierten Zellen extrahiert werden, so dass die Forscher neuronen-spezifische Genexpression untersuchen können.

Die Färbung kann auch verwendet werden, um morphologische Merkmale der einzelnen Neuronen zu charakterisieren. In diesem Experiment wird die Immunhistochemie bei Zellen, die GFP exprimieren durchgeführt, um synapsenbildende Dendriten zu visualisieren. Die Färbung wird zwischen normalen und aktivierten Zellen verglichen, die Aufdeckt, dass Dendriten mehrfache Veränderungen als Reaktion auf auslösende Reize eingehen.

Schließlich kann dank der Spezifität der IHC, die Expression von individuellen Proteinen verwendet werden, um den Ort und die Identität von einzigartigen Zellpopulationen im Nervensystem zu identifizieren. Zum Beispiel zeigt die Färbung der Maus Cerebellum mit Zebrin 2 Antikörpern die Position von spezialisierten Neuronen bekannt als Purkinjezellen.

Das war die JoVE Einführung zur gezielter Färbung von Gehirnschnitten. In diesem Video haben wir die allgemeinen Methoden und die Ziele der Färbung gezeigt, zusätzlich zu spezifischen Verfahren für die IHC und die Nissl-Färbung. Danke für das Aufpassen!