Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in Xenopus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die oralen Gesichtsphänotypen von xap Levis-Embryonen quantitativ statistisch zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst abgelöste xip-Embryoköpfe in eine Tonform montiert werden, um die Bilder zu fotografieren. Die Gesichtsmaße werden gemessen, um Aufschluss über die Größe der oralen Gesichtsregion zu geben.

Die nächsten Orientierungspunkte werden mittels geometrischer Morphometrie angewendet, um die Form der oralen Gesichtsregion zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigen signifikante Größen- und Formveränderungen in der oralen Gesichtsregion des Opus, basierend auf statistischen Analysen der Gesichtsabmessungen und der relativen Orientierungsposition. Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung des Opus oder des Gesichts geben kann, kann sie auch auf andere morphologische Studien von Wirbeltieren angewendet werden, z. B. auf Vergleiche eng verwandter Arten zu evolutionären oder ökologischen Zwecken.

In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie man Tonschalen herstellt, um Embryonenköpfe für ihre Fotodokumentation zu halten. Zuerst etwas Modelliermasse zu einer Schüssel in beliebiger Größe flach drücken und glatt streichen, um den gesamten Teller zu bedecken. Drücken Sie dann eine gerade Nadel in einem 45-Grad-Winkel leicht in die Tonerde.

Halten Sie die Nadel fest und bewegen Sie die Schale langsam, um eine eingedrückte Linie zu erzeugen. Als nächstes machst du mit einer Glaspipette flache kreisförmige Vertiefungen entlang jeder Linie. In jeder Vertiefung kann ein Embryokopf vor dem Laden platziert werden.

Die Köpfe füllten die Schale mit PBT. Details zur Kultivierung von Zap-Pisse sind im Textprotokoll beschrieben, ebenso wie Details zur Fixierung von Embryonen. Für dieses Protokoll werden die Embryonen zwischen den Stadien 42 und 45 fixiert.

Legen Sie zunächst die fixierten Embryonen in eine 150 Millimeter große Petrischale, die etwa 100 Milliliter PBT enthält. Und jetzt trennt ihnen die Köpfe ab. Halten Sie zuerst einen Embryo mit einer Pinzette und verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt auf der hinteren Seite des Darms zu machen.

Zweitens, machen Sie einen Schnitt auf der vorderen Seite des Darms in der Nähe des Herzens, um den Kopf vollständig zu entfernen. Übertragen Sie die Köpfe mit einer Pipette in die Tonschale. Es ist wichtig, dass die Embryoköpfe für die Fotografie in genau der gleichen Ausrichtung in den Ton gelegt werden.

Um den Erfolg zu gewährleisten, verwenden Sie die in den Ton gezeichneten Reihen als Anleitung. Es ist auch von Vorteil, wenn dieselbe Person alle Bilder am selben Tag aufnimmt. Für die Frontalansicht positionieren die Fotografien die Köpfe mit der hinteren Seite nach unten in den Vertiefungen.

Benutze eine Pinzette, um die Köpfe und den umgebenden Ton so zu manipulieren, dass die Köpfe mit Blick auf die Kamera fixiert und nicht für die seitliche Ansicht gekippt sind. Auf Fotos werden die Köpfe so positioniert, dass ihre Seiten alle in die gleiche Richtung zeigen. Manipuliere die Köpfe und den umgebenden Ton, so dass die Zementdrüsen alle im gleichen Winkel nach unten zeigen.

Sammeln Sie jetzt mit einem beliebigen Seziermikroskop mit Bildaufnahmefunktionen Bilder der Kaulquappenköpfe. Verwenden Sie mehrere Lichter, um übermäßige Schattenbildung zu vermeiden, und verwenden Sie die höchstmögliche Vergrößerung. Fotografieren Sie jeden Kopf auf die gleiche Weise.

Speichern Sie die Bilder anschließend unkomprimiert und in der höchstmöglichen Auflösung. Messen Sie anhand der Bilder die oralen Gesichtsmaße. Bestimmen Sie zunächst die Zahnbreite.

Identifizieren Sie die Punkte, an denen der ventrale Teil jedes Auges auf die Peripherien des Gesichts trifft, und messen Sie den Abstand zwischen diesen Punkten. Details zur Messung der Gesichtshöhe und des oralen Gesichtsbereichs finden Sie im Textprotokoll. Achten Sie besonders auf die Bestimmung der Schnauzenlänge: Machen Sie auf seitlichen Bildern eine vertikale Linie, die den vorderen Teil des Auges markiert.

Messen Sie dann den horizontalen Abstand vom vordersten Punkt, an dem das Gesicht auf die dorsale Kante der Zementdrüse trifft, bis zur vertikalen Linie, die den vorderen Teil des Auges markiert. Andere Dimensionen wie Mundweite und Rundheit werden im Textprotokoll für diese Analyse erläutert, die Koordinaten der Gesichtsmarkierungen sollten standardisiert und in einer Datei gespeichert werden. Die Orientierungspunkte sollten die Form des Bildes erfassen und in allen Bildern verwendbar sein.

Verwenden Sie daher keine Strukturen, die möglicherweise nicht in allen Stichproben vorhanden sind. Öffnen Sie nun die erste Bilddatei. Um zu bewerten, wählen Sie die Registerkarte "Plugins" in der Hauptsymbolleiste und wählen Sie "Punktauswahl".

Wählen Sie im Dropdown-Menü die Registerkarte Punkte hinzufügen aus und positionieren Sie die Orientierungspunkte auf dem Bild. Sie werden mehrfarbig angezeigt. Kreuze wechseln zwischen Orientierungspunkten mit dem Werkzeug Kreuze verschieben.

Sobald alle platziert sind, wählen Sie die Registerkarte Anzeigeergebnisse in der Hauptsymbolleiste und wählen Sie die Option Anzeigen. Daraufhin werden die Koordinaten des Orientierungspunkts angezeigt. Kopieren Sie als Nächstes die Koordinaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm in einer leeren Zeile über dem eingefügten Datentyp LM equals, gefolgt von der Anzahl der Orientierungspunkte im Beispiel in der Zeile darunter.

Die eingefügte Datentyp-ID ist gleich, gefolgt von dem Namen, der die Stichprobe identifiziert. Jede Probe muss über eine eindeutige Kennung verfügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Beispielbilder zugeordnet und in die Tabelle eingegeben wurden.

Kopieren Sie als Nächstes die Spalten mit einer Beispielidentifikation und den Koordinaten jedes Orientierungspunkts und speichern Sie sie in einem Textdokument. Öffnen Sie dann das morphometrische Softwareprogramm. Wählen Sie in dieser Software im Hauptmenü die Option Neuen Datensatz erstellen.

Benennen Sie die Datei und den Datensatz im Popup-Fenster und importieren Sie die Datei als TPS. Wählen Sie nun eine Textdatei mit Koordinaten aus, um den Datensatz zu erstellen. Führen Sie als Nächstes eine Prokrustes-Anpassung und -Ausrichtung durch.

Markieren Sie zunächst den Datensatz auf der Registerkarte Projektbaum. Wählen Sie dann in der Hauptsymbolleiste Vorabe und neue Prokrusten passen aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie aus der verfügbaren Auswahl die Option Ausgerichtet nach Hauptachse aus.

Wählen Sie dann im Dropdown-Menü "Voraben" die Option zum Zurücksetzen von Crusty aus, wählen Sie "Covance-Matrix generieren" und dann "Ausführen" aus. Zeigen Sie nun auf der Registerkarte "Ergebnisse" die Korrelationen der Covance-Matrix an. Um Proben von Versuchs- und Kontrollgruppen zu unterscheiden, erstellen Sie eine Klassifikatordatei, indem Sie jede Stichprobe im Datensatz der entsprechenden Klassifikatorvariablen zuweisen.

Erstellen Sie in einer Tabelle eine Spalte mit der Bezeichnung ID und erstellen Sie eine Spalte mit der Bezeichnung Behandlung. Listen Sie dann jedes Beispiel in der Spalte ID auf und weisen Sie es einer Gruppe zu. Speichern Sie diese in der Spalte "Behandlung" als Textdatei und importieren Sie sie im morphometrischen Softwareprogramm über die Option "Übereinstimmung nach Kennung auswählen".

Erstellen Sie nun auf der Registerkarte "Vergleich" im Popup-Menü eine Transformation für die Analyse der Diskriminanzfunktion. Stellen Sie unter dieser Funktion sicher, dass der entsprechende Datensatz ausgewählt ist und der Datentyp die Prokrustes-Fit-Koordinaten ist. Markieren Sie die zu vergleichenden Gruppenpaare, und führen Sie dann einen 1000-Permutationstest durch.

Um die Vektorkarte der Koordinaten anzuzeigen, gehen Sie zum Grafikmenü und wählen Sie die Registerkarte Formunterschied. Wenn das Bild invertiert ist, rufen Sie das Einblendmenü im Plotbereich auf, um das Diagramm in die richtige Ausrichtung zu drehen. Ändern Sie außerdem im Popup-Menü das Diagramm in ein Transformationsgitter, um die Vektoren mit den Details zum Erstellen einer Hauptkomponentenanalyse in einem Raster zu überlagern.

Analyse der Komponenten des Streudiagrammprinzips. Transformationsgitter CVA, Streudiagramm und CVA-Transformationsgitter sind alle im Textprotokoll enthalten. Die Embryonen wurden vom Entwicklungsstadium 24 bis zum 30. Entwicklungsstadium mit einem mikromolaren Retinsäurerezeptor oder RAR-Inhibitor behandelt und dann im Stadium 42 fixiert und fotografierte Kontrollembryonen, die mit DMSO behandelt wurden.

Normalerweise führte die Behandlung mit RAR-Inhibitoren zu einer Verengung der Gesichtsaugenanomalien und einem missgebildeten dreieckigen Mund. Nach Durchführung einer geometrischen morphometrischen Analyse wurde die Varianz mittels der Hauptkomponentenanalyse bewertet. Behandelte Embryonen wurden deutlich von Kontrollen unterschieden.

Entlang der PC-Achse eins kennzeichnen die Pfeile statistische Ausreißer innerhalb einer Gruppe. Morphologische Unterschiede wurden anschließend durch eine Diskriminantenfunktionsanalyse bewertet. Dramatische Verschiebungen in der Position der seitlichen Landmarken deuten auf eine Verengung der Gesichtsform hin.

Eine leichte Verschiebung der Nasenlochposition nach außen ist durch die Pfeile gekennzeichnet. Auch im Bereich der Mittelfläche ist eine deutliche Verzerrung zu beobachten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Kombination aus traditionellen Größenmessungen und geometrischer Morphometrie verwenden können, um die Größe und Form des embryonalen Gesichts von Theus zu beurteilen.