Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Bestimmung der Viruskonzentration durch die Quantifizierung von infektiösem Varion durch Zählung diskreter Plaques in Zellkulturen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen plattiert werden, um eine konfluente Monoschicht für die Infektion zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, eine serielle Verdünnung der unbekannten Virusprobe durchzuführen, die quantifiziert werden soll.

Als nächstes werden die konfluenten Monoschichten durch die serielle Verdünnung des Virusbestands infiziert, gefolgt von der Anwendung eines immobilisierenden Overlays. Der letzte Schritt besteht darin, die Plaques nach der entsprechenden Inkubationszeit für das betreffende Virus zu fixieren und zu färben, um die diskreten Plaques zu zählen. Letztendlich können Plaque-Assays auf verschiedene Weise verwendet und modifiziert werden, um die Virustiter einer unbekannten Virusprobe zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem halbfesten Overlay, besteht darin, dass das Auftragen und Entfernen sowohl bei Anwendungen mit hohem Durchsatz als auch bei herkömmlichen Anwendungen viel einfacher ist. Zudem ist keine Erwärmung der Reagenzien erforderlich. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Erforschung vieler verschiedener lytischer Viren wie die Verwendung eines flüssigen Overlays.

Ein 96-Well-Format ermöglicht das schnelle Screening neuartiger therapeutischer Verbindungen, wodurch die langen Stunden, die im Labor mit der Durchführung herkömmlicher Plaque-Assays verbracht werden, erheblich reduziert werden können. Am Tag vor der Assay-Platte werden die für das betreffende Virus geeigneten Zellen benötigt, um am Tag der Infektion eine Co-Flüssigkeit von 90 bis 100 % zu erreichen. Die Stammlösungen können auch am Tag vor dem Assay hergestellt werden: Bereiten Sie zunächst eine Fixierlösung von 10 % Formaldehyd in destilliertem Wasser her, indem 5,56 Milliliter 36 % Stammformaldehyd mit 14,44 Millilitern destilliertem Wasser gemischt werden. Bereiten Sie dann den Kristallviolettfleck vor, der aus 1% Kristallviolett in 20% Ethanol besteht, das mit destilliertem Wasser verdünnt ist.

Bereiten Sie anschließend unter sterilen Bedingungen die entsprechenden zwei x Plaque-Medien für die Art der verwendeten Zellen vor. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter, wenn eines der Reagenzien nicht steril ist. Zur Herstellung einer flüssigen Überlagerung für die Verwendung im Plaque-Assay werden 2,4 g der Avy-Zelle in einen Kolben mit 97,6 Millilitern destilliertem Wasser gegeben, der schnell mit einem Rührstab gemischt wird.

Mischen Sie die Lösung bei Raumtemperatur, bis sie zu zähflüssig für den Rührstab wird. Zu diesem Zeitpunkt wird der Kolben in einen Kolbenschüttler umgefüllt und 30 Minuten lang stark gerührt, um eine gleichmäßige Homogenisierung zu gewährleisten. Zum Schluss autoklavieren Sie die Lösung bei 121 Grad Celsius bei 14 PSI für 30 Minuten.

Und wenn das Programm beendet ist, lagern Sie es versiegelt bei Raumtemperatur für ein aros-Overlay. Bereiten Sie eine 0,6%ige Agro-Stammlösung in destilliertem Wasser vor. Mit einem Rührstab mischen und autoklavieren, um es in Lösung oder eine Carboxymethylcellulose-Überlagerung zu bringen.

Bereiten Sie eine 2%ige Carboxymethylcelluloselösung in destilliertem Wasser vor und mischen Sie sie dann wie zuvor am Tag nach dem Plattieren. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die Kofluenz und Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen, bevor Sie mit dem Assay beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine standardmäßige zelluläre Morphologie und eine Co-Flüssigkeit von ca. 90 % aufweisen.

Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der infektiösen Proben in zellulären Wachstumsmedien durch, wobei die Anzahl der erforderlichen Verdünnungen basierend auf dem erwarteten Titer des betreffenden Virus variiert wird. Bereiten Sie außerdem eine nicht infizierte Kontrollprobe vor, um die Lebensfähigkeit der Zellen unabhängig sicherzustellen und die Identifizierung von Plaques zu unterstützen. Pipettieren Sie die nicht infizierte Kontrolle und die serielle Verdünnung in die Vertiefungen der Platte, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Monoschicht nicht beschädigt wird.

Verwenden Sie ein ausreichendes Inokulumvolumen, um die Zellen zu bedecken, und halten Sie das Volumen so gering wie möglich, um den Viruskontakt mit der Monoschicht zu maximieren. Legen Sie die Platten in den Gewebekultur-Inkubator und infizieren Sie die Zellen alle 20 Minuten für 45 Minuten bis eine Stunde. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten und ein Austrocknen der zellulären Monoschicht während der Infektion zu verhindern.

Bereiten Sie die Overlay-Arbeitslösung für flüssige Overlays vor. Mischen Sie erwärmte Plaque-Medien und 1,2 bis 2,4 % Raumtemperatur Stamm-Avy-Zellen in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um eine Arbeitslösung von 0,6 bis 1,2 % Avy-Zell-Overlay-Medium oder AROS- oder CMC-Overlays gemischter erwärmter Plaque-Medien und eine Stammlösung von entweder erhitzten 0,6 % AROS oder 2 % CMC in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis zu erhalten. Dann in ein 56 Grad Celsius heißes Wasserbad stellen, 30 Minuten zum Temperaturausgleich.

Stellen Sie sicher, dass sich die Lösung warm, aber nicht heiß anfühlt, um Zelltod und reduzierte Virustiter zu verhindern. Nach der Infektion tragen Sie die Overlays nach Zugabe des Overlays auf die infizierten Monoschichten auf Inkubieren Sie die Platten je nach zu analysierendem Virus zwei bis 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf, um die Zellen mit einem flüssigen Overlay zu fixieren, gießen Sie das E-Zell-Overlay ab oder aspirieren Sie es, pipettieren Sie dann 10 %ige Formaldehydlösung in die Vertiefungen und fixieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur über Nacht oder direkt bei aros oder CMC. Geben Sie die Formaldehydlösung für eine Stunde bis über Nacht bei Raumtemperatur nach der Fixierung in die Auflage, entsorgen Sie das Formaldehyd und entfernen Sie dann manuell die halbfesten Pfropfen, wo sich die Aros mit dem Spatel befinden.

Spülen Sie die Aby-Zell-Plaques mit Wasser ab, um vor dem Färben Reste des Overlay-Fixiermittels zu entfernen. Zum Färben bedecken Sie die Zellen ca. 15 Minuten lang mit einer minimalen Menge kristallvioletter Lösung. Schütteln Sie die Platten bei Bedarf, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten.

Waschen Sie den kristallvioletten Fleck vorsichtig mit Wasser ab, sobald er fixiert, gebeizt und getrocknet ist, lagern Sie den Plex auf unbestimmte Zeit für die zukünftige Analyse. Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung, wobei Vertiefungen mit weniger als fünf oder mehr als 100 Vertiefungen ausgeschlossen werden. Nehmen Sie den Durchschnitt für alle technischen Replikate der gleichen Verdünnung.

Achten Sie auf die Größe und Morphologie der Plaques. Bestimmen Sie den Virustiter der Stammprobe, indem Sie die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung und den Kehrwert des Gesamtverdünnungsfaktors nehmen. Dieses Bild zeigt Vergleiche von Rift-Valley-Fieber-Virus-Plaque-Overlays unter Verwendung von 12-Well-Platten; die Büros wurden mit dem 2,5-fachen von 10 der fünften Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 Mikrolitern infiziert, wobei dieselbe seriell verdünnte Startprobe von MP 12

Nach der Infektion wurden 1,5 Milliliter Overlays von 0,3 %aros 0,6 %ABY oder 1 %CMC aufgetragen, um die Overlays direkt zu vergleichen. Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Plaquezählung und des Titterns für alle drei Overlays. Hier. Es wird gezeigt, dass ViiV-Plaque-Overlay-Vergleiche unter Verwendung von 12-Well-Platten wie zuvor plattiert und mit einem Volumen von 200 Mikrolitern infiziert wurden, wobei dieselbe seriell verdünnte Startprobe des ViiV TC 83-Impfstoffstamms verwendet wurde. Nach der Infektion wurden 1,5 Milliliter Overlays von 0,3 %aros, 0,6 %avy-Zellen oder 1 %CMC wie zuvor aufgetragen.

Auch hier zeigt das Histogramm die Ergebnisse der Plaquezählung und des Titerings für alle drei Overlays. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für Plaque-Overlays mit hohem Durchsatz. Eine 96-Well-Platte mit VIRs, die auf dreimal 10 der vierten Zellen pro Well plattiert waren, wurde mit 50 Mikrolitern Inokulum infiziert, wobei dieselbe seriell verdünnte Startprobe des Rift-Valley-Fieber-Virus MP 12 für eine Stunde im Quad-Duplikat für die Overlays verwendet wurde. 0,6 und 1,2 % Endkonzentrationen der Avy-Zellen wurden getestet, um die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung von Flüssig-Overlays in einer Hochdurchsatz-Weise zu bestimmen.

Dieses Histogramm zeigt die Titer, die aus jedem Overlay ermittelt wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jedes Virus anders ist und Optimierungen, einschließlich der Verwendung verschiedener Zelltypen, Inkubationszeiten und/oder Wachstumsmedien, erforderlich sein können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen grundlegenden Plaque-Assay durchführen, bei dem sowohl flüssige als auch halbfeste Überlagerungen verwendet werden.