Name: Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Plaque-Assay-Methode zur viralen Quantifizierung mit flüssigem Mikrokristalliner Zellulose-Overlay. Diese Technik vereinfacht Anwendung und Entfernung im Vergleich zu traditionellen halbfesten Überzügen.

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Wir möchten uns bei FMC BioPolymer USA für Produktproben von Avicel bedanken. Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der Defense Threat Reduction Agency HDTRA1-13-1-0005 an KK und den NIH-Forschungszuschuss 1R15AI100001-01A1 an KK unterstützt.

1. Herstellung der Zellen und Reagenzien <ol><li> Der Tag vor dem Test, Platte geeignete Wirtszellen für das Virus in Frage (Tabelle 1 und 2) bei 90 bis 100% Konfluenz. </li><li> Vorbereitung Fixierlösung von 10% Formaldehyd in dH 2 O. In Beispiel mischen 5,56 ml 36% stock Formaldehyd mit 14,44 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O). HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sicheren Handhabung zu und Lüftung bei der Verwendung von Formaldehyd. </li><li> Vorbereitung Kristallviolett-Färbung: 1% Kristallviolett (CV) in 20% Ethanol und dH 2 O. </li><li> Bereiten 2x Plaque Medien (Zelltyp abhängig zu 2x Konzentration; siehe Tabelle 2). Filter mit einem 0,2 um Filter, wenn irgendwelche Reagenzien sind nicht steril. </li><li> Vorbereitung der Immobilisierung Overlays (Tabelle 3) <ol><li> Für flüssige Overlays, machen Sie eine sterile 2,4% ige Lösung von Avicel in dH 2 O. Um ein Verklumpen zu verhindern, fügen Sie das Pulver in einen Kolben Wasser mit thbei rasch Mischen mit einem Rührstab, gießen Avicel langsam und rühren schnell bei Raumtemperatur (RT). Wenn die Lösung als zu viskos für ein Rührstab zu homogenisieren, zu einem Kolbenschüttler für&gt; 30 min wechseln mit schweren Agitation sogar Homogenisierung zu gewährleisten. HINWEIS: Die Stammlösungen kann bei geringeren Konzentrationen hergestellt werden, aber die Lösungen getrennt und müssen wieder gemischt, um die Homogenisierung zu gewährleisten. Arbeitslösungen Avicel kann reichen von 0,6 bis 3% werden. </li><li> Nach der Homogenisierung Autoklaven die Lösung und lagern bei RT versiegelt. </li><li> Für Agarose und Carboxymethylcellulose (CMC) Overlays, bereiten eine Stammlösung in dH 2 O 2% CMC oder 0,6% Agarose. Mischen Sie mit einem Rührstab und Autoklaven oder Mikrowelle, um in Lösung zu bringen. </li></ol></li></ol> 2. Verdünnungen und Infektionen <ol><li> Am Tag nach der Beschichtung, Sichtprüfung der Konfluenz und Lebensfähigkeit der Zellen vor dem Start des Assays. Stellen Sie sicher, Standardzellmorphologie einnd a ~ 90% konfluenten Monolayer vorhanden. </li><li> Führen Sie eine Verzehnfachung serielle Verdünnung der infektiösen Proben. Verwenden der zellulären Wachstumsmedien für die Virusvermehrung als Verdünnungsmittel (Tabelle 2). Variieren Sie die Anzahl der Verdünnungen auf Basis der erwarteten Titer des Virus in Frage erforderlich, und immer eine nicht-infizierten Kontrollprobe zu verwenden, um unabhängig zu gewährleisten zelluläre Lebensfähigkeit und Hilfe bei der Plaque-Identifikation. </li><li> Aus den seriellen Verdünnungen, infizieren die Zellen für 45 min bis 1 h (Tabelle 1). Verwenden ein ausreichendes Volumen des Inokulums, die Zellen abdecken, während das Volumen so gering wie möglich, um virale Kontakt mit der Monoschicht (Tabelle 4) zu maximieren. Sanft Felsplatten alle 20 min, um sicherzustellen, gleichmäßige Abdeckung und verhindern, dass die zelluläre Monoschicht vor dem Austrocknen. </li><li> Nach der Infektion überlagern eines geeigneten Volumens der Immobilisierung Medium direkt auf die Inokula in der Vertiefung (Tabelle 2) unter Verwendung eines 1: 1-Mischung von 2 x Medium und dem Plaque immobilizing-Overlay der Wahl (CMC, Agarose oder Avicel). Schaukeln zu mischen. <ol><li> Für flüssige Overlays, mischen Sie 1: 1 mit erwärmt 2x Plaque Medien und 1,2-2,4% RT stock Avicel um eine Arbeitslösung von 0,6-1,2% Avicel Overlay Medium zu erhalten. </li><li> Für eine Agarose-Overlay, verwenden Sie eine 1: 1-Mischung aus erwärmt 2x Plaque Medien und eine Stammlösung von beheizten 0,6% Agarose, in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min, um die Temperatur Erhalt einer endgültigen Agarose / Overlay Konzentration von 0,3 ins Gleichgewicht %. </li><li> Für CMC, bereiten eine 2% ige Stammlösung und Behandlung wie für die Agarose-Overlay beschrieben. </li><li> Bei der Anwendung der Überlagerung zum Monoschicht immer äquilibrieren heißen Agarose oder CMC in einem 56 ° C Wasserbad, um Schäden an der Monoschicht zu verhindern. Stellen Sie sicher, die Lösung ist warm, aber nicht zu heiß zum Anfassen, Zelltod und geringere virale Titer verhindern. Die meisten Agarose Overlays beginnt unter 42 ° C erstarren, arbeiten schnell und / oder bereiten kleinen Chargen, um eine Verfestigung zu verhindern, während der Handhabung. </li></ol></li><li> Nach Zugabe des Overlay, Inkubation Platten deutliche Plaques, die eindeutig zählbare zu produzieren. Plaquebildung kann dauern 2-14 Tage, je nach Virus analysiert, Tabelle 1. HINWEIS: Sobald Flüssigkeit übereinandergelegten Platten werden in den Inkubator gestellt, nicht bewegen. Bewegung der Flüssigkeit Overlays während der Inkubationszeit wird in geschmiertem Plaques führen. Agarose und CMC Overlays sind halbfeste und können verschoben oder periodisch unter einem Lichtmikroskop überprüft, um Plaqueentwicklung zu überwachen. </li></ol> 3. Fixierung und Färbung Cells <ol><li> Um die Zellen zu fixieren, abgießen oder absaugen Avicel-Overlay, und fixieren Zellen unter Verwendung des 10% Formaldehydlösung für 30 min über Nacht (&lt;1 ml pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte). <ol><li> Für Agarose oder CMC, direkt fügen Sie die Formaldehyd-Lösung, um die Überlagerung für 1 h bis über Nacht. HINWEIS: Die Proben können für längere Zeiträume in dem Fixiermittel gehalten werden, sofern sie dannnicht verdunsten und austrocknen, da dies die Monolage verzerren. </li></ol></li><li> Vor der Färbung und nach der Fixierung, entsorgen Sie die Formaldehyd und entfernen Sie die halbfesten Stecker für die Agarose und CMC entweder mit fließendem Wasser oder manuell mit einem Spatel. Spülen Avicel Plaques mit Wasser auf Rest Overlay / Fixiermittel vor der Färbung zu entfernen. </li><li> Zum Färben, decken die Zellen mit einer minimalen Menge an Kristallviolett-Lösung für ca. 15 min. Felsplatten, wenn notwendig, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Vorsichtig waschen den Kristallviolett-Färbung mit Wasser. Einmal fixiert, gefärbt und getrocknet, speichern Plaques auf unbestimmte Zeit für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. Bestimmung Virustiter <ol><li> Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung, wobei die durchschnittliche für technische Wiederholungen des gleichen Verdünnung. Für große Plattenformate, Discount Brunnen mit weniger als 5 oder mehr als 100 Tafeln. Beachten Plaquegröße und Morphologie. Die Negativkontrolle sollte eine einheitliche Mono haben undals Referenzkontrolle verwendet werden. </li><li> Bestimmen Sie die virale Titer des Aktien Probe, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung und dem Kehrwert der Gesamtverdünnungsfaktor. </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> HINWEIS: Als ein Beispiel, 30 und 32 Plaketten für Wiederholungen der 1 x 10 -7 Verdünnung [31 (Durchschnitt) / 10 -7 (Verdünnung) x 0,4 ml (Inokulum)] würde einen Titer von 7,75 erhalten x 10 8 pfu gezählt / ml.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen und keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen an dem Protokoll oder den beschriebenen Produkten.

Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Plaque-Assay liegt in der Optimierung des Protokolls für die bestimmte Viruskultur in Frage Bedingungen erheblich variieren kann. Wichtige Punkte zu berücksichtigen sind: Gastgeber zelluläre Verträglichkeit mit dem Virus in Frage, geeigneten viralen Wachstumsbedingungen, ausreichende Verdünnung reicht, um genau zu differenzieren Plaketten und korrekte Überlagerung Auswahl und Färbung für die Zellen und Viren im Frage. Während VEEV und RVFV sowohl unter sehr ähnlichen Bedingungen unter Verwendung von vielen der gleichen Wirtszellarten wachsen, Unterschiede in der Plaque-Morphologie und Wachstumskinetik erheblich variieren. Bei der Verwendung von Vero-Zellen für die Plaque-Assays, die traditionell als die Ausbreitung und die Indikator-Zelllinie für hämorrhagische Fieberviren und Alphaviren verwendet wurden, wächst VEEV typischerweise zu höheren Titern als RVFV und zeigt erhöhte Replikationskinetik, Entwicklung großer Uniform Plaques bei 48 hpi 4, 10-12. Im Gegensatz zu VEEV, RVFV erfordert 72 hpi und zeigt Plaques, die in der Regel wesentlich kleiner sind und in der Größe variabel. Im Gegensatz zu RVFV und VEEV ist das Influenza-Virus hochWirtsZelle spezifisch und können schwer durch Gewebekultur fortpflanzen. Für das Influenza-Virus, Viruseintritt und Fusion normalerweise durch die Bindung von Zelloberflächenrezeptors mit dem viralen Glycoprotein hamagglutinin (HA), die den Eintritt in die Zielzelle durch Bindung mit der Wirtszelle α-Sialinsäure-Oberflächenrezeptor vermittelt eingeleitet. HA ist ein Glykoprotein, das trimere im Membranhülle aller Influenza-Viren vorhanden ist und erfordert Spaltung in die Untereinheiten HA1 und HA2 durch eine spezifische Wirtszelle Protease. Um das Problem weiter zu komplizieren, können diese Schnittstellen oft schwanken zwischen Virusstämmen 13. Da die Expression von Proteasen spalten kann HA ist auf bestimmte Gewebe beschränkt, Proteasen are häufig Zellkulturmedien, um die viralen Fusion und den Eintritt in die ausgewählte Wirtszelle 13 zu erleichtern zugegeben. TPCK-Trypsin ist ein Beispiel eines üblicherweise verwendeten Protease, die in der Zellkultur sowohl mit MDCK und Vero-Zellen verwendet wird: Erleichtern Multizyklus-Replikation (in Ermangelung einer Trypsin zu inaktivieren Serum) durch die proteolytische Aktivierung der viralen HA 14,15. Wie in dieser Studie und andere zeigten, können Unterschiede in der viralen Lebenszyklen Overlay Selektionen, Plattenformate und Abholzeiten, mit erheblichen Abweichungen zwischen den unterschiedlichen Klassen und Arten von Viren beeinflussen. In unserer Studie zeigte Agarose Overlays klarer Plaques bei höheren Titern als entweder CMC oder flüssigen Overlays für beide RVFV und Influenza-B-Virus, Verstärkungs ihre Nutzbarkeit unter einer breiten Palette von Viren und Zelltypen. Mit einem niedrigen Endkonzentration von Agarose stark bei der Beseitigung der festen Stecker und vereinfachte Färbung unterstützt. CMC Gesamt demonstrierte die poorest Wirksamkeit als Overlay für alle drei getesteten Viren und produziert sehr klein und undeutlich Plaques für Influenza-B-Virus. Obwohl insgesamt CMC zeigten die am wenigsten wünschenswerte Eigenschaften, die Nutzung im schnell wachsenden und vorteil extrem virulenten Viren nachweisen konnten, wie es tat scheinen Plaquegröße mit nur einem minimalen Rückgang der Titer zu reduzieren. Die Flüssigkeit erwies sich als Überlagerung der vielseitigste daß sein war es extrem einfach herzustellen, erhöhte Leichtigkeit der Verwendung und war vergleichbar mit der in allen ausgewählten Viren Agarose. In einem höheren Durchsatz 96-Well-Platte-Format, Anlegen und Entfernen nicht aufgrund der Verfestigung wie bei herkömmlichen Überlagerungen verhindert wird, und sofern genaue und konsistente Ergebnisse. Eine Überlegung bei der Verwendung von flüssigen Überlagerungen liegt in der undurchsichtigen Färbung und die Unfähigkeit, die Plaquebildung zu überwachen, wenn die Platten nicht bis zum Sammelpunkt bewegt werden, begrenzen diese Anpassung an Viren mit bereits charakterisierten Replikationskinetik. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Kleinere Änderungen in der Plaque Assay-Bedingungen können die Ergebnisse erheblich verändern, und die Auswertung und Leistungsfähigkeit jedes neue System oder Technik ist immer gewährleistet. Während eine optimierte und standardisierte Plaque-Assay-Protokoll nicht für jede Situation gibt, unserem Bericht zeigen die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit in der traditionellen als auch neuen flüssigen Overlays für Plaque-Assays, während eine ausreichende Basis für weitere Benutzer Modifikationen.

Die genaue Trennung und Quantifizierung von lebensfähigen viralen Proben war stets eine laufende Forschungsziel in der Virologie. Es war nicht bis zum Aufkommen des Plaque-Test im Jahr 1952, die ein Mittel, um quantitativ und qualitativ zu berechnen Tier virale Titer wurde zuerst entwickelt, 1,2. Diese Technik wurde erstmals angepasst und aus Phagen-Assays, die zuvor verwendet worden war, um die Titer von Aktien Bakteriophagen in Pflanzenbiologie 1,2 berechnen modifiziert. Während alternative Mittel für virale Quantifizierung seit entwickelt und angepasst worden ist, wie Immunoassays, Fluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie, abstimmbaren resistive Erfassungsimpuls (TRPS), Durchflusszytometrie, rekombinante Reportersysteme und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Diese Methoden versagen zu identifizieren und zu quantifizieren replikationskompetentem Vironen 1,3. Während Fortschritte in Technologien und Techniken weiter zu verfeinern und verändern die Landschaft; PLATEe-Assays weiterhin den Goldstandard bei der Bestimmung viralen Konzentrationen für Infektions lytische Vironen 1,4 darstellen. Während eines Plaque-Assays wird eine konfluente Monoschicht von Wirtszellen mit einem lytischen Virus unbekannter Konzentration, die in Reihe mit einem zählbaren Bereich zwischen 5-100 Virionen verdünnt wurde, typischerweise infiziert. Infizierten Monoschichten werden dann mit einem Immobilisierungsmittel Deckungsmedium bedeckt, um eine virale Infektion von wahllos Ausbreitung durch entweder die mechanische oder konvektiven Strömung des flüssigen Mediums während der Virusvermehrung verhindern. Während feste oder halbfeste Overlays wie Agarose, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose (CMC) haben traditionell verwendet worden, haben Flüssigkeitsüberlagerungen eine zunehmend attraktive Alternative mit der Entwicklung von neuartigen flüssigen Overlays werden wie Avicel 5- 7. Plaque Assays Flüssigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Overlays haben mehrere Vorteile, wie das Overlay kann applbei Raumtemperatur und Auftragen und Entfernen IED erheblich. Als flüssige Overlays nicht Erwärmung erfordern, kann zart und hitzelabilen Viren auch beweisen, leichter Plaque. Nach der Erstinfektion und Anwendung der immobilisierenden Overlay einzelnen Plaques oder Zonen der Zelltod wird, beginnen sich zu entwickeln, wie virale Infektion und Replikation in die Umgebung Monoschicht eingeschränkt. Infizierte Zellen wird die Replikation-Lyse-Infektionszyklus fortzusetzen, weitere Vermehrung der Infektion, was zu immer deutliche und diskrete Plaques. Je nach Virus Wachstumskinetik und Wirtszelle verwendet wird, eine sichtbare Plaques bilden normalerweise innerhalb von 2-14 Tagen. Cellular Monoschichten können dann mit einem Standard-Hellfeld-Mikroskop, um ohne weiteres zu identifizieren Plaques mit dem bloßen Auge gezählt werden, oder typischer fixiert und durch Neutralrot oder Kristall gewaltsamen gegengefärbt. Es gibt eine Vielzahl von Plaque Gegen Flecken vorhanden, die jeweils thEIR spezifische Vor- und Nachteile. Kristallviolett ist üblicherweise am Ort der Sammlung und nach der Fixierung / Entfernen der Auflage aufgenommen, wodurch eine rasche und ausgeprägte Gegenfärbung, die für die Identifizierung von sehr kleinen Plaques können, wenn gemischte Morphologie vorliegt. Neutral Rot hat den Vorteil der frühen Anwendung und ständigem Kontakt mit dem Overlay, so dass für die Live-Überwachung der Entwicklung von Plaque-Bildung, was besonders nützlich ist, wenn die Arbeit mit einem unbekannten Virus oder Replikationskinetik. Wir haben jedoch festgestellt, dass Färbung ist in der Regel nicht so deutlich bei der Verwendung von Neutralrot. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid (MTT) bietet einige Vorteile, da die gelben Farbstoff Flecken lebende Zellen dunkelblau und viralen Plaques können ohne Entfernen der Auflage angerechnet werden mit Neutralrot. Der hohe Kontrast zwischen lebenden und toten Zellen durch MTT ergab ermöglicht auch die Erkennung von kleinen Plaketten zu einem früheren Zeitpunkt nach der InfektionObwohl Speicher würde immer noch die Entfernung des Overlay-8 erforderlich. Als Kristallviolett können einfach in einer Lösung aus Wasser und Alkohol hergestellt werden und bietet ein hohes Maß an Sensibilität für gemischten Plaquemorphologie, haben wir es als eine bevorzugte und vereinfachte Gegenfärbung ausgewählt für das Protokoll gezeigt, wie wir nutzen mehrere Familien gut dadurch Viren. Nach Fixierung und Färbung der infizierten Zellmonolayer werden Plaketten um Virusstammproben im Hinblick auf die Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter titrieren gezählt. Eine Protokollabfall sollte zwischen serielle Verdünnungen angemerkt werden, und je nach Plattengröße zwischen 5-100 Plaques gezählt, mit einer Negativkontrolle als Referenz verwendet. Statistisch Proben um 10% auf 100 Plaques gezählt beim Vergleich Probe repliziert 3 variieren. Der Vorteil der Verwendung von Plaque-Assays auf Virus-Titer zu bestimmen, liegt in ihrer Fähigkeit, die tatsächliche Anzahl der infektiösen Viruspartikel w quantifizierennnerhalb der Probe. Als mehrere Virionen könnte eine einzelne Zelle zu infizieren, ist die Terminologie der Einheiten über Virionen während der Plaque-Titration 1,2 verwendet. Plaquemorphologie können dramatisch unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und zwischen Virusspezies variieren. Plaquegröße, Klarheit, Grenz Definition und Verteilung sollten alle beachten, da sie wertvolle Informationen über die Wachstums- und Virulenzfaktoren des Virus in Frage stellen werden. Grundprinzipien Plaque-Assay kann auch angepasst und in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, wie beispielsweise bei der Verwendung der Schwerpunkt bildet Assays (FFAs) modifiziert werden. FFS nicht auf Zell-Lyse und Gegenfärbung verlassen, um die Plaquebildung zu erfassen, sondern beschäftigen Immuntechniken, um intrazelluläre virale Proteine ​​direkt zu erfassen durch getaggt Antikörper. Erhöhte Sensitivität, verringerte Inkubationszeiten nach Infektion und vor allem die Möglichkeit, zu quantifizieren nichtlytischen Viren sind alle verschiedenVorteile beim Einsatz von FFS. Während weit verbreitet, die kritischen begrenzenden Faktoren in FFAs gegenüber einem herkömmlichen Plaque-Assays besteht in der Notwendigkeit, geeignete Antikörper und die Fähigkeit, nur Sonde für die virale Proteinuntereinheiten und tatsächliche infektiösen Virionen 4. Für die Zwecke dieser Studie werden wir unsere Diskussion auf klassische Plaque-Assays zu begrenzen und die Verwendung von traditionellen festen und halbfesten Overlays (Agarose und CMC), zusammen mit neuen flüssigen mikrokristalline Cellulose-Overlays.

<table><tbody><tr><td>6-Well-CellStar-Platte für Gewebekultur</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-CellStar-Platte für Gewebekultur</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-CellStar-Platte für Gewebekultur</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml Deep-Well-Platte</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>Für serielle Verdünnungen</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Qualität Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Zellmedien/Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>2x EMEM für Plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &#176; C</td></tr><tr><td>MEM 100x&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 cl</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Hitze vor Gebrauch bei 62 &#176 inaktivieren; C für 30 min</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Aliquote herstellen/Einfrieren vermeiden Auftauen</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denaturiert Reagenz Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td> Beim <td>Rekonstituieren >30 min kräftig schütteln, um</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose zu homogenisieren&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethylcellulose, Natriumsalz mittlere Viskosität&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral entschlossenheit konzentration durch plaque-assays: mit tradition und neuen Überzugssysteme

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque-Assays bleibt eines der genauesten Methoden zur direkten Quantifizierung von infektiösen Virionen und antivirale Substanzen durch die Zählung der einzelnen Platten (infektiöse Einheiten und zellulären Totzonen) in Zellkultur. Hier zeigen wir, wie man eine Grund Plaque-Test durchzuführen, und wie unterschiedliche Overlays und Techniken können die Plaquebildung und die Produktion auswirken. Regel feste oder halbfeste Overlay-Substrate, wie Agarose oder Carboxymethylcellulose, verwendet worden, um die Virusausbreitung zu begrenzen, verhindern, unterschiedslose Infektion durch das flüssige Wachstumsmedium. Immobilisiert Overlays beschränken Zellinfektion mit dem unmittelbar umgebenden Monoschicht, welche die Bildung von diskreten zählbaren Foci und die anschließende Bildung von Plaque. Um die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit traditionellen Overlays zu überwinden, ein neuartiges Flüssigkeitslagerung Verwendung mikrokristalliner Cellulose und Carboxymethylcellulose Natrium wurde zunehmend als Ersatz in der Standard verwendetPlaque-Test. Flüssig-Overlay Plaque-Assays können leicht in Standard 6 oder 12-Well-Platte Formate nach traditionellen Techniken durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung. Aufgrund seiner flüssigen Zustand und die anschließende einfache Anwendung und Entfernung kann Mikrokulturplattenformate alternativ als schnelle, präzise und mit hohem Durchsatz Alternative zu größeren Maßstab viralen Titrationen verwendet werden. Verwendung eines nicht beheizten viskose Flüssigkeit Polymer bietet die Möglichkeit, die Arbeit zu rationalisieren, schont Reagenzien, Inkubator Raum und erhöht die Betriebssicherheit, wenn in traditionellen oder High-Containment-Labors wie kein Reagenz Heizung oder Glaswaren verwendet benötigt werden. Flüssige Overlays kann sich auch als empfindlicher als traditionelle Overlays für bestimmte hitzelabilen Viren.

Die Fähigkeit von Plaque-Assays, genau zu beurteilen Virustiter beruht auf zahlreichen Faktoren: geeignete Wirtszelle Auswahl geeigneten Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit immobilisierten Virusausbreitung und eine genaue Bestimmung des viralen Inkubationszeit, um eine angemessene Zeit für verschiedene ermöglichen und zählbare Plaquebildung. Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien gewählt, um Unterschiede in der zeigen: Overlay-Auswahl, Inkubationszeiten und Plaquemorphologie in unterschiedlichen Probenarten. Venezolanischen Pferde-Enzephalitis (VEEV) wurde als (+) ssRNA Virusmodell, das bedeutende Krankheit bei Equiden und Menschen verursachen und stellt die Familie Togaviridae ausgewählt. Influenza B Taiwan Stamm, einem segmentierten (-) ssRNA-Virus vor allem Menschen infizieren, stellt die Familie Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein (-) ssRNA Arthropoden geboren Virus primär infizieren Arthropoden,Wiederkäuer und Menschen wurde als Vertreter der Familie Bunyaviridae ausgewählt. Für RVFV (Figur 1), wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten lebenden attenuierten Stamm von MP12 RVFV in einer 12-Well-Plattenformat unter Verwendung CMC, Agarose oder Avicel Overlays, die Seite-an-Seite für 72 Stunden nach der Infektion inkubiert wurden bestimmt (hpi). Ein Vertreter Schild mit Verdünnungen im Bereich von 10 -4 bis 10 -7 in Feld A. Plaques mit CMC zu sehen und Agarose Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten Kreisgrenze. Plaques mit einer Flüssigkeit Overlay waren etwas reichlicher und im Vergleich zu Agarose und CMC Plaques größer, und lieferte eine weniger deutliche Grenze. Virustiter wurden in Tafel B mit allen Überlagerungen vergleichsweise Führen verglichen. Um eine klarere visuelle Vergleich zwischen Overlays für MP12 zusammen mit einer größeren Stichprobenumfang zu bestimmen Reproduk erhaltenbilität wurde eine 6-Well-Platte auch in dreifacher Ausführung (Abbildung 2) erprobt. In der 6-Well-Plattenformat, die Verwendung eines CMC-Overlay zeigten kleinere Plaques als entweder Agarose oder Flüssigkeitsüberlagerungen, die in der Größe miteinander vergleichbar waren. Während virale Titer waren ähnlich zwischen allen drei Überlagerungen (Tafel D), erwies sich Plaques in Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen gebildet leichter zu zählen wegen ihrer erhöhten Größe. Im Gegensatz RVFV, VEEV Titer und Plaquemorphologie zwischen den unterschiedlichen Überlagerungen stark variiert (3A). Plaques in CMC Overlays gebildet zeigte eine klare und deutliche Morphologie bei Verwendung einer 12-Well-Plattenformat, auf Kosten der Plaquegröße und Empfindlichkeit (Feld B). Im Gegensatz zu CMC, die Verwendung von Agarose und flüssigen Überlagerungen zu einer signifikant größeren Plaques, was geringere Virushemmung und erhöhte Empfindlichkeit gegen VEEV Replikation. Dieser wurde zuvor bestätigt, als allein zu vergleichen Agarose gegen CMC in apaper veröffentlicht von Juarez et al. 4. Während Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen erzeugt größere Plaques als CMC hatten die Plaques schlecht definierten Grenzen und waren schwierig, in einem 12-Well-Format zählen, mit flüssigem Overlays Erbringen der größten Grenzdiffusion. Wenn Plaques wurden in 6-Well-Platten (Abbildung 4) erprobt, negiert die größeren 6-Well-Format das Thema offenkundig großen Plaques, die schwer in der 12-Well-Format zu unterscheiden waren, mit Agarose und flüssigen Overlays beweisen besser als die CMC-Overlays in Bezug auf Plaque Definition und sensibel (4D). Im Vergleich zu RVFV oder VEEV bietet einige einzigartige Herausforderungen Influenza bei Plaquebildungs, wie das Erfordernis einer externen Protease. Die Empfindlichkeit des Influenza-Virus zu unterschiedlichen Overlay Auswahl wurde auch in der Vergangenheit gut dokumentiert als signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn Änderungen so gering wie unterschiedliche Marken aus Agarose habenen verwendet 9. Interessant für das Influenza-B-Stamm Taiwan, die Verwendung von CMC als Overlay Folge deutlich kleinere Plaques, die schwer zu zählen sind, und erwies sich als schwierig, zuverlässig Note (5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlay versehen die besten Plaques (Feld C) und ergab einen dunkleren Hintergrund-Färbung (wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Mono Lebensfähigkeit) und zeigte deutlicher und schärfer Plaques im direkten Vergleich zu der Verwendung des Flüssigkeitsüberlagerung (Feld B ). Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren auf festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der Leichtigkeit der Entfernung und Anwendung. Halbfesten Overlays erfordern Heizung und Verfestigung kann problematisch erweisen bei der Handhabung und Beseitigung. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität der Verwendung von Avicel in einem Hochdurchsatz Weise RVFV zu bestimmen, wurde eine 96-Well-Platte-Format bei unterschiedlichen Lagerungs concentrati trialedons (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden in vierfacher Verdünnungen an beiden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel geführt. Overlay Anwendung und Entfernung erwies sich als einfach, ohne erkennbare Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen Konzentrationen festgestellt, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit. Beim Vertonen waren Plaques deutliche und zählbaren mit dem bloßen Auge, die Machbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurch Weise RVFV. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Fig. 1: RVFV Plaque Overlay Vergleiche unter Verwendung 12-Well-Platten wurden bei Veros 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC (c endgültigenoncentrations) wurden um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Fig. 2: RVFV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie in Panel A gezeigt, wurden B und C. Separate Experimente identisch durchgeführt wie für Panels AC beschrieben mit Plaques gezählt und in Feld D (N = 3) titriert. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figur 3: &lt;strong&gt; VEEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 12 Vertiefungen. Veros wurden bei 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstoff-Stamm infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Fig. 4: V EEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder eine 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet als nachgewiesenin den Feldern A, B und C wurden Separate Experimente identisch durchgeführt wie bei den Feldern A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figur 5: Influenza Plaque Overlay Vergleiche MDCK-Zellen wurden mit 5 x 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von Influenza B Taiwan infiziert.. Kein fötales Rinderserum (FBS) wurde in das Wachstumsmedium oder Überlagerungen verwendet werden, wie FBS kann Influenza Ausbreitung durch Inhibition von bestimmten Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich hemmen. TPCK-Trypsin, um virale Fusion und die Eingabe mit den Wirtszellen zu erleichtern, um alle Überlagerungen vor der Anwendung hinzugefügt. Nach der Infektion wurden 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC, um direkt zu vergleichen angewendetdie Symbole wie in Panel A, B und C. Getrennte Experimente zeigten, wurden identisch durchgeführt wie in Panel A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Während ein durchschnittlicher wurde für CMC Plaques ergriffen sie erwies sich als schwierig, um zuverlässig zu zählen, wie sie diffuse Grenzen und sehr kleine Plakette Größen demonstriert. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Fig. 6: Hochdurch Plaque Overlays Eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert der Veros bei 3 x 10 4 Zellen pro Well wurden mit 50 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe RVFV MP12 für 1 Stunde infiziert, in vierfacher Ausfertigung. Für die Überlagerungen wurden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurchsatz-Weise Panels A und B zu bestimmen erprobt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plaque-Assay Inokulation Bedingungen und Zelltypen <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zellen-Art </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Wachstumstyp</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plaque Medien </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin ergänzt. 2. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml ergänzt. A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% Natriumpyruvat (5 ml), 1% L-Glutamin (5 ml) ergänzt, 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 0,2% Rinderserumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK ergänzt * * Kurz vor der Zubereitung, fügen 1 ul pro 25ml 2 ug / ml Bestand TPCK-Trypsin zu dem aliquoten Sie verwenden werden, um mit Agarose für Plaques mischen. Tabelle 2: Plaque und Viral / Zellwachstum Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Overlay-Lösungen wird nicht erlöschen, wenn gemacht, so lange, wie die Sterilität erhalten bleibt. Tabelle 3: Overlays Lizenz <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 gut </td><td> 12 gut </td><td> 96 gut </td></tr><tr><td> Anzahl der Zellen / Vertiefung </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen Innokulum (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Volumen von Overlay (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Plattenformate

Plaque-Assays sind der Goldstandard für die virale Quantifizierung, indem sie Entrapping-Overlays auf zellulären Monoschichten des Wirts verwenden, um virale Titer zu bestimmen. Während traditionell verschiedene halbfeste Overlays verwendet wurden, demonstrieren wir hier Plaque-Techniken, die halbfeste Overlays mit einer neuartigen flüssigen mikrokristallinen Cellulose in mehreren Virenfamilien vergleichen.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Virus-Konzentration durch Quantifizierung infektiöser Virionen mittels Zählung diskreter Plaques in Zellkultur zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen ausplattiert werden, um eine konfluente Monoschicht für die Infektion zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, eine serielle Verdünnung der unbekannten Virusprobe durchzuführen, deren Konzentration bestimmt werden soll. Anschließend werden die konfluenten Monoschichten mit der seriellen Verdünnung des Virus-Stocks infiziert, gefolgt von der Applikation einer immobilisierenden Überlagerung. Der letzte Schritt besteht darin, die Plaques nach der jeweils geeigneten Inkubationszeit für das betreffende Virus zu fixieren und anzufärben, um die diskreten Plaques zählen zu können. Letztendlich können Plaque-Assays auf verschiedene Weise verwendet und modifiziert werden, um die Virus-Titer einer unbekannten Virusprobe zu bestimmen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der halbfesten Abdeckung, liegt darin, dass die Anwendung und Entfernung sowohl bei Hochdurchsatz- als auch bei herkömmlichen Anwendungen weitaus einfacher ist. Außerdem ist keine Erhitzung der Reagenzien erforderlich. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Forschung an zahlreichen verschiedenen lytischen Viren, da die Verwendung einer flüssigen Abdeckung im 96-Well-Format eine schnelle Untersuchung neuartiger therapeutischer Substanzen ermöglicht, wodurch die langen Arbeitszeiten im Labor bei der Durchführung traditioneller Plaque-Assays erheblich reduziert werden können. Am Tag vor dem Assay die geeigneten Zellen für das betreffende Virus so ansäen, dass sie am Tag der Infektion eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreichen. Die Stammlösungen können ebenfalls am Tag vor dem Assay vorbereitet werden. Zunächst eine Fixierlösung mit 10 % Formaldehyd in destilliertem Wasser herstellen, indem 5,56 Milliliter 36 %ige Formaldehyd-Stammlösung mit 14,44 Milliliter destilliertem Wasser gemischt werden. Danach die Kristallviolett-Färbung herstellen, die aus 1 % Kristallviolett in 20 % Ethanol besteht, verdünnt mit destilliertem Wasser. Als Nächstes unter sterilen Bedingungen das geeignete 2x Plaque-Medium für die verwendeten Zelltypen vorbereiten. Die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter filtrieren, falls eines der Reagenzien nicht steril ist. Um eine flüssige Überlagerung für den Plaque-Assay herzustellen, 2,4 Gramm Avicel zu einem Kolben geben, der 97,6 Milliliter destilliertes Wasser enthält und mit einem Rührstab schnell gerührt wird. Die Lösung bei Raumtemperatur mischen, bis sie zu viskos für den Rührstab wird. An diesem Punkt den Kolben auf einen Kolbenshaker übertragen und 30 Minuten lang stark agitieren, um eine gleichmäßige Homogenisierung sicherzustellen. Schließlich die Lösung bei 121 Grad Celsius und 14 PSI 30 Minuten lang autoklavieren.Und nach Beendigung des Programms verschlossen bei Raumtemperatur lagern. Für eine Agarose-Überlagerung eine 0,6 %ige Agarose-Stammlösung in destilliertem Wasser herstellen, mit einem Rührstab mischen und im Autoklaven gelöst machen. Für eine Carboxymethylcellulose-Überlagerung eine 2 %ige Carboxymethylcellulose-Lösung in destilliertem Wasser herstellen und mischen. Anschließend wie zuvor im Autoklaven sterilisieren.Am Tag nach der Aussaat überprüfen Sie mit einem umgekehrten Mikroskop die Konfluenz und Vitalität der Zellen, bevor Sie den Assay beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine standardmäßige zelluläre Morphologie aufweisen und eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht ist.Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der infektiösen Proben in Zellwachstumsmedium durch, wobei die Anzahl der erforderlichen Verdünnungsschritte je nach erwarteter Titer des betreffenden Virus variiert. Bereiten Sie außerdem eine nicht infizierte Kontrollprobe vor, um die Zellviabilität unabhängig zu überprüfen und die Identifizierung von Plaques zu erleichtern. Pipettieren Sie die nicht infizierte Kontrolle und die seriellen Verdünnungen in die Vertiefungen der Platte, wobei darauf geachtet werden muss, die Zellschicht nicht zu stören.Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen des Inokulums, um die Zellen zu bedecken, und halten Sie dabei das Volumen so gering wie möglich, um den viralen Kontakt mit der Zellschicht zu maximieren. Stellen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator und infizieren Sie die Zellen für 45 Minuten bis eine Stunde. Schwenken Sie die Platten alle 20 Minuten vorsichtig, um eine gleichmäßige Benetzung sicherzustellen und zu verhindern, dass die Zellschicht austrocknet. Während der Infektion bereiten Sie die Überlagerungs-Arbeitslösung für flüssige Überlagerungen vor. Mischen Sie erwärmtes Plaque-Medium und 1,2 bis 2,4 % Avicel-Stammlösung bei Raumtemperatur im Verhältnis 1:1, um eine Arbeitslösung mit 0,6 bis 1,2 % Avicel-Überlagerungsmedium zu erhalten. Für Agarose- oder CMC-Überlagerungen mischen Sie erwärmtes Plaque-Medium mit einer Stammlösung aus entweder erhitzter 0,6 %iger Agarose oder 2 %igem CMC im Verhältnis 1:1. Anschließend 30 Minuten in ein Wasserbad bei 56 Grad Celsius stellen, um die Temperatur auszugleichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung warm, aber nicht heiß anfühlt, um Zelltod und verminderte Virus-Titer zu vermeiden. Nach der Infektion tragen Sie die Überlagerungslösung auf die infizierten Zellschichten auf. Nach Zugabe der Überlagerung inkubieren Sie die Platten je nach zu analysierendem Virus 2 bis 14 Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um Zellen mit einer flüssigen Überlagerung zu fixieren, gießen Sie die Avicel-Überlagerung ab oder aspirieren Sie sie, dann pipettieren Sie 10 %ige Formaldehydlösung in die Vertiefungen und fixieren Sie 30 Minuten bis über Nacht bei Raumtemperatur. Bei Agarose oder CMC geben Sie die Formaldehydlösung direkt zur Überlagerung hinzu und lassen sie eine Stunde bis über Nacht bei Raumtemperatur einwirken. Nach der Fixierung entsorgen Sie die Formaldehydlösung und entfernen anschließend manuell die halbfesten Plugs der Agarose mit dem Spatel.Spülen Sie die Avicel-Zell-Plaques mit Wasser, um restliches Überzugshistofixativ vor der Färbung zu entfernen.Die Zellen mit einer geringen Menge Kristallviolett-Lösung für etwa 15 Minuten einfärben. Gegebenenfalls die Platten schwenken, um eine gleichmäßige Bedeckung sicherzustellen. Die Kristallviolett-Färbung vorsichtig mit Wasser abwaschen. Nach dem Fixieren, Färben und Trocknen können die Plaques unbegrenzt für zukünftige Analysen aufbewahrt werden. Die Plaques in jedem Wells zählen, wobei Wells mit weniger als fünf oder mehr als 100 Plaques nicht berücksichtigt werden. Den Mittelwert für technische Replikate derselben Verdünnung bilden. Plaque-Größe und -Morphologie notieren. Die Virus-Titer der Stammlösung bestimmen, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung mit dem Kehrwert des Gesamtverdünnungsfaktors multipliziert wird.Dieses Bild zeigt Plaque-Überlagerungsvergleiche des Rift-Valley-Fieber-Virus unter Verwendung von 12-Loch-Platten. Vero-Zellen wurden mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro 12-Loch-Platte ausgesät und mit 200 µL derselben seriell verdünnten Startprobe des MP-12-Virus infiziert. Nach der Infektion wurden 1,5 mL Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC aufgebracht, um die Überlagerungen direkt zu vergleichen. Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Plaque-Zählungen und Titrierungen für alle drei Überlagerungen. Hier werden Plaque-Überlagerungsvergleiche mit VEEV unter Verwendung von 12-Loch-Platten dargestellt. Die Vero-Zellen wurden wie zuvor ausgesät und mit einem Volumen von 200 µL derselben seriell verdünnten Startprobe des VEEV-TC-83-Impfstammes infiziert; nach der Infektion wurden erneut 1,5 mL Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel-Zell oder 1 % CMC aufgebracht.Auch hier zeigt das Histogramm die Ergebnisse der Plaquezählungen und der Titrierung für alle drei Überlagerungen. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für Hochdurchsatz-Plaque-Überlagerungen. Eine 96-Loch-Platte mit Veros, die mit dreimal 10 hoch vier Zellen pro Loch beimpft wurden, wurde mit 50 µL Inokulum unter Verwendung derselben seriell verdünnten Startprobe des Rift-Valley-Fieber-Virus MP 12 vierfach infiziert. Für die Überlagerungen wurden endgültige Konzentrationen von 0,6 und 1,2 % Avicel-Zellulose getestet, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssiger Überlagerungen im Hochdurchsatzverfahren zu bestimmen. Dieses Histogramm zeigt die aus jeder Überlagerung ermittelten Titer. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass sich jeder Virus unterscheidet und Optimierungen erforderlich sein können, beispielsweise durch die Verwendung verschiedener Zelltypen, Inkubationszeiten und/oder Wachstumsmedien. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen grundlegenden Plaque-Assay unter Verwendung von flüssigen und halbfesten Überlagerungen durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Beim Arbeiten mit und Reagenzien zur Kultur von Mikroorganismen, muss aseptischen Technik praktiziert, um sicherzustellen, Kontamination zu minimieren werden. Eine Vielzahl von Beschichtungsverfahren werden routinemäßig verwendet, um zu isolieren, verbreiten oder aufzuzählen Bakterien und Phagen, die alle Verfahren, die die Sterilität der experimentellen Materialien zu erhalten übernehmen.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Dieses Video beschreibt den Virus-Plaque-Assay des infektiösen Herpes-simplex-Virus oder HSV. Die verdünnten Viruspartikel werden in die Monoschicht der Epithelzellen geimpft. Bei der Inkubation bildet das Virus Plaques und wird visuell gezählt, um den infektiösen Virustiter zu bestimmen.

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Dieses Video zeigt die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit einem Virus, das aus infizierter Schweinehornhaut gewonnen wurde. Die Schweinehornhaut wird verwendet, um die antivirale Wirksamkeit von experimentellen Medikamenten zu testen.

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