Name: Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Lernen Sie die Präparation akuter Gehirnschnitte bei physiologischer Temperatur für elektrophysiologische Experimente. Diese vereinfachte Methode ohne intrakardiale Perfusion liefert hochwertige Schnitte.

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Wir möchten Dr. Shiwei Huang (Australian National University) für seinen bedeutenden Beitrag zur Validierung der Methode danken. Darüber hinaus möchten wir uns bei Frau Kasia Pietrajtis für hilfreiche Kommentare zu den Golgi-Zellen und bei Herrn Vitaly Lerner für die experimentellen Daten des Kortex bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC und ISF.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Hebräischen Universität Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Herstellung der Lösungen und Werkzeuge für Slicing <ol><li> Herstellung von 1 l physiologischen Standardlösung (SPS) mit den in Tabelle 1 beschriebenen Ionen. <ol><li> Vorbereitung einer Stammlösung, die die Salze von 10-fachen der Endkonzentration im Voraus in einem Speicherglasflasche mit 1000 ml entionisiertem Wasser (Leitfähigkeit von 0,055 &amp; mgr; S / cm) gefüllt. Hinzufügen Salze (NaCl, KCl, KH 2 PO 4 und MgSO 4), und Rühren, bis es vollständig gelöst ist. Bewahren Sie die Stammlösung in 4 ° C. </li><li> Die endgültige SPS-Lösung am Tag des Experiments. 100 ml der Stammlösung zu 700 ml gereinigtem Wasser unter Verwendung magnetischer Rührstab lösen das Glucose (3,6 g) und NaHCO 3 (2,18 g) und dann Hinzufügen von gereinigtem Wasser bis zu 1 l </li><li> Gleichgewicht kommen die solutiauf durch Begasung mit 95% O 2/5% CO 2 für ~ 20 min. Danach fügen Sie 2 ml 1 M CaCl 2 -Lösung. </li></ol></li><li> Montieren Sie folgende Werkzeuge (Abbildung 1). <ol><li> Bereiten Sie große Schere oder einem anderen Werkzeug für Enthauptung, kleine chirurgische Scheren zum Öffnen des Schädels, um feine Spitze Pinzette zum Anheben des Schädels, um das Gehirn freizulegen, Skalpell mit Klinge zum Sezieren den gewünschten Teil des Gehirns in Scheiben geschnitten werden und eine kleine Spachtel zur Manipulation der seziert Hirnteile. </li><li> Außerdem bereiten kleine Stücke von Filterpapier zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Gehirn, zwei kleine Petrischalen für das Gehirn in zwei 500 ml Becherglas zur Aufnahme erwärmt gereinigtes Wasser und SPS, und Cyanacrylat-Klebstoff zum Verkleben des Gehirns, die zerlegt werden Slicing Bühne. </li><li> Bereiten Sie eine kleine Bürste für die Handhabung der Scheiben während der Schneiden und einem breiten Mund Glas Pasteurpipette zur Bewegung der Scheiben von der Schneide Bad zur Erholung chamber. Desinfizieren Sie die Werkzeuge, um das Wachstum von Bakterien in den warmen Scheibe Bäder verhindern. Darüber hinaus verwenden saubere Laborhandschuhe. </li></ol></li><li> Bereiten Sie einen untergetauchten Slice Rückgewinnungskammer wie von Gibb und Edwards 15 beschrieben. Kontinuierlich Gas die SPS in ihm mit 95% O 2/5% CO 2 und halten bei 36 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Begasung nicht in kleinen Blasen in der Badewanne, die Scheiben beschädigen könnten gefangen führen. </li><li> Warm ~ 300 ml der SPS bis 36 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetrührer oder in einem Wasserbad. Wenn eine Heizplatte verwendet wird, kümmern sich um die Lösung von Überhitzung, die in Ionen Fällung führen kann. Im Falle kommt es vor, warme Frisch SPS statt Kühl die alte. </li><li> Bringen ~ 500 ml gereinigtem Wasser zum Kochen mit einem elektrischen Wasserkocher und in ein Becherglas, kombiniert 300 ml davon mit kaltem Wasser, um etwas wärmer Wasser als der Slicing Temperatur zu erhalten. Verwenden Sie diese erwärmt gereinigtes Wasser während der Enthauptung und verwenden Sie die Leistungsbezogenening des abgekochtes Wasser später für die Aufrechterhaltung der physiologischen Temperatur des Slicing-Bad. </li><li> Betäuben die Maus durch Injektion von 0,1 ml von Pentobarbital (60 mg / ml) intraperitoneal verabreicht. Nach ein paar Minuten kontrollieren, ob das Tier nicht zu stark Zehe oder Schwanz drückt reagieren, um den Mangel der Empfindung zu ermitteln. </li></ol> 2. Präparieren des Gehirns <ol><li> Enthaupten Sie die Maus schnell durch Schneiden der Hals mit den großen Schere in der Nähe der Rückseite des Schädels, und lassen Sie den Kopf in den Becher mit erwärmtem gereinigtem Wasser abzuspülen überschüssiges Blut sinken. </li><li> Setzen Sie das Foramen magnum in den Schädel unter der Nackenmuskulatur und der Haut, möglicherweise das Entfernen des Hals mit dem kleinen Schere. </li><li> Ziehen Sie die Haut auf der Oberseite des Schädels in der Lage sein, um die Schädelnähte deutlich sehen, um das Öffnen des Schädels Führer sein. </li><li> Schneiden Sie den Schädel öffnen, indem Sie die untere Spitze der kleinen Schere durch das Foramen magnum und sofort wandeln sie in Richtungdie laterale Seite. Vorsichtig entlang der Seitenkante des Scheitelbeins bis zu einer Stelle hinter den Augen und dem frontoparietal Naht abgeschnitten; dann biegen Sie in Richtung der Mitte des Schädels und über die Mittellinie auf die andere Seite des Schädels geschnitten (siehe grüne gestrichelte Linie in Abbildung 2a). </li><li> Mit feiner Spitze Pinzette, heben Sie den Schädel von der frontoparietal Ecke und ziehen Sie sie schräg nach oben und zur Seite, um das Gehirn ausgesetzt werden (siehe gelben gestrichelten Pfeil in Abbildung 2a). Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist nicht auf einen Knochen oder Haut des Kopfes angebracht ist, so dass das Gehirn wird an Ort und Stelle bleiben, wenn der Schädel wird angehoben. Im Falle, dass das Gehirn mit dem Schädel bewegen, verwenden Sie die kleine Schere, jede Bindegewebe zwischen dem Schädel und dem Gehirn zu entfernen. </li><li> Wenn das Gehirn ausgesetzt ist, nicht zulassen das Gehirn trocken sein. So führen Sie die nächsten Schritte, während die Schädel und das Gehirn in einer Petrischale mit erwärmt gefüllt, vergast SPS. </li><li> Nehmen Sie den Teil des Gehirns für e verwendetXperiment vom Rest des Gehirns mit einem Skalpell und einem Spatel. Im Falle der Verwendung des Kleinhirns, lösen sich von der Vorderhirn durch einen einzigen Schnitt durch das Mittelhirn und Pons (entlang der roten Linien in den 2B-D) und verschieben Sie sie in eine kleine Petrischale, die frisch enthält, vergast SPS. </li><li> Entfernen Sie den Hirnstamm, eine gerade und breite Basis für die Verklebung das Gehirn Schneidstufe beim Schneiden das Kleinhirn in horizontaler Ebene zu bilden. Kurz legen Sie das Kleinhirn auf einem nassen Stück Filterpapier, so dass die Seite, die aus dem Vorderhirn geschnitten wurde nach unten zeigt. <ol><li> Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Skalpell, um die Basis zu bilden (wie bei der blauen Linie in 2B angegeben) und schicken Sie das Kleinhirn an die SPS. Wenn andere Ebenen der Schneid nötig sind, schneiden Sie die Kleinhirn-Block entsprechend (blaue Linien in den 2C &amp; D). </li></ol></li></ol> 3. Schneiden des Gehirns <ol><li> Bereiten Sie den Schneidstufe durch die Ermittlung, dass es dry, bevor ein kleiner Tropfen Superkleber in der Mitte der Bühne. </li><li> Heben Sie das Gehirn Block von der SPS mit einem Spatel mit der richtigen Seite nach oben, und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Gehirn mit kleinen Stücken von Filterpapier. Dann, mit einem einzigen Bewegung, schieben das Gehirn vor dem Spatel auf die Tropfen Kleber auf der Bühne. </li><li> Um das Gehirn vor dem Trocknen und den Kleber vom Laufen auf den Seiten des Gewebes zu verhindern, ein paar Tropfen von SPS mit einer Pasteurpipette und platzieren Sie den Schneidstufe in der Schneidekammer. Ausrichten des Gehirns blockieren, so dass die Bereiche von Interesse (zB Kleinhirnrinde) sind gegenüber der Klinge und somit zur geringsten mechanischen Druck, bevor es geschnitten unterworfen werden. </li><li> Schneiden Sie jede Scheibe nach den Anweisungen des Herstellers, während er ständig Begasung des SPS in der Schneidkammer sowie die Temperatur bei 34 bis 37 ° C. Halten Sie die Temperatur der Schneidkammer in diesem Bereich durch Befüllen des external Kammer der Slicer mit erwärmtem gereinigtem Wasser und Ersetzen des Wassers, wenn die Temperatur zu niedrig fällt. HINWEIS: Die Slicing Parameter müssen experimentell für jede Art von Gewebe und Nervenzellen, die untersucht werden gefunden werden. Im Falle des Campden SMZ 700 Schneider mit Keramikschaufeln und zerebelläre Golgi-Zellen verwenden 0,75 mm Schwingungsamplitude bei 65 Hz und die Vorschubgeschwindigkeit von 0,05 mm / sec; für Kleinhirnkern Neuronen höherer Amplitude und Frequenz (1 mm und 90 Hz, jeweils) und langsamer Vorschubgeschwindigkeit (0,01-0,02 mm / sec) empfohlen. Für beide Golgi und Kleinhirnkernneuronen sollte Schichtdicke 300 &amp; mgr; m. </li><li> Während der Schneiden, erlauben nicht die Scheiben an sich selbst zu falten. Verhindern Sie dies, indem Sie vorsichtig unterstützt sie mit einer weichen Bürste, vorzugsweise nur in Bereichen, die nicht von Interesse für das Experiment sind Berühren der Scheibe. Achten Sie darauf, den Pinsel vom Berühren der Vibratom Klinge zu verhindern; insbesondere im Falle der keramischen Blätter, sogar ein leichter Kontaktkann die Klinge beschädigen. </li><li> Bewegen Sie jede Scheibe von der Schneidekammer zu einer Erholung / Haltekammer mit einem breiten Mund, feuerpolierte Glaspasteurpipette. </li><li> Lassen Sie die Scheiben ruhen in der Kammer für mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments. Dies ermöglicht den Abbau geschädigter oder sterbende Zellen und Gewebe und führt zu einer saubereren Scheibenoberfläche bei. Während der ersten Stunde, Halten der Temperatur des SPS in der Kammer im Bereich von 34-36 ° C; sicherzustellen, dass die Scheiben nicht durch Luftblasen, die die Scheiben beschädigen oder sie schwimmen kann berührt. </li></ol> 4. Experiment <ol><li> Nach 1 Stunde, lassen die Erholung Kammertemperatur abkühlen auf RT (17-25 ° C). Anmerkung: Dies kann die Zeitdauer, während der die Scheiben durch die Verlangsamung des Wachstums von Bakterien und Zellstoffwechsels verwendet werden, zu verlängern. Dieser Zeitraum ist abhängig von der Gehirnregion und Zelltyp. Beispielsweise können bestimmte Arten von Golgi-Zellen gefunden werden gesund in Scheiben zu sein8 Stunden nach dem Schneiden während andere Arten dauern nur 6 Stunden. </li><li> Nach 1 Stunde wurde aus dem Slicing geben, verwenden Sie die Scheiben für die verschiedenen elektrophysiologischen Experimenten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir zeigen ein Verfahren zur Herstellung von akuten Gehirnschnitten von Mäusen in physiologischer statt eiskalter Temperatur. Es wurde gezeigt, dass 11 die Qualität der Scheiben in warmen Bedingungen erhaltenen überlegen ist, wenn sie mit denen mit kalten Bedingungen hergestellt verglichen, vorausgesetzt, daß die Schneidklinge eine minimale vertikale Vibration. Slicing in physiologischer Temperatur können physiologische Artefakte durch die niedrige Temperatur verursacht werden, wi...

Das Ziel der vorgestellten Methode ist es, qualitativ hochwertige akuten Hirnschnitten für die in vitro elektrophysiologischen Experimenten bekommen, vor allem bei der Verwendung von Erwachsenen oder sogar alte Tiere. Die akute Hirnschneidverfahren, wie von Skrede und Westgaard 1 in zwei eleganten Sätzen beschrieben, hat sich zu einer der Grundlagen der modernen neurowissenschaftlichen Forschung und wird weltweit in unzähligen Variationen beschäftigt. Die Qualität der Schichten wird in der Anzahl der lebenden Neuronen pro Schicht reflektiert wird, die Zeitdauer, während welcher die Zellen behalten ihre elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften als auch die Integrität des Gewebes. Außerdem ist die maximale Dauer für einen stabilen Aufzeichnungen hängt von der Qualität der Schichten. Somit entlang der Jahrzehnte die ursprüngliche Schneidverfahren wurde weiter von einzelnen Forschungsgruppen entwickelt Scheibe Erholung nach dem Schneiden 2-10, die durch komplexe Modifikationen der Zusammensetzung der Schneide erweitern or Recovery-Lösungen (wie Hinzufügen Ascorbat, Thioharnstoff oder auch H 2 O 2) als auch intrakardiale Perfusion vorge des Tieres mit gekühlten physiologischen Lösungen. Wie kürzlich gezeigt, 11 scheint physiologischer Temperatur während des Schneidens als vorteilhafter als Kühl neuronale Gesundheit; die Verbesserung ist auffälligsten bei der Arbeit mit Erwachsenen (2-8 Monate) Nagetiere. Vermeidung dramatische Temperaturänderungen verhindert Artefakte aufgrund von temperaturabhängigen Prozesse in den Zellen, wie Plastizität 13 und Ionenkanäle Kinetik 13,14. Solche Änderungen können Membranspannung und der intrazellulären Calcium-Signalgebung, spitze Schwelle beeinflussen, und Spike Form. Die &quot;heiße&quot; akute Schnittpräparat hier vorgestellte Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung hochwertiger akuten Hirnschnitten von jeder Region des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, die Cortex und Hippocampus, Hirnstammkerne 16 &lt;/ Sup&gt; und Riechkolben, die beide in Ratten und Mäusen. Bemerkenswert ist, erfordert die physiologische Temperatur Slicing Verfahren, dass die Schneidklinge schwingt nahezu perfekt horizontal und ist ohne bauliche Mängel. Eine solche Präzision vielleicht nicht erreichbar mit älteren Slicer Modelle; In solchen Fällen empfehlen wir die Durchführung der Schnittpräparat in eiskalten Bedingungen wie die niedrige Temperatur scheint das Gewebe widerstandsfähiger gegen mechanische Beschädigungen, auch wenn auf Kosten der Stoffwechselfehler zu machen.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>Konzentration: 60 mg/ml in physiologischer Kochsalzlösung.</td></tr><tr><td>Große Schere&nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Jede große Schere oder eine Guillotine mit ausreichend scharfen Kanten kann zum Enthaupten verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Iris-Schere&nbsp;</td><td>Prestige medical</td><td>48,148</td><td>Jede Feinschere kann verwendet werden, sofern die Scherenklingen nicht länger als 1,5&#8211 sind; 2 cm</td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze&nbsp;</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell&nbsp;</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Spachtel&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td>Jede Labormarke kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>Glasbecher&nbsp;</td><td>SCHOT</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette&nbsp;</td><td>Maple Leaf Marke</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber&nbsp;</td><td>LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td>Schneidemaschine</td><td>Campden</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>Keramik-Schneideklinge</td><td>Campden</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Heizung/Rührer</td><td></td><td></td><td>Zum Aufheizen der SPS für das Verfahren</td></tr><tr><td>Wasserkocher</td><td></td><td></td><td>Zum Erhitzen von Wasser für die</td></tr><tr><td>Temperaturregelung Scheibenrückgewinnungskammer + Heizeinheit</td><td>Warner Instrumente</td><td>&nbsp; BSC-HT +&nbsp; Es können auch BSC-BUW</td><td>Selbstbaumodelle verwendet werden.</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Zur Überwachung der SPS-Temperatur während des Präparierens und Schneidens</td></tr></tbody></table>

slice it hot: akute erwachsenen gehirn slicing in physiologischen temperatur

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Dieses Verfahren ist ein kritisches Element für elektrophysiologische Patch-Clamp-Experimenten, die weitgehend die Qualität der Ergebnisse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass das Weglassen der Kühlschritt während des Schneidverfahrens ist vorteilhaft beim Erhalt gesunder Scheiben und Zellen, insbesondere beim Umgang mit hoch myelinisierten Hirnstrukturen aus reifen Tieren. Obwohl der genaue Mechanismus, durch erhöhte Temperatur unterstützt neuronalen Gesundheit kann nur spekuliert werden, liegt es nahe, daß, wenn möglich, die Temperatur in dem das Schneiden durchgeführt wird, sollte in der Nähe von physiologischen Bedingungen, um temperaturbedingte Artefakte zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit des Verfahrens und damit die kurzen Vorbereitungszeit. In der Methode nachgewiesen erwachsenen Mäusen werden verwendet, aber die gleiche Prozedur kann mit jüngeren Mäusen als auch Ratten angewendet werden. Auch die folgenden Patch clamp Experiment auf horizontalen Kleinhirnschnitten durchgeführt, aber die gleiche Prozedur kann auch in anderen Ebenen als auch andere hinteren Bereichen des Gehirns verwendet werden.

Scheiben in der beschriebenen Weise hergestellt wurden, können für verschiedene elektrophysiologische und optogenetische Experimente eingesetzt werden. In 3A und 3C zeigen wir ein repräsentatives Beispiel eines horizontalen Kleinhirnscheibe und einem koronalen Gehirnrindenscheibe jeweils unter Differentialinterferenz (DIC) Optik angesehen. In der Klein Scheibe, können verschiedene Arten von Kleinhirn-Neuronen leicht durch ihre Lage und Zellkörperform erkannt werden, so dass gezielt elek...

In diesem Artikel zeigen wir eine Methode zur Herstellung von akuten Hirnschnitten bei physiologischer Temperatur, unter Verwendung einer konventionellen physiologischen Lösung ohne spezielle Modifikationen für das Schneiden (wie z.B. Zugabe von Saccharose) und ohne intrakardiale Perfusion des Tieres vor der Schnittvorbereitung.

Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige akute Hirnschnitte herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn aus dem Tier extrahiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die interessierende Gehirnregion zu präparieren und sie an der Schneidephase zu befestigen, während sie mit der Schnittlösung feucht gehalten wird.Als nächstes wird das Gehirn in physiologische Temperaturschneidelösung getaucht. Der letzte Schritt ist das Viome-Schneiden des Gehirns. Letztendlich können die Scheiben in verschiedenen elektrophysiologischen In-vitro-Experimenten verwendet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem eiskalten Schneiden besteht darin, dass sie einfacher ist und zu besseren Ergebnissen führt. Im Allgemeinen wird jeder, der neu in dieser Methode ist, Schwierigkeiten haben, da alle Schritte reibungslos und schnell ohne unnötige Verzögerungen durchgeführt werden müssen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir zum ersten Mal, als wir qualitativ hochwertige Kleinhirn-Kernschnitte von erwachsenen Tieren erhalten mussten.Die Methode wird von Le Anri, einem Studenten in unserem Labor, vor Beginn dieses Verfahrens demonstriert. Stellen Sie sicher, dass das Tool, die Tools und die Lösungen im Voraus vorbereitet sind. Die erste Tabelle zeigt die Zusammensetzung der physikalischen Standardlösung oder SPS, in der das Gehirn nach der Herstellung der SPS-Arbeitslösung geschnitten wird.Gemäß dem schriftlichen Protokoll wird die Lösung 20 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid äquilibriert, während die SPS Equilibrates die für das Schneiden erforderlichen Werkzeuge organisieren. Diese Abbildung zeigt die Anordnung der Werkzeuge, die für das Brain-Slicing verwendet werden, und kann als visuelle Referenz verwendet werden, wenn der Schlüssel zur Identifizierung jedes Elements eingerichtet wird, das im schriftlichen Protokoll enthalten ist. Nachdem die Äquilibrierung der SPS-Arbeitslösung abgeschlossen ist, geben Sie zwei Milliliter eines molaren Calciumchlorids in die SPS und dekantieren Sie dann etwa 300 Milliliter der Lösung in ein Becherglas.Stellen Sie das Becherglas mit SPS auf eine Heizplatte oder in ein Wasserbad, um es auf 36 Grad Celsius zu erhitzen. Wenn eine Heizung verwendet wird, achten Sie darauf, einen magnetischen Rührstab einzubauen und sicherzustellen, dass die Lösung nicht überhitzt, da dies zu Eisenausfällungen führt und die Lösung unbrauchbar macht. Als nächstes kochen Sie etwa 500 Milliliter gereinigtes Wasser in einem Wasserkocher und geben Sie dieses in ein Becherglas mit 300 Millilitern kühlem, gereinigtem Wasser, um Wasser zu erhalten, das etwas wärmer als 36 Grad Celsius ist, nachdem Sie die Maus betäubt und geköpft haben.Nach institutionell anerkannten Protokollen wird der Kopf im Becherglas mit erwärmtem Wasser von überschüssigem Blut gespült. Verwenden Sie dann eine kleine Schere, um den Foram und das Magnum des Schädels freizulegen, und ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen und die Schädelnähte besser zu visualisieren, um den Schädel zu öffnen. Führen Sie die Spitze der kleinen Schere durch den Unterarm und die Magnum.Drehen Sie sie sofort zur lateralen Seite und schneiden Sie vorsichtig entlang der lateralen Kante des Scheitelknochens bis zu einer Stelle hinter den Augen und der frontalen Scheitelnaht. Drehen Sie dann die Schere in Richtung Schädelmitte und schneiden Sie über die Mittellinie zur anderen Seite des Schädels. Dieses Diagramm zeigt das vollständige Muster der Schnitte, um den Schädel zu öffnen.Heben Sie nun mit einer feinen Pinzette den Schädel aus der vorderen Scheielecke an und ziehen Sie ihn diagonal nach oben, um das Gehirn freizulegen, übertragen Sie das Gehirn und den restlichen Schädel in eine Petrischale mit warmem Gast. SPS. Verwenden Sie dann ein Skalpell und einen Spatel, um die interessierende Region vom Rest des Gehirns zu lösen. Hier wird ein einzelner Schnitt sowohl durch das Mittelhirn als auch durch die Pons gemacht, um das Kleinhirn zu lösen.Die rote Linie in diesem Schema veranschaulicht die Position des Schnitts. Spülen Sie das Kleinhirn ab, indem Sie es in eine zweite kleine Petrischale mit warmgasigem SPS geben. Übertragen Sie dann das Kleinhirn auf ein Stück nasses Filterpapier.Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Skalpell so ab, dass er eine gerade, breite Basis bildet, die auf die Schneidebühne geklebt wird. Die blaue Linie in diesem Diagramm zeigt den Bereich, der für die Schneidphase wichtig sein wird. Zum Schluss legen Sie das abgeschnittene Kleinhirn wieder in die kleine Petrischale mit dem warmen Gas SPS und fahren Sie dann mit dem Schneiden fort.Stellen Sie zunächst sicher, dass die Schnittphase trocken ist, und tragen Sie dann einen kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber auf die Mitte der Stufe auf. Verwenden Sie dann eine Sula, um den Gehirnblock von der SPS zu entfernen, und tupfen Sie ihn mit einem kleinen Stück Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Gehirn zu entfernen. Sobald die überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, schieben Sie das Gehirn mit einer einzigen Bewegung vom Spatel auf den Leimtropfen.Verwenden Sie dann eine Pasta von Pet, um ein paar Tropfen SPS auf das Gehirn aufzutragen. Platzieren Sie den Schneidtisch mit dem daran befestigten Gehirn in der Schneidekammer. Richten Sie den Hirnblock so aus, dass die Kleinhirnrinde der Klinge zugewandt ist.Dadurch wird sichergestellt, dass der interessierende Bereich vor dem Schneiden dem geringsten mechanischen Druck ausgesetzt ist. Beginnen Sie nun mit dem Schneiden des Gehirns mit dem Mikrotom gemäß den Anweisungen des Herstellers, während Sie das SPS während des gesamten Schneidevorgangs ständig in der Schneidkammer begasen. Halten Sie die Temperatur der Schneidkammer auf 34 bis 37 Grad Celsius, indem Sie die äußere Kammer mit erwärmtem gereinigtem Wasser füllen.Stützen Sie während des Schneidens jede Scheibe vorsichtig mit einer weichen Bürste, damit sie nicht zusammenklappt. Versuchen Sie, den interessierenden Bereich nicht zu berühren und lassen Sie die Bürste nicht die Vibratorklinge berühren, da dies die Klinge beschädigen kann. Mit einer Weithalspipette aus feuerpoliertem Glas wird jede Scheibe aus der Schneidekammer in eine Warmhaltekammer mit kontinuierlich vergastem SPS überführt und bei 36 Grad Celsius gehalten.Stellen Sie sicher, dass die Vergasung nicht dazu führt, dass kleine Blasen in der Kammer eingeschlossen werden, die die Schnitte beschädigen könnten, wenn das Gehirn vollständig durchtrennt ist. Lassen Sie die Scheiben mindestens eine Stunde lang bei 34 bis 37 Grad Celsius in der Warmhaltekammer ruhen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Dies ermöglicht den Abbau von geschädigtem und absterbendem Gewebe, was zu einer saubereren Scheibenoberfläche führt.Lassen Sie die Temperatur der Rückgewinnungskammer nach Ablauf der Stunde auf Raumtemperatur abkühlen. Die Slices können nun für Experimente verwendet werden. Dieses Bild zeigt eine horizontale Kleinhirnschnitte, die mit der demonstrierten Methode aufgenommen wurde.Dargestellt sind die drei Hauptschichten der Kleinhirnrinde. GC ist die Granulatschicht. PC gibt die Bikini-Zellschicht und ml an.Die weiße Substanz der Molekülschicht ist mit WMA gekennzeichnet, die Patch-Clamp-Elektrode ist schematisch auf eine GOGI-Zelle, abgekürzt GOC, gezeichnet. Der Maßstabsbalken stellt 40 Mikrometer dar. Dies ist eine Beispielaufnahme aus der zuvor gezeigten GOGI-Zelle.Die Aufnahme wurde mit einer Patch-Clamp-Elektrode aufgenommen. Im Stromzangen-Modus. Die schwarze Farbe ist eine repräsentative Spur von sechs grauen Spuren.Hier ist ein koronaler zerebraler kortikaler Schnitt dargestellt, der mit dem demonstrierten Verfahren erhalten wurde. Kortikale Parametallzellen sind zusammen mit einer schematischen Zeichnung einer Patch-Clamp-Elektrode dargestellt. Dies ist ein Beispiel für eine Patch-Clamp-Aufnahme.Im aktuellen Clamp-Modus der im vorherigen Bild gezeigten Parametallzelle zeigt die Spur das typische Verhalten einer kortikalen Parametallzelle. Bitte achten Sie bei diesem Vorgang darauf, die Temperatur ständig zu überwachen.

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Neurowissenschaften

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