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In utero Elektroporation bei Mäusen

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Neuroscience

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Murine In Utero Electroporation

1.12: Neuronal Transfection Methods

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

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08:05 min

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April 30, 2023

Overview

Die in utero Elektroporation ist eine wichtige Technik für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die Proliferation, Differenzierung, Migration und die Maturation von Zellen während der Nervenentwicklung steuern. Die Elektroporation ermöglicht die rasche und zielgerichtete Abgabe des Materials in die Zellen durch die Verwendung von elektrischen Impulsen, die transiente Poren in den Zellmembranen erzeugen. Obwohl die Elektroporation traditionell in in vitro Studien verwendet wurde, haben die wissenschaftlichen Fortschritte ihre Verwendung in intakten Organen erweitert, wie diejenigen, die in entwickelnden Mausembryonen in utero gefunden werden.

Dieses Video zeigt die wichtigsten Prinzipien hinter der in utero Elektroporation zusätzlich zu der Überprüfung der grundlegenden chirurgischen Techniken, die erforderlich sind, um entwickelnde Embryonen innerhalb eines schwangeren Nagetieres zugänglich zu machen. Die Einzelheiten der Injektion und die Schritte der Elektroporation werden zusammen mit wichtigen Überlegungen zur gerichteten Genübertragung zu spezifischen Gehirnregionen bereitgestellt. Schließlich werden neurobiologische Anwendungen der in utero Elektroporation vorgestellt, wie zum Beispiel die Untersuchung wie bestimmte Gene zur Nervenentwicklung beitragen und wie sich Verbindungen zwischen den entwickelnden Neuronen bilden.

Procedure

Die in utero Elektroporation ist eine Schlüsselmethode für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die Nervenentwicklung leiten. Durch das Injizieren von DNA, um die Genexpression in spezifischen Regionen des entwickelnden Nagetiergehirns zu verändern, können Forscher die Proliferation, Differenzierung, Migration und Maturation von neuronalen Zellen im Rahmen ihrer natürlichen Umgebung studieren. Dieses Video wird die wichtigsten Grundlagen hinter der in utero Elektroporation zeigen, einen grundlegenden Überblick darüber, wie man die Technik durchführt und deren Anwendung in der neurobiologischen Forschung.

Bevor wir uns darin vertiefen, wie man dieses Verfahren durchführt, wollen wir zunächst einige Grundlagen der Elektroporation besprechen. Dieses Verfahren verwendet elektrische Impulse, die transiente Poren in Zellmembranen erzeugen, so dass DNA in die Zelle eindringen kann. Da die negativ geladene DNA in Richtung der positiven Elektrode wandern wird, können unterschiedliche Zellpopulationen in Abhängigkeit von der Positionierung des elektrischen Feldes adressiert werden.

Obwohl die Elektroporation traditionell in in vitro-Studien verwendet wurde, haben die wissenschaftlichen Fortschritte ihre Verwendung in intakten Organe erweitert, einschließlich solche, die in Mausembyonen in utero gefunden werden.

Die in utero Elektroporation hat im Gegensatz zu einer Zellkultur oder einem ex vivo-Verfahren den Vorteil, dass die transfizierten Zellen weiterhin allen physiologischen Signalen ausgesetzt sind, die die normale Entwicklung leiten. Dies ist besonders wichtig im Gehirn, wo Strukturen wie Axone, Führungssignale von anderen Zellarten erfordern, um sich richtig zu entwickeln.

Insbesondere die Entwicklung des Gehirns involviert einen programmierten Ablauf von Proliferations- und Migrationsvorgängen, was bedeutet, dass unterschiedliche Gewebeschichten basierend des Timings der Elektroporation angezielt werden können.

Schließlich ermöglicht es Forschern, durch die Verfügbarkeit von verschiedenen Arten von Elektroden, auf beide Regionen in der Nähe der Oberfläche sowie auf tiefere Bereiche des Gehirns zuzugreifen. Die Paddelelektroden werden verwendet, wenn oberflächliche Teilen des Gehirns angezielt werden wie der Cortex und der Hippocampus, während kleinere Nadelelektroden verwendet werden wenn tiefe Strukturen wie der Thalamus und der Hypothalamus angezielt werden.

Da wir nun einige grundlegende Prinzipien hinter der Technik diskutiert haben, wollen wir die Vorbereitungen aus dem Weg schaffen, so dass wir uns in den chirurgischen Eingriff und in die in utero Elektroporation vertiefen können.

Zuerst müssen alle Instrumente sterilisiert werden und der OP-Bereich mit 70% Ethanol abgewischt werden. Als nächstes muss eine Injektionslösung hergestellt werden, durch Auflösen von Plasmid-DNA in sterilem PBS, die 0,1% Fast Green enthält. Fast Green wird dazugegeben, um die Visualisierung der Injektionslösung im Embryo zu ermöglichen. Schließlich muss mit einem Nadelzieher eine ultradünne Nadel erzeugt werden, um den Verlust von Fruchtwasser und die anschließende fötale Sterblichkeit zu verringern.

Da wir nun alles vorbereitet haben, wollen wir die grundlegenden Schritte für die Elektroporation von Gehirngewebe bei entwickelnden Nagetieren durchgehen. Zuerst wird mit der Betäubung des schwangeren Muttertieres mit 5% Isofluran begonnen danach wird zu einem Beatmungsrohr, welches 2,25% Isofluran für die Gesamtheit des Verfahrens liefert, gewechselt. Als nächstes wird für die postoperative Schmerzlinderung ein schmerzstillendes Mittel wie Buprenorphin subkutan verabreicht. Danach wird der Bauch rasiert und die Einschnittstelle sterilisiert.

Um den Uterus chirurgisch freizulegen, muss ein vertikaler Schnitt entlang der Mittellinie in die Haut gemacht werden und mit einer Schere schneidet man durch das Peritoneum. Um die Embryonen vom Austrocknen zu hindern, wird die Öffnung mit einer Gaze, die in einer sterilen Kochsalzlösung getränkt ist, abdeckt. Anschließend wird die embryonale Kette sanft aus der Bauchhöhle gezogen, dabei muss sichergestellt werden, dass die Embryonen durch das Abdecken mit einer sterilen, vorgewärmten Kochsalzlösung feucht gehalten werden.

Mit der Verwendung eines Stereomikroskops kann identifiziert werden, dass die Embryos für einen einfachen Zugang zum Gehirn richtig positioniert sind. Mit den Fingern oder einer Pinzette wird der Kopf des Embryos stabilisiert und die DNA-Lösung wird durch die Gebärmutterwand und in das Gehirn injiziert. Eine Elektrode wird auf jeder Seite des Kopfes platziert, mit der positiven Elektrode in der Richtung, in der die DNA elektroporiert werden soll. Nachdem alle geeigneten positionierten Embryonen

elektroporiert wurden, wird das Uterushorn vorsichtig in die Bauchhöhle zurück platziert.

Bevor der Einschnitt geschlossen wird, wird 2-3 ml warme Kochsalzlösung in den Hohlraum hinzugefügt. Das Bauchfell wird mit resorbierbaren Fäden zusammen genäht danach wird die Haut mit Klammern geschlossen. Schließlich wird die Maus in einen Käfig mit einem Heizkissen und einem Monitor transferiert.

Da wir nun besprochen haben, wie man eine in utero Elektroporation ausführt, wollen wir einige folgende Anwendungen dieser Technik untersuchen.

Die in utero Elektroporation ist ein nützliches Tool für die Untersuchung, wie bestimmte Gene zur Nervenentwicklung beitragen. Die elektroporierten Konstrukte können die Überexpression von Wildtyp oder mutierten Proteinen steuern oder die Proteinexpression vollständig blockieren. Die neurologischen Phänotypen können dann entweder auf mikroskopischer oder organismischer Ebene bewertet werden. Zum Beispiel haben diese Experimentatoren festgestellt, das transiente Überexpression des schizophrenie-assoziierten Gens DISC-1 im entwickelndem Mausgehirn zur Überempfindlichkeit gegen Amphetamin im späteren Leben führte.

Die in utero Elektroporation kann auch nützlich sein für die Visualisierung von spezifischen Zellpopulationen und die Verbindungen, die sie eingehen, durch die Bereitstellung von Sequenzen, die kodierte fluoreszierende Proteine in das Nervengewebe liefern. Beispielsweise haben diese Experimentatoren das grün fluoreszierende Protein-Gen in die E13.5 Retinae elektroporiert, um die retinale Ganglienzellen oder RGCs zu untersuchen, die visuelle Informationen vom Auge zum Gehirn übertragen. Die Untersuchung der Netzhaut bei E18.5 zeigt, wie diese Technik verwendet werden kann, um den Weg des RGC Axons durch den Sehnerv, des Chiasmas und des Tractus opticus zu verfolgen.

Schließlich treten viele wichtige Ereignisse in der neuralen Entwicklung nach der Geburt auf, dies inspirierte Wissenschaftler, eine modifizierte Technik, die in vivo Elektroporation genannt wird, zu entwickeln. Dieses Verfahren folgt den gleichen grundlegenden Schritten wie bei der in utero Elektroporation, aber sie wird in der Regel innerhalb der ersten paar Tage nach der Geburt durchgeführt. Die postnatale Genmanipulation ist besonders nützlich für die Untersuchung von später geborenen Zelltypen, wie diese, die hier gezeigt werden, die innerhalb des Riechkolbens gefunden werden.

Das war das JoVE Video zu der in utero Elektroporation. Dieses Video enthält die wesentlichen Grundlagen und einen grundlegenden Überblick darüber, wie die in utero Elektroporation durchgeführt wird, sowie ein paar folgende Anwendungen, die es den Forschern ermöglichen, die molekularen Mechanismen, die die Nervenentwicklung steuern, zu untersuchen. Danke für das Aufpassen!

Transcript

In utero electroporation is a key technique for studying the molecular mechanisms that guide neurodevelopment. By injecting DNA to alter gene expression in specific regions of the developing rodent brain, researchers can study the proliferation, differentiation, migration, and maturation of neural cells in the context of their natural environment.

This video will introduce the key principles behind in utero electroporation, a basic overview on how to perform the technique, and its applications in neurobiology research.

Before we delve into how to perform this procedure, lets first go over some principles of electroporation. This procedure utilizes electrical pulses that create transient pores in cell membranes, allowing DNA to enter the cell. Since the negatively charged DNA will move towards the positive electrode, different cell populations can be targeted depending on the positioning of the electric field.

Though electroporation has traditionally been used in in vitro studies, scientific advancements have broadened its utilization to intact organs, including those found in mouse embryos developing in utero.

In utero electroporation, unlike cell culture or ex vivo techniques, has the advantage that transfected cells will continue to be exposed to all the physiological cues that guide normal development. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types in order to develop properly.

Brain development in particular involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning that different tissue layers can be targeted based on the timing of electroporation.

Lastly, the availability of different types of electrodes allows researchers to access both regions near the surface of the brain as well as deeper areas. Paddle electrodes are used when targeting superficial parts of the brain, such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes are used when targeting deep structures like the thalamus and hypothalamus.

Now that we have discussed some basic principles behind the technique, lets get our preparations out of the way so we can delve into the surgical procedure and in utero electroporation.

First, sterilize all instruments and wipe down the surgical area with 70% ethanol. Next, make an injection solution by dissolving plasmid DNA in sterile PBS containing 0.1% Fast Green. The Fast Green is added to allow for visualization of injection solution in the embryo. Lastly, using a needle puller, an ultra thin needle must be created to reduce the loss of amniotic fluid and subsequent fetal mortality.

Now that we have everything prepared, lets go over the basic steps for electroporating brain tissue in developing rodents. Start by anesthetizing a pregnant dam using 5% isoflurane then transferring it to a respirator tube delivering 2.25% isoflurane for the entirety of the procedure. Next, for postoperative pain relief, deliver an analgesic like buprenorphine subcutaneously. Then shave the abdomen and sterilize the incision site.

To surgically expose the uterus, make a vertical incision along the midline in the skin and, using scissors, cut through the peritoneum. To prevent the embryos from drying out, cover the opening with sterile saline soaked gauze. Next, gently pull the embryonic chain out of the abdominal cavity being sure to keep the embryos wet by covering with sterile pre-warmed saline.

Using a dissection microscope, identify embryos properly positioned for easy access to the brain. Using your fingers or forceps stabilize the head of the embryo and inject the DNA solution through the uterine wall and into the brain. Place an electrode on each side of the head, with the positive electrode in the direction to which you want the DNA electroporated. Once all appropriately positioned embryos are electroporated, carefully place the uterine horn back into the abdominal cavity.

Before closing the incision, add 2 – 3 ml of warm saline to the cavity. Sew the peritoneum together with absorbable sutures, then close the skin using staples. Lastly, transfer the mouse to a cage with a heating pad and monitor.

Now that we have gone over how to perform in utero electroporation, lets examine some downstream applications of this technique.

In utero electroporation is a useful tool for investigating how specific genes contribute to neural development. Electroporated constructs can guide overexpression of wildtype or mutant proteins or block protein expression completely. Neurological phenotypes can then be assessed at either the microscopic or organismal level. For example, these experimenters determined that transient overexpression of the schizophrenia-associated gene, DISC-1 in the developing mouse brain, resulted in hypersensitivity to amphetamine later in life.

In utero electroporation can also be useful for visualizing specific cell populations and the connections they make by delivering sequences encoding fluorescent proteins into neural tissue. For example, these experimenters electroporated the green fluorescent protein gene into E13.5 retinas to study retinal ganglion cells, or RGCs, which transmit visual information from the eye to the brain. Examination of retinas at E18.5 shows how this technique can be used to trace the path of the RGC axon through the optic nerve, optic chiasm, and optic tract.

Finally, many important events in neural development occur after birth, inspiring scientists to develop a modified technique called in vivo electroporation. This procedure follows the same basic steps as in utero electroporation, but it is usually performed within the first few days following birth. Postnatal genetic manipulation is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb shown here.

You’ve just watched JoVE’s video on in utero electroporation. This video contained key principles and a basic overview on how to perform in utero electroporation, as well as a few downstream applications that allow researchers to investigate the molecular mechanisms that guide neurodevelopment.

Thanks for watching!