Visualisierung nichtlytischen Exozytose Cryptococcus neoformans Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die nicht-litische Exozytose von Kryptococcus neoformans aus primären Makrophagen von Knochenmarkneuronen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem aktivierte Neuromakrophagen zunächst mit Pilzzellen plattiert und infiziert werden, um eine Phagozytose und Internalisierung von Xeomin zu ermöglichen. Der zweite Schritt besteht darin, extrazelluläre Pilzzellen zu entfernen, um eine klare Monoschicht aus infizierten und nicht infizierten Makrophagen zu gewährleisten.

Als nächstes werden Makrophagen in einer klimakontrollierten Kohlendioxidkammer inkubiert und 24 Stunden lang aufgezeichnet, um Fälle von nicht-litischer Exozytose und anderen Wechselwirkungen zu erfassen. Der letzte Schritt besteht darin, einen Film zu erstellen, indem alle Bilder, die in einem Zeitraum von 24 Stunden erstellt wurden, komprimiert werden. Letztendlich wird die Makrophagen-Visualisierung mit digitaler Lichtmikroskopie verwendet, um die Vielfalt der nicht-litischen Exozytosetypen zu beobachten, denen Makrophagen während einer 24-Stunden-Infektion ausgesetzt sind.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Interaktion zwischen Wirtserregern zu beantworten, wie z. B. den Zeitpunkt und die Quantifizierung zellulärer Ereignisse. Am Tag vor dem Experiment wird eine einzelne Kolonie des Obermeisters ausgewählt, die auf einer Sbarro-Agar-Platte gezüchtet wurde, und 10 Milliliter Sbarro-Brühe geimpft. Lassen Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen und schütteln Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 250 U/min nach der Euthanasie von Mäusen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Sterilisieren Sie den gesamten Körper mit 70%igem Ethylalkohol. Entfernen Sie sowohl den Oberschenkelknochen als auch das Schienbein und legen Sie die Knochen in sterile Duos, modifiziertes Eagle Medium oder DMEM. Entfernen Sie dann überschüssiges Gewebe und Muskeln mit feinen Tüchern, bis die Knochen vollständig sauber sind.

Legen Sie nur intakte Knochen in eine Petrischale, die 70 % Ethylalkohol enthält, und inkubieren Sie sie drei Minuten lang, um assoziierte Mikroorganismen abzutöten. Entfernen Sie die Knochen und geben Sie sie in eine Petrischale mit sterilem DMEM. Schneide dann vorsichtig die Enden der Knochen ab.

Halten Sie den Knochen über ein konisches MT-Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 Litern, das auf Eis gestellt wird, und spülen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel vorsichtig 10 Milliliter kaltes DMEM durch jeden Knochen. Zentrifugieren Sie dann die gesammelte Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 650 mal G. Während dieser Zentrifugation sterilisieren Sie Knochenmarkmakrophagen-Ernährungsmedien, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes suspendieren Sie die resultierende Palette mit 10 Millilitern Zuführmedium.

Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb, um Zellklumpen aufzubrechen und große Ablagerungen zu entfernen. Dann wird ein Milliliter der Dehnungszellsuspension in 10 Milliliter Fütterungsmedium, Petrischale, gefüllt, die für die Verwendung in Gewebekulturen spezifiziert sind. Lassen Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 10 % Kohlendioxid anhaften.

Wechsel des Fütterungsmediums wie im Textprotokoll beschrieben am Tag vor dem Experiment. Trennen Sie die Makrophagen von der Platte, indem Sie das Fütterungsmedium entfernen und fünf Milliliter eines schonenden Zellstripping-Reagenzes auf die Platte geben, nachdem die Zellen fünf bis 10 Minuten lang inkubiert wurden. Bei 37 Grad Celsius entnehmen Sie die Makrophagen durch schonendes Pipettieren.

Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 650 mal G für 10 Minuten pelletiert, bevor das Pellet in einem Milliliter Zuführmedium gebogen wird. Berechnen Sie mit einer Verdünnung von eins bis 20 die Konzentration der Makrophagen, indem Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer pipettieren und dabei einen 14-Millimeter-Glasboden verwenden. Petrischalen platzieren eine Konzentration von einem mal 10 bis dem fünften Makrophagen direkt in die innere Vertiefung, die maximal 200 Mikroliter fasst.

Achten Sie darauf, diese Lautstärke nicht zu überschreiten. Lassen Sie die Zellen an der Petrischale aus Glas haften, indem Sie die Schalen für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator stellen. Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter Fütterungsmedium hinzu, das mit Lipopolysaccharid in einer Menge von einem Milligramm pro Milliliter und Interferon-Gamma ergänzt ist.

Lassen Sie die Zellen bei 500 Einheiten pro Milliliter am Tag des Experiments über Nacht inkubieren. Entnehmen Sie einen Milliliter einer über Nacht inokulierten G-Zellkultur und paltieren Sie die Hefezellen durch Zentrifugation für fünf Minuten G.To 420 Mal, entfernen Sie Medien und extrazelluläre Kryptokokkenprodukte, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, gefolgt von einer Zentrifugation wie zuvor. Nach der Reanimation wird das Hefezellpellet in einem Milliliter sterilem PBS suspendiert und eine Pipette von einer bis 100 Verdünnung durchgeführt, 10 Mikroliter der Verdünnung in ein Hämozytometer gegeben und die Zellen gezählt.

Berechnen Sie die Konzentration von Hefezellen, die für eine Vielzahl von Infektionen von eins bis fünf benötigt wird. Das berechnete Volumen der Kryptokokken-Zellsuspension wird zu einem Milliliter des Ernährungsmediums mit dem monoklonalen Antikörper 18 B seven in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter gegeben. Inkubieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nehmen Sie anschließend das Fütterungsmedium aus der Petrischale aus Glas und waschen Sie die Makrophagen einmal mit sterilem PBS. Geben Sie dann 100 Mikroliter Opsonize Cmin direkt in die Vertiefung, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation mit der Hefe bei 37 Grad Celsius und 10% Kohlendioxid-Seite. Nach der Ko-Inkubation, die mit dem Mikroskop überprüft wurde, ob die Makrophagen internalisierte Formen haben, die als internalisiert angesehen werden können, sollten Kryptokokkenzellen innerhalb der Grenzen der Makrophagen deutlich zu sehen sein, wie durch die große Pfeilspitze angezeigt.

Die kleinere Pfeilspitze zeigt einen nicht infizierten Makrophagen ohne Pilzzellen. Waschen Sie die Petrischale dreimal mit sterilem PBS, um alle extrazellulären c-Neoformane zu entfernen. Fügen Sie dann ein bis zwei Milliliter Fütterungsmedium ohne den monoklonalen Antikörper hinzu, um diese Experimente durchzuführen.

Vor dem Experiment ist ein Mikroskop erforderlich, das mit einer angeschlossenen Inkubationskammer ausgestattet ist, die eine Kohlendioxidabgabe und eine Heizeinheit umfasst. Die Inkubationskammer mindestens 30 Minuten auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Stellen Sie sicher, dass die Kohlendioxideinheit zu Beginn des Experiments 5 % anzeigt.

Platzieren Sie die Petrischale mit Glasboden auf der Abdeckung der Mikroskopplattform, bei der Kohlendioxid leuchtet, und schließen Sie alle Türen, um sicherzustellen, dass keine Wärme entweicht. Verwenden Sie das 10-fach-Objektiv mit dem Mikroskop im Phasenkontrast, fokussieren Sie sich auf ein klares Feld infizierter Makrophagen. Richten Sie die Mikroskopsoftware so ein, dass sie über einen Zeitraum von 24 Stunden alle vier Minuten ein Bild aufnimmt. Nach 24 Stunden ist das Experiment abgeschlossen und es wurden insgesamt 361 Bilder gesammelt. Exportieren Sie diese Bilder als JPEGs mit einer Komprimierung von 5 %.

Mit der Image J-Software können Sie die Bilder als visuellen Stapel mit fünf Bildern pro Sekunde anzeigen. Das erste Bild des Films zeigt viele Makrophagen auf dem gesamten Feld, von denen einige nicht infiziert sind und andere unterschiedliche Mengen an Kryptokokkenzellen haben. Im Laufe des Films sind die Zellen alle mo und man kann sehen, wie sie sich in diesem Film über das Feld bewegen, es ist klar, dass sich die Kryptokokkenzellen innerhalb der Grenzen eines infizierten Makrophagen befinden.

Der Makrophage wird unruhig und eine Hefezelle ist zu sehen, aber innerhalb der FGA-Zone werden Kryptokokkenzellen dann schnell in die Umgebung ausgelöscht. Ein zweiter infizierter Makrophage durchläuft eine nicht-litische Exozytose und mehr Hefezellen werden in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die Wirtszellen bleiben nach der Kryptokokken-Exozytose lebensfähig, was sich in ihrer Fähigkeit zeigt, sich weiter zu bewegen.

Gelegentlich interagieren Makrophagen auf eine Weise, die den Transfer von Kryptokokkenzellen zwischen Wirtszellen erleichtert. Die Hefezellen sind nicht der extrazellulären Umgebung ausgesetzt und die Wirtszellen bleiben lebensfähig. In diesem Film bilden zwei infizierte Makrophagen bei zwei verschiedenen Gelegenheiten Zell-zu-Zell-Brücken, um Kryptokokkenzellen von einem Makrophagen zum anderen zu transportieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die digitale Lichtmikroskopie nutzen können, um Makrophagen zu visualisieren, die sich einer nicht-lytischen Exozytose unterziehen, und andere Interaktionen zwischen Wirtspathogenen.