Name: Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kryokonservierung humaner Amnion-Epithelzellen nach cGMP-Richtlinien. Diese tierproduktfreie Methode ermöglicht klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Die Autoren danken für ihre finanzielle Unterstützung durch das Operational Infrastructure Support Program der Regierung von Victoria.

HINWEIS: Plazenten sollte von Singleton gesunde Schwangerschaft gesammelt werden, mit einer Vorliebe für tigen Kaiserschnitt Abschnitte. Geschrieben sollte informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta gegeben werden. Ihre einschlägigen Menschen Forschung Ethik-Kommission sollte die Genehmigung alle Sammlung und Verwendung von menschlichen Geweben. 1. Isolierung von Amnion Epithelzellen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Legen Sie die Plazenta auf eine sterile Oberfläche innerhalb einer Klasse II Sicherheitswerkbank. </li><li> Verwendung steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), wasche die so viel Blut wie möglich aus der Plazenta Oberfläche und Membranen. </li><li> Mit der Plazenta mit der Nabelschnur nach oben eingelegt, mechanisch trennen den äußeren Rand der Amnion und Chorion Membranen. </li><li> Einmal getrennt, manuell die Amnionmembran Streifen aus dem Chorion Membran der Plazenta, die rund um die Kante der Membran in Richtung der Nabelschnur. HINWEIS: Tö Beul, alle Stücke von verunreinigenden Chorion Membran aus dem Amnion zu entfernen. </li><li> Mit Hilfe einer sterilen Schere, schneiden Sie die Amnionmembran ca. 2 cm von der Basis der Nabelschnur und in einen 500-ml verschlossenen Behälter mit 250 ml HBSS. </li><li> Gründlich durch Schütteln des verschlossenen Flasche, die die Amnionmembran waschen. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran aus dem Auffangbehälter mit einer sterilen Pinzette und Ort in eine 15 cm Petrischale. </li><li> Schneiden Sie die Amnionmembran in ca. 5 cm lang (bei vertikal mit einer Pinzette gehalten) Stücke, Verwerfen blutiger oder Papierreste. </li><li> Platz in einem 500 ml verschlossenen Behälter und wäscht mit 250 ml HBSS etwa 3-5 mal, oder bis die Amnionmembran durchscheinend ohne gefährdend Blut. HINWEIS: Jede Blut kann die Effizienz der enzymatischen reduzieren Abbaulösung. </li><li> Übertragen Sie alle Stücke von Amnionmembran in einen Behälter mit 50 ml der enzymatischen Abbaulösung, wobei darauf zuminimieren Trag von HBSS. </li><li> Inkubieren Sie die Amnion Stücke in enzymatischen Abbaulösung im Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln, um alle verbleibenden Blut zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aus der enzymatischen Abbaulösung und in einen neuen sterilen Behälter. </li><li> 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in den Amnionmembran und bei 37 ° C für 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum unter leichtem Schütteln (erste Verdauung). </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen. ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. </li><li> 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in der Amnionmembran Stücke und Inkubation 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (zweite Verdauung). </li><li> Übergeben Sie die Zellschutzsperreauf aus Schritt 1.14 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten. HINWEIS: In diesem Stadium Zellen auf Eis gelassen werden, bis die Zellen von der zweiten Digest sind im gleichen Stadium der Verarbeitung. </li><li> Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen. ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.18 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Gently wiederholt pipettieren mit einer 1 ml pipette um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Pool-Zellen aus den beiden verdaut, oder alternativ halten Zelle verdaut, getrennt, bis nach der Zellzahl. HINWEIS: Dies verhindert, dass das Mischen von potenziell geringen Lebensfähigkeit Zellen mit hoher Tragfähigkeit Zellen. </li><li> Hinzufügen HBSS auf ein Endvolumen von 10-20 ml und führen Zellzahlen unter Verwendung von Trypanblau zur Rentabilität zu messen. </li><li> Bestätigen Sie den epithelialen Zell-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie. Make up geeigneten Antikörper-Cocktails mit anti-EpCAM-PE (1: 2 Verdünnung) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) und anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS. </li><li> Resuspendieren eine Untergruppe von Zellen von einer oder beiden Digests in der Antikörpermischung in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Für die Durchflusszytometrie Fleck 1 x 10 6 Zellen mit Antikörper-Cocktails, die Isotypkontrollen (z. IgG1 Isotyp-Kontroll-PE + Anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Halten ~ 1 x 10 6 Zellen ungefärbt für Durchflusszytometer Set-up. </li><li> Zellen in Antikörper-InkubationCocktails bei 4 ° C für 60 min. </li><li> Wasche die Zellen 3x in HBSS resuspendieren bei 5 bis 10 Millionen Zellen pro ml für die Durchflusszytometrie. </li><li> Führen Durchflusszytometrie und Anmerkungs Ergebnisse. Die Reinheit des Zell Isolat (der Prozentsatz der EpCAM-positive und CD90 / CD105-negativen Zellen) wird erwartet, dass 90 bis 95% und &lt;1% betragen. </li><li> Beiseite eine geeignete Anzahl von Zellen für den Test geeignete Qualitätskontrolle oder Freigabekriterien wie Endanwendung bestimmt. Hinweis: das kann Krankheit / Virus Screening oder andere Sicherheit oder biologischen Kriterien umfassen. </li><li> Für die übrigen Zellen, folgen Sie der Kryokonservierungsprotokolls oder alternativ direkt in die Kultur (direkt an Kultur Schritt 3.6). </li></ol> 2. Kryokonservierung von hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Durchflusszytometrie Daten oder manuelle Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zells von 1-10 Millionen Zellen pro ml in Tierproduktfreien Kryokonservierung Medien. </li><li> Pipettieren ein geeignetes Volumen der Zellen in die O-Ring-Kryokonservierung Fläschchen aufnehmen und in einer kontrollierten Rate Gefriervorrichtung, wo die Abkühlung tritt bei etwa 1 ° C / min bis -80 ° C erreicht wird. </li><li> Übertragen Fläschchen in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. </li></ol> 3. Auftauen und Kultur Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Entfernen Kryokonservierung Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und legen auf Eis. HINWEIS: Für die Übertragung nur - schnell weiter zum nächsten Schritt. </li><li> Auftauen Kryokonservierung Ampullen schnell bei 37 ° C, bis nur noch ein kleines Stück (~ 5 mm x 5 mm) des Eises verbleibt. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zelllösung nicht erwärmt, um die toxischen Wirkungen von DMSO bei der Kryokonservierung Medien reduzieren. </li><li> Verdünne Kryokonservierung Medium 10-fach mit kaltem (ca. 4 ° C) serumfreien Medien, tropfenweise in einer geeigneten Größed Rohr oder Behälter. </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min bei RT. </li><li> Ein Resuspendieren in serumfreien Medium, um eine ungefähre Konzentration von 1 Million Zellen pro ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. Erwartete Lebensfähigkeit nach dem Auftauen werden 5-10% weniger als vor der Kryokonservierung Lebensfähigkeit. </li><li> Plattenzellen auf Standard-Zellkultur behandelten Kunststoffwaren, oder alternativ Typ-I-Kollagen zu beschichten Kulturoberflächen. </li><li> Für Typ-I-Collagen-Beschichtung folgen das Protokoll unter <ol><li> Bereiten säurelöslichem Kollagen Typ I aus der menschlichen Plazenta (15 mg Kollagen mit 25 ml entionisiertem Wasser und 50 ul Eisessig). </li><li> Bedeckung Becherglas mit Parafilm und rühren mäßig bei 37 ° C bis Kollagenstränge gelöst sind. </li><li> Sterile Filtercollagenlösung unter Verwendung einer 0,22 um-Filter. </li><li> Verdünnen Sie die gefilterten Kollagen Lager 01.10 mit VE-Wasser. Diese verdünnte Lager ist die Arbeits concentration Lösung für die Beschichtung von Kunststoff-und Membranoberflächen. </li><li> Kollagen-Kunststoff, Glas und Membranoberflächen für 2 h bei RT bei 37 ° C oder O / N bei 2-8 ° C. </li><li> Entfernen überschüssiger Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche, und lassen Sie sie O / N trocknen. </li><li> Spülen Sie mit sterilen Gewebekultur-Wasser oder HBSS vor der Einführung von Zellen und Medium. </li></ol></li><li> Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und ermöglichen die Befestigung an für 72-96 h auf. </li><li> Nach Anlegen Verändern Medien durch vorsichtiges Ansaugen und Ersetzen mit einem geeigneten Volumen an Serum-freies Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Passage-Zellen mit dem untenstehenden Protokoll <ol><li> Absaugen von Zellkulturmedien und wäscht mit 1x Volumen an sterilem HBSS </li><li> Hinzufügen 1x Volumen von enzymatischen Abbaulösung und Inkubation für 5-15 Minuten oder bis Zellen beobachtet Ablösen von der Zellkulturoberfläche. </li><li> Sammeln enzymatische Verdauung Lösung, die Zellen, die Gewährleistung cells werden aus der Zellkulturoberfläche durch wiederholtes Pipettieren des enzymatischen Aufschlußlösung vor der Zellkulturoberfläche abgelöst </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Zellpellet in einem geeigneten Volumen an HBSS mit 1 mg / ml Sojabohnenbasis Enzyminhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Serumfreies Medium hinzuzufügen einer ungefähren Konzentration von 1 Million Zellen / ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und mit Standardkultivierungsverfahren fortzusetzen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Es gibt mehrere kritische Parameter, die erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg dieser Methode haben können. Speicherung der Plazenta oder Amnion für 3 h vor der Isolierung hAECs kann logistischer oder Planungszwecke wünschenswert sein, es wird jedoch empfohlen, dass das Gewebe so schnell wie möglich verarbeitet werden. Wenn Gewebe gelagert werden soll, ist es empfehlenswert, dass der Lagerung nach der Präparation und Waschen der Amnionmembran geführt werden. Amnion in sterile HBSS mit Antibiotika bei 4 ° C gelagert wer...

Zellen von perinatalen Quellen, wie Plazenta, Plazentamembranen, Nabelschnur und Fruchtwasser abgeleitet haben die Aufmerksamkeit von Forschern und Klinikern als potentielle Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1,2 angezogen. Der Grund für dieses Interesse ist, dass diese Zelltypen besitzen alle ein gewisses Maß an Plastizität und immunmodulatorische Fähigkeit 3, Eigenschaften, die von grundlegender Bedeutung für ihre mögliche therapeutische Anwendungen geeignet sind. hAECs sind eine heterogene Population Epithelzellen, die aus Laufzeit oder vorzeitigen Amnionmembran 4 abgeleitet werden kann, wodurch ein reichliches potentielle Quelle für regenerative Zellmaterial. Die Eigenschaften, die hAECs ansprechend als Zelltherapie machen gehören ihrer Multi, geringe Immunogenität und entzündungshemmende Eigenschaften. hAECs gefunden wurden hochmulti sowohl in vitro als auch in vivo, zur Differenzierung zu mesodermalen Abstammungslinien zu sein (cardiomyocytes, Muskelzellen, Knochenzellen, Fettzellen), endodermalen Linien (Bauchspeicheldrüsenzellen, Leberzellen, Lungenzellen) und ektodermalen Linien (Haare, Haut, Nervenzellen und Astrozyten) 5-10. Beruhigend, trotz ihrer Multipotenz hAECs Sie nicht, entweder Form Tumoren erscheinen oder zu fördern Tumorentwicklung in vivo. Darüber hinaus sind auch hAECs Immun privilegierten, zum Ausdruck geringe Klasse II Human-Leukozyten-Antigene (HLA) 8. Diese Eigenschaft wahrscheinlich zugrunde ihre Fähigkeit, Immunabstoßung nach allogener und xenogener Transplantation zu entgehen, wie in Studien mit immunkompetenten Affen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Schweine von 11 bis 13 gezeigt. hAECs anzuzeigen potente immunmodulatorische und immunsuppressive Eigenschaften und bieten somit erhebliche praktische Vorteile für potentielle klinische Anwendungen bei Autoimmunerkrankungen Therapie. hAECs sind vermutlich immunmodulatorische Funktionen sowohl auf der angeborenen und adaptiven Immunsystem auszuüben. Aufe der Mechanismen vorgeschlagen, ist durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren 14. Aktuelle Anwendungen der hAECs in vorklinischen Tierkrankheitsmodellen gehören die Behandlung von Schlaganfall, Multiple Sklerose, Lebererkrankungen, Diabetes und chronischen und akuten Lungenerkrankungen. Forscher haben Interesse an der Nutzung hAECs um nach Schlaganfall Gehirn Entzündung aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften gezeigt. Es gibt Hinweise darauf, dass hAECs die Blut-Hirn-Schranke, wo sie engraft überqueren können, überleben für bis zu 60 Tage, zu differenzieren zu Neuronen, verringern Entzündungen und fördern Regeneration geschädigter Gewebe des zentralen Nervensystems in Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 15. hAECs bieten die Möglichkeit, gezielt und Rückwärts mehrere pathologische Wege, die zu der Entwicklung und Progression von Multipler Sklerose bei. Beispielsweise ergibt sich aus der präklinischen Tierstudien legen nahe, dass hAECs stark immunsuppressive undpotenziell induzieren peripheren Immuntoleranz und Reverse laufenden Entzündungsreaktionen. hAECs haben auch gezeigt, dass die Fähigkeit, in vivo in neurale Zellen zu differenzieren und zu verbessern endogenen Neuroregeneration durch die Sekretion einer Vielzahl von neurotrophen Faktoren 16 haben. Mensch und Nager Amnion Epithelzellen haben bereits ihre therapeutische Wirksamkeit nachgewiesen für die Behandlung von Lebererkrankungen in Tiermodellen. In einem Tetrachlorkohlenstoff Schäden Induktions Modell einer Lebererkrankung, HAEC Transplantation führen zur Verpflanzung von lebensfähigen hAECs in der Leber, in Begleitung mit reduzierter Hepatozyten Apoptose und Verminderung der Leberentzündung und Fibrose 17. hAECs kann ausgedrückt Pankreas Faktoren, einschließlich Insulin und Glucose-Transporter stimuliert werden. Mehrere Studien haben das Potenzial für hAECs den Blutglucosespiegel in diabetischen Mäusen 18 wiederherzustellen sucht. In Mäusen, diehAECs verringerte beide Tierkörpergewicht und den Blutzuckerspiegel auf ein normales Niveau nach der Injektion von Zellen. Diese Studien stellen ein starkes Argument für den Einsatz von hAECs zur Behandlung von Diabetes mellitus. hAECs haben eine nachgewiesene Rolle bei der Prävention und Reparatur von experimentellen akuten und chronischen Lungenschädigung in Erwachsenen und Neugeborenen-Modelle 19. Diese Studien zeigten, dass hAECs Differenzierung in vitro in funktionaler Lungenepithelzellen exprimieren multiple Lungen-assoziierten Proteine, einschließlich Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), des Ionenkanals, die bei Patienten mit zystischer Fibrose 20 mutiert ist. Außerdem, wenn hAECs an den verletzten Erwachsenen und Neugeborenen Lunge zugeführt, die reparative Wirkungen auszuüben sie über die Modulation der Immunzellen, wodurch Lungen Leukozytenrekrutierung, einschließlich Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten 21-23. Angesichts ihrer Hülle und Fülle,Sicherheitsbilanz und bewährte klinische Anwendungen für mehrere Krankheiten, klinische Studien mit hAECs ist unvermeidlich. Mit dem Ziel, beschleunigte Umsetzung HAEC Therapien in klinischen Studien-entwickelten wir Methoden, um in einer für die klinischen Studien Weise zu isolieren, Kryokonservierung und Kultur hAECs mit Tierproduktfreien Reagenzien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) Leitlinien . Wir basieren diesem Protokoll eine zuvor veröffentlichte Protokoll, das wir erfolgreich verwendet haben, um hAECs Verwendung von Tieren stammenden Reagenzien 6 zu isolieren. Wir veränderten das ursprüngliche Protokoll an Tieren stammenden Produkte mit tierischen Erzeugnissen freien Reagenzien zu ersetzen, und die anschließende Optimierung durchgeführt, um die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit zu optimieren. Unser Ziel war es, ein Protokoll, das mit regulatorischen Standards für Zellfertigung für den menschlichen klinischen Studien erfüllen zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Entnahmeset</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abstreiftablett</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Verbandzange, spitz 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schere - Scharf/stumpf gerade</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Latexhandschuhe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schutzkleidung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schutzkleidung (Kittel)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolationskittel</td><td>U-Linie</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Latexhandschuhe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Gesichtsmaske</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Motorhauben</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Schuhüberzieher</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Medien und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>ohne Calcium oder</td></tr><tr><td>Magnesium TrypZean (tierisches Produkt&ndash; Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor&nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-Isotyp Kontrolle</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-Isotypkontrolle</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-Isotypkontrolle</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr> Verbrauchsmaterial <tr><td>50 ml Messpipette</td><td></td><td></td> BD/Falcon 356550 <td></td></tr><tr><td>10 ml Messpipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Messpipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Röhrchen</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td></td> 15 ml Falkenröhrchen BD/Falcon 352096 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petrischalen</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 μm; m Filter</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipettenspitzen</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Wiegeschiff</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Schrank <td></td><td></td><td></td><td>für biologische Gefahrstoffe</td></tr></tbody></table>

isolation, kryokonservierung und kultur der menschen amnion epithelzellen für klinische anwendungen

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Humane Amnion-Epithelzellen (hAECs), die aus Termin- oder Frühgeborenen-Amnionenmembranen gewonnen wurden, haben die Aufmerksamkeit von Forschern und Klinikern als potenzielle Quelle von Zellen für die regenerative Medizin auf sich gezogen. Der Grund für dieses Interesse ist der Nachweis, dass diese Zellen eine hohe multipotente Differenzierungsfähigkeit, eine geringe Immunogenität und entzündungshemmende Funktionen aufweisen. Diese Eigenschaften haben Forscher dazu veranlasst, das Potenzial von hAECs zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten und Störungen in präklinischen Tierversuchen mit großem Erfolg zu untersuchen.
hAECs haben eine breite Anwendung für die Behandlung einer Reihe von Krankheiten und Störungen gefunden. Zu den potenziellen klinischen Anwendungen von hAECs gehören die Behandlung von Schlaganfall, Multipler Sklerose, Lebererkrankungen, Diabetes sowie chronischen und akuten Lungenerkrankungen. Der Übergang von präklinischen Tierversuchen zu klinischen Studien erfordert einen höheren Standard an Qualitätskontrolle und Sicherheit für Zelltherapieprodukte. Aus Sicherheits- und Qualitätskontrollerwägungen wird bevorzugt, dass Zellisolationsprotokolle Reagenzien ohne tierische Produkte verwenden. 
Wir haben Protokolle entwickelt, die es Forschern ermöglichen, hAECs mit tierischen Reagenzien zu isolieren, zu kryokonservieren und zu kultivieren. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass diese Zellen isoliert, charakterisiert, kryokonserviert und kultiviert werden können, ohne das Risiko, potenziell schädliche tierische Krankheitserreger an den Menschen abzugeben, während gleichzeitig geeignete Zellausbeuten, Lebensfähigkeit und Wachstumspotenzial erhalten bleiben. Für Forscher, die von präklinischen Tierversuchen zu klinischen Studien übergehen, werden diese Methoden die behördliche Zulassung erheblich beschleunigen, Risiken verringern und die Qualität ihrer therapeutischen Zellpopulation verbessern.

Wenn dieses Verfahren korrekt befolgt, sollte ein Durchschnittsertrag von 120 Millionen hAECs rechnen, wobei ein typischer Bereich von 80-160 Millionen Zellen. Aus diesen Erträgen kann eine durchschnittliche Überlebensfähigkeit von 83 ± 4% zu erwarten. Der erhöhte mittlere Ausbeute und einer etwas niedrigeren Lebensfähigkeit im klinischen Verfahren kann aufgrund der höheren Trypsin-Aktivität als die von Tieren stammenden Produkt aufgrund des Fehlens von Serumproteinen ist, und vielleicht auch. Isolierte hAECs eine durch...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von humanen Amnionenepithelzellen (hAECs) unter Verwendung von Reagenzien ohne tierische Produkte in Übereinstimmung mit den aktuellen Richtlinien der guten Herstellungspraxis (cGMP).

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Epithelzellpopulation aus einer humanen Amnionenmembran zu isolieren. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst die Amnionenmembran von der Korionenmembran und der Plazenta entfernt wird. Die Amnionenmembran wird von allen Spuren von Blut gewaschen und dann mit einer tierischen Produkt-freien Trypsin-Enzymlösung verdaut.Im letzten Schritt wird die Gewebeaufschlämmung filtriert, um die isolierten Epithelzellen zu sammeln. Letztendlich kann die Reinheit der Amnionenepithelzellpopulation durch durchflusszytometrische Analyse beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Zellen nicht tierischen Produkten ausgesetzt werden müssen, was bedeutet, dass diese Zellen für klinische Studien nützlich sind.Um die Amnionen-Epithelzellen zu isolieren, wird die Plazenta zunächst auf eine sterile Oberfläche in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse zwei gelegt. Verwenden Sie dann steriles HBSS, um so viel Blut wie möglich von der Plazentaoberfläche zu waschen. Positionieren Sie als Nächstes die Plazenta so, dass die Nabelschnur und die Plazentamembranen nach oben zeigen, und entfernen Sie die Amnionenmembran manuell von der Corionmembran der Plazenta, indem Sie um den Rand der Membran herum in Richtung Nabelschnur arbeiten.Achten Sie darauf, alle Stücke der kontaminierenden Korionenmembran aus dem Amnion zu entfernen, und schneiden Sie dann mit einer sterilen Schere die Amnionenmembran etwa zwei Zentimeter von der Basis der Nabelschnur entfernt ab und legen Sie die Membran in einen 500-Milliliter-Behälter mit 250 Millilitern HBSS, verschließen Sie den Behälter und schütteln Sie ihn gründlich, um das Gewebe zu waschen. und dann mit einer sterilen Pinzette die Membran in eine 15 Zentimeter große Petrischale übertragen. Schneiden Sie nun die Membran in fünf Zentimeter lange, vertikale Stücke und waschen Sie die Stücke drei bis fünf weitere Male, wie gerade gezeigt, bis die Membran durchscheinend ist und kein verunreinigendes Blut mehr vorhanden ist. Wenn das gesamte Blut entfernt wurde, übertragen Sie die Gewebestücke in 50 Milliliter enzymatische Verdauungslösung, nehmen Sie ker, um die Verschleppung von HBSS zu minimieren, und inkubieren Sie das Amnionengewebe in einem warmen Raum bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren, um das restliche Blut nach 15 Minuten zu entfernen, ziehen Sie jedes Stück entlang des inneren Randes des Behälters, um die alte Verdauungslösung abzulassen, und fügen Sie die Stücke hinzu 100 Milliliter frische enzymatische Aufschlusslösung.Nach einer Stunde Verdauung unter den gleichen Bedingungen werden die Membranen in einen neuen Behälter mit enzymatischer Aufschlusslösung überführt. Achten Sie darauf, das Gewebe zu entleeren, wie gerade gezeigt, und rühren Sie die Membranen für die letzten 60 Minuten nach der zweiten Verdauung sanft auf. Passieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Filter und schleudern Sie dann die Zellaufschlämmung 10 Minuten lang herunter. Bei 1000 g und Raumtemperatur resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in vier Millilitern Enzyminhibitor auf Sojabohnenbasis, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, und fügen Sie dann HBSS zu den Zellen bis zu einem endgültigen Volumen von 10 bis 20 Millilitern hinzu.Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Triam-Blau-Ausschluss und kryokonservieren Sie dann die isolierten Amnion-Epithelzellen. Biegen Sie sie zuerst fünf Minuten lang bei 700 Käsesorten und Zimmertemperatur nach unten. Dann wird das Pellet erneut mit 10 mal 10 der sechs bis einmal 10 der siebten Zellen pro Milliliter in tierstofffreiem Kryokonservierungsmedium resuspendiert und ein geeignetes Volumen von Zellen in o-ringförmige Kryokonservierungsfläschchen pipettiert.Schließlich werden die Fläschchen in eine Gefriervorrichtung mit kontrollierter Rate gestellt, in der eine Abkühlung bei etwa einem Grad Celsius pro Minute erfolgt, bis minus 80 Grad Celsius erreicht ist, und dann werden die Fläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Viele Medien ohne tierische Produkte erbringen eine angemessene Leistung. Die optimale DMSO-Konzentration liegt jedoch bei etwa fünf bis 10 %. In der Regel ist die erwartete Lebensfähigkeit nach dem Auftauen fünf bis 10 % geringer als die vor der Kryokonservierung und kann für den unerfahrenen Benutzer deutlich höher sein.Die Zellkultur kann mit humanen Amnionenepithelzellen durchgeführt werden, um die Charakterisierung oder Differenzierung der Zellen für eine weitere nachgelagerte Analyse zu ermöglichen, da sie ihren epithelialen Phänotyp in serumfreien Kulturmedien beibehalten. Zusätzlich zu ihren immunregulatorischen und entzündungshemmenden Eigenschaften haben sich humane Amnionenepithelzellen in vitro und in vivo als hochgradig multipotent erwiesen und differenzieren sich nach ihrer Entwicklung in Zelllinien, die für die drei primären Keimblätter repräsentativ sind. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, klinische Studien für Erkrankungen wie Lungenerkrankungen und Graft-versus-Host-Krankheit durchzuführen.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Seit James Thomson et al eine Technik entwickelt, im Jahr 1998 zu isolieren und zu wachsen hES in Kultur, haben Einfrieren von Zellen für die spätere Verwendung und Auftauen und Ausbau von Zellen aus einem gefrorenen Lager zu wichtigen Verfahren in der Routine-hES-Zell-Kultur durchgeführt. Da hES-Zellen sehr empfindlich auf die Belastungen von Einfrieren und Auftauen sind, ist besondere Sorgfalt. Hier zeigen wir die richtige Technik für die schnelle Auftauen hES-Zellen aus flüssigem Stickstoff...

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Die vorliegende Studie berichtet über ein Protokoll für das Chromosomen-Screening menschlicher Embryonen, das verbrauchtes Kulturmedium verwendet, das eine Embryonenbiopsie vermeidet und die Identifizierung der Chromosomenploidie mittels NGS ermöglicht. Der vorliegende Artikel stellt das detaillierte Verfahren vor, einschließlich der Herstellung des Nährmediums, der Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), der Vorbereitung der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek (NGS) und der Datenanalyse.

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges dreidimensionales (3-D) Kulturmodell, bei dem ein Tyramin-gebundenes Hyaluronan-Hydrogel verwendet wird, um präantrale Follikel aus dem Eierstock der Maus zu verkapseln und zu kultivieren. Wir beschreiben auch zwei Ansätze zur Kryokonservierung von Eierstockfollikeln durch Vitrifikation.

Anwendung eines neuartigen Hyaluron-Hydrogels für die dreidimensionale Follikelkultur und Methodik für die Kryokonservierung von Ovarialfollikeln in der Maus

Lernen Sie die Isolierung und Kryokonservierung humaner Amnion-Epithelzellen nach cGMP-Richtlinien. Diese tierproduktfreie Methode ermöglicht klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

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