Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito- Aedes aegypti
30. Dezember 2014
Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reaktionen gustatorischer Neuronen in Insekten zu beobachten und die Genexpression in gustatorischen Geweben zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Reaktionen bestimmter Geschmackshaare auf verschiedene Geschmackstasten in unterschiedlichen Konzentrationen aufgezeichnet werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Geschmacksgewebe sorgfältig zu präparieren.
Trennen Sie dann die Proben nach Geschlecht und Anhängsel. Als nächstes isolieren Sie die Gesamt-RNA aus jeder Gewebeprobe und erstellen CD-NA-Präparate für die Next-Gen-Sequenzierung und QPCR. Der letzte Schritt besteht darin, die Genexpressionsdaten zu analysieren und Hypothesen zu bilden, z. B. wie die exprimierten sensorischen Chemos-Gene physiologische Reaktionen auf den Geschmack von Insekten vermitteln.
Letztendlich werden elektrophysiologische Ableitungen verwendet, um den rezeptiven Bereich des Geschmackssystems von Insekten zu zeigen, und die RNA-Sequenzierung von Geschmacksgewebe wird verwendet, um die wichtigsten genetischen Komponenten der Geschmacksrezeption hervorzuheben. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesen Methoden noch nicht vertraut sind, aufgrund der geringen Größe der Insektenchemo Schwierigkeiten haben. Sensorische Anhängsel.
Unabhängig davon, ob es sich um das Präparieren oder das Aufzeichnen von kleinen Insektenorganen handelt, ist das Üben am Patienten der Schlüssel zur Beherrschung dieser Techniken. Um diesen Vorgang zu beginnen, ziehen Sie eine Aufzeichnungselektrode mit dünner Spitze in einen Pipettenabzieher mit einer Glaskapillare unter das Präpariermikroskop. Brechen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig ab, so dass ihre Öffnung breit genug ist, um das Zielzentrum zu umschließen, aber klein genug, um einen Kontakt mit den benachbarten Strukturen zu vermeiden.
Anschließend betäuben Sie zwei bis vier erwachsene Insekten im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius für 20 Sekunden. Danach wird eines der Insekten mit einem Deckglas mit kleinen Streifen Zellophanband ruhiggestellt. Unter dem Mikroskop.
Identifizieren Sie den Zielsensor anhand seiner Morphologie und Position und richten Sie das Tier so aus, dass er aus dem Winkel des Elektrodeneintritts freien Zugang zu ihm hat. Führen Sie dann einen Wolframdraht in seinen dorsalen Thorax ein. Um als Masseelektrode zu dienen, füllen Sie die Glaselektrode von der Spitze aus mit einer stimulierenden Lösung.
Schnippe die Luftblasen heraus, während du die Spitze nach unten hältst. Führen Sie einen Silberdraht in die Elektrode ein, der als Aufzeichnungs- und Stimulationselektrode dient. Verbinden Sie danach die Elektroden mit einem Vorverstärker, der die Verkürzung der Einschwingzeit zur Erfassung der neuronalen Aktivität ermöglicht.
Der Vorverstärker ist mit einem Computer verbunden, der mit einer Spike-Aufzeichnungssoftware ausgestattet ist, um elektrische Signale zu sammeln, zu speichern und zu analysieren. Stimulieren Sie nun das Centum mit einer Steuerungslösung, um seine Funktionalität zu gewährleisten. Zählen Sie die Spitzen, die 200 Millisekunden nach dem Stimulusartefakt beginnen.
Um die Dosis-Wirkungs-Ergebnisse zu erhalten. Setzen Sie das Centum steigenden Konzentrationen der experimentellen Chemikalie aus und lassen Sie mindestens drei Minuten zwischen den Stimulationen warten, um eine angemessene Erholung zu gewährleisten. Bereiten Sie bei diesem Verfahren einen flachen Kühler mit Trockeneis vor.
Beschriften Sie für die Gewebeentnahmeröhrchen die 1,5 Milliliter RNA-freien Schnappverschlussröhrchen für die Entnahme verschiedener Gewebearten. Halten Sie die Rohre geschlossen, um übermäßige Kondensation zu vermeiden. Anschließend 30 bis 40 Mücken im minus 20 Grad Celsius heißen Gefrierschrank für 15 bis 30 Sekunden betäuben.
Dann werden die betäubten Mücken in ein kaltes Stadium überführt und nach Geschlecht sortiert. Drehen Sie die Insekten mit der Rückenseite nach unten, indem Sie ihre Flügel greifen, und achten Sie darauf, die Geschmacksanhänge nicht zu beschädigen. Präparieren Sie unter einem Präpariermikroskop das paarige Etikett Bella oder Tarsi von Männchen oder Weibchen, indem Sie das Mücken-Bois vorsichtig direkt neben dem Etikett greifen.
Bella mit einer Pinzette, um den inneren Stift freizulegen, und entfernen Sie das Etikett mit der anderen Pinzette. Legen Sie dann das Gewebe in das Kälteauffangröhrchen für Fußwurzelgewebe. Fassen Sie das Mückenbein vorsichtig an der Verbindungsstelle der Tibia und des ersten Fußwurzelsegments und entfernen Sie die Tarsi.
Legen Sie dann das Taschentuch in die kalt beschriftete Tube. Drehen Sie die Entnahmeröhrchen eine Minute lang in einer Zentrifuge bei null Grad Celsius bei 9.000-facher Schwerkraft, um das Gewebe am Boden des Röhrchens zu halten. Wenn sich während der Dissektion Feuchtigkeit in den Sammelröhrchen ansammelt, fügen Sie 50 Mikroliter Kalttriol-Reagenz hinzu, um das gesammelte Gewebe abzudecken und zu schützen.
Frieren Sie die Röhrchen in dem 1,5-Milliliter-Röhrchengestell mit flüssigem Stickstoff ein. Bereiten Sie danach die eng anliegenden RNA-freien Stößel vor, indem Sie sie auf Trockeneis abkühlen, bevor Sie das Gewebe aufbrechen. Mahlen Sie dann das Taschentuch zu feinem Pulver und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
Bringen Sie das Gesamtvolumen von Triol auf einen Milliliter und revitalisieren Sie. Suspendieren Sie das gemahlene Gewebe durch Vortexen. Danach 200 Mikroliter Chloroform zum gemahlenen Gewebe geben und gründlich mischen.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur schleudern Sie es in der Zentrifuge bei vier Grad Celsius und der 11.000-fachen Schwerkraft für 15 Minuten herunter. Geben Sie die wässrige Schicht vorsichtig direkt in eine genomische DNA-Filtersäule. Drehen Sie es dann fünf Minuten lang mit dem 11.000-fachen der Schwerkraft nach unten.
Geben Sie ein gleiches Volumen an RNAs, 70% Ethanol frei in den Durchfluss und mischen Sie durch Pipettieren. Füllen Sie die Flüssigkeit in eine RNA-Sammelsäule und setzen Sie die RNA-Extraktion fort. Quantifizieren und beurteilen Sie danach die Reinheit der Gesamt-RNA auf einem Präzisionsspektrophotometer und fahren Sie mit einer beliebigen Standard-RNA-Sequenzierungsmethode fort.
Die Spurenaufzeichnungen der Aktionspotentiale aus der E GTI gustatorischen illa von aide zeigen die Wirksamkeit der direkten Stimulation mit dem Spektrum der Chemikalien. Diese Technik kann verwendet werden, um Reaktionen auf jede stimulierende Chemikalie zu quantifizieren, indem die Spitzen einer bestimmten Amplitude und Dauer über einen angemessenen Zeitraum von weniger als 500 Millisekunden gezählt werden. Diese drei Spikes entsprechen drei sensorischen Neuronen-Subtypen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit.
Die biologischen Replikate für RNA-Seq-Datensätze können durch Kosten oder Schwierigkeiten bei der Gewebeentnahme begrenzt sein. Q-R-T-P-C-R bietet die Möglichkeit, kleine Teilmengen der gesamten Genexpression zu geringeren Kosten zu validieren und benötigt weniger Quellen. Die im linken Feld nebeneinander gezeigte RNA ist ein Vergleich zwischen der relativen Expression, die durch RN Aeq bestimmt wird, und der relativen Expression, die durch Q-R-T-P-C-R bestimmt wird.
Diese beiden Methoden beruhen auf unterschiedlichen Chemikalien zur Abschätzung der Genhäufigkeit. Die grafisch im rechten Bereich dargestellten statistischen Äquivalenzfunktionen zeigen die Grenzen der Sicherheit jeweils auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Insektengewebe für die RNA-Isolierung präpariert und neuronale Signale aus den Geschmackshaaren lebender Insekten aufzeichnet.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Reaktionen gustatorischer Neuronen in Aedes aegypti auf verschiedene Geschmäcker und misst die Genexpression in gustatorischen Geweben. Mithilfe elektrophysiologischer Techniken identifiziert die Forschung Gene, die mit neuronalen Reaktionen auf bittere und abstoßende Verbindungen assoziiert sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entomologie
- Genexpression
Hintergrund
- Das Geschmackssystem bei Insekten spielt eine entscheidende Rolle bei der Geschmackswahrnehmung.
- Aedes aegypti dient als Modellorganismus zur Untersuchung sensorischer Reaktionen.
- Das Verständnis der Genexpression kann Mechanismen der Geschmackswahrnehmung aufdecken.
- Elektrophysiologische Methoden sind entscheidend, um neuronale Aktivität zu messen.
Zweck der Studie
- Die Beobachtung der Reaktionen gustatorischer Neuronen auf verschiedene Geschmacksstoffe ermöglichen.
- Die Genexpression in gustatorischen Geweben von Aedes aegypti messen.
- Hypothesen darüber aufstellen, wie chemosensorische Gene die physiologischen Reaktionen auf Geschmacksreize beeinflussen.
Verwendete Methoden
- Aufzeichnung der Reaktionen von Geschmackshaaren auf verschiedene Geschmacksrichtungen in unterschiedlichen Konzentrationen.
- Präparation von Geschmacksgeweben und Trennung der Proben nach Geschlecht und Anhängsel.
- Isolierung der gesamten RNA aus jeder Gewebeprobe.
- Erstellung von cDNA-Präparationen für die Next-Generation-Sequenzierung und QPCR.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Genen, die mit neuronalen Reaktionen auf bittere Verbindungen assoziiert sind.
- Erkenntnisse über die genetische Grundlage der Geschmackswahrnehmung bei Aedes aegypti.
- Die Datenanalyse stützt Hypothesen bezüglich der Funktionen chemosensorischer Gene.
- Elektrophysiologische Ergebnisse korrelieren mit den Befunden zur Genexpression.
Schlussfolgerungen
- Die Studie vertieft das Verständnis der Funktion gustatorischer Neuronen bei Insekten.
- Die Ergebnisse tragen zum umfassenderen Wissen über die Sinnesbiologie bei.
- Zukünftige Forschungsarbeiten könnten Anwendungen in der Schädlingsbekämpfung untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der molekularen Grundlagen der chemosensorischen Wahrnehmung bei Krankheitsüberträgern wie Aedes aegypti ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen für die Entwicklung neuartiger Repellentien. Die elektrophysiologische und transkriptomische Profilierung gustatorischer Gewebe liefert mechanistische Entlastung, indem sie die Genexpression mit verhaltensbezogenen Ergebnissen wie der Störung der Wirtssuche verknüpft. Dieser integrierte Ansatz stärkt die Vorhersagekraft bei der Untersuchung von Substanzen, die in die sensorischen Bahnen von Mücken eingreifen, und unterstützt Strategien zur Bekämpfung von Überträgern in frühen Entwicklungsstadien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Identifiziert gustatorische Rezeptorneuronen, die auf DEET und Chinin ansprechen, und ermöglicht so die Untersuchung der Bitterstoff-Wahrnehmungswege bei Krankheitsüberträgern.
- Praktischer Wert: Bietet einen validierten physiologischen Endpunkt zur Untersuchung von Substanzen, die die chemosensorischen Neuronen von Mücken modulieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Die RNA-Sequenzierung von Labellar- und Tarsengeweben zeigt Expressionsprofile von Genen der Chemorezeption auf und unterstützt die Entwicklung biomarkerbasierter Assays.
- Operativer Wert: Die Validierung mittels qRT-PCR gewährleistet Reproduzierbarkeit und quantitative Genauigkeit bei vergleichenden Genexpressionsanalysen über verschiedene Plattformen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Expression chemosensorischer Gene mit der Wahrnehmung von Abwehrstoffen und ermöglicht so eine zielgerichtete Bildschirmuntersuchung zur Störung des Wirtssuchverhaltens.
- Operativer Wert: Gewebespezifische Probenahme (pro-, meso- und metathorakale Tarsen) unterstützt skalierbare, nach Geschlecht differenzierte Screening-Modelle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode verbindet die frühe Target-Entdeckung mittels phänotypischem Screening mit der präklinischen Validierung, indem neuronale Aktivität mit molekularen Targets in chemosensorischen Geweben verknüpft wird.
- Entdeckungsbiochemie: Elektrophysiologische Ableitungen ermöglichen die Hypothesenprüfung der Wirkung von Substanzen auf die Feuerraten und Empfindlichkeit gustatorischer Neuronen.
- Screening: Die Ergebnisse von RNA-seq und qRT-PCR liefern standardisierte, quantitative Genexpressionsdaten zur Beurteilung der Zielstrukturenbindung.
- Analytik: Spikenzählung und statistische Äquivalenztests erlauben den Vergleich neuronaler Antworten und Genexpressionen unter verschiedenen Bedingungen und Methoden.
- Translationale Forschung: Die Validierung chemosensorischer Gene unterstützt die Abstimmung von Biomarkern zur Vorhersage der Abwehrwirkung in vivo.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der kombinierte Workflow aus Elektrophysiologie und Transkriptomik ist über Insektenarten und chemische Bibliotheken hinweg wiederverwendbar, um Zielstrukturen für die Vektorkontrolle zu entrisiken.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung von Abwehrstoffzielen durch direkte Korrelation von neuronaler Aktivität und Genexpression.
- Operationaler Wert: Standardisierte Protokolle für Gewebedissection, RNA-Isolierung und Elektrophysiologie gewährleisten die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen bezüglich Abwehrstoffkandidaten, indem die Zielinteraktion in relevanten chemosensorischen Geweben validiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen, die spezifische gustatorische Rezeptorwege beeinflussen, die mit dem Wirtssuchverhalten assoziiert sind.
Durchführungsüberlegungen
- Es ist Fachkenntnis in der Insekten-Elektrophysiologie und in der mikroskopischen Gewebedissection erforderlich, um zuverlässige Ableitungen von Geschmackshaaren zu erhalten.
- Der Zugang zu RNA-freier Ausrüstung, Zentrifugen und Spektrophotometrie ist notwendig, um hochwertige RNA aus kleinen Gewebeproben zu isolieren.
- Um eine Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen zu gewährleisten, sind konsistente Methoden zur Geschlechtsbestimmung des Gewebes, zur Trennung der Anhänge und zum Umgang mit der Kühlkette erforderlich, um eine RNA-Degradation zu verhindern.
- Die Übertragung auf andere Mückenarten oder Gewebe könnte eine Optimierung der Elektrodenpositionierung und der Dissektionsmethoden aufgrund morphologischer Unterschiede erfordern.
- Die begrenzte Anzahl biologischer Replikate in der RNA-Sequenzierung aufgrund des geringen Gewebematerials kann durch die Validierung zentraler Zielstrukturen mittels qRT-PCR, wie in der Studie gezeigt, verringert werden.
