Name: Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Hsp104-Varianten in Hefe-Modellen screenen, um Toxizität bei Proteinfehlfaltungserkrankungen zu unterdrücken. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung vielversprechender Kandidaten für weitere Charakterisierungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Sue Lindquist, Aaron Gitler und Martin Duennwald für die freundliche Bereitstellung von Reagenzien. Unsere Studien wurden unterstützt durch: ein Post-Doctoral Fellowship (M.E.J.) der American Heart Association; NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH vergibt R21NS067354, R21HD074510 und R01GM099836, einen Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), das Packard Center for ALS Research an der Johns Hopkins University, Target ALS, und einen Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Herstellung von Bibliotheken <ol><li> Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase 20. </li><li> Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion. </li><li> Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und mit Wasser auf 50 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser 20 . Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. HINWEIS: Spezifische Primer verwendet wird, basierend auf dem bestimmten Bereich des Gens, das zu amplifizierende variieren. <ol><li> Nach der PCR verdauen Eltern Template DNA mit 1 &amp; mgr; l DpnI-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Verwandeln Sie die Bibliothek durch Elektroporation oder andere Mittel in ultrakompetente E. coli und reinigen es durch Miniprep. HINWEIS: Bibliothek Generationvariiert im wesentlichen von den Zielen einer gegebenen Experiment basiert. Hsp 104 ist ein sehr großes Protein, so dass es unpraktisch ist, das gesamte Gen, weshalb wir nutzen domänenspezifischen fehleranfällige PCR zufällig ist. Darüber hinaus bleibt die Struktur des Hsp104 schlecht verstanden, dass das Design von gerichteten Bibliotheken anspruchs 21. Bibliotheken können mit gerichteten oder zufälligen Ansätze zur Mutagenese konstruiert werden, mit der einzigen Einschränkung, dass die Templat-Plasmid-Rückgrat ist das URA3-Gen für die 5-FOA Gegen Selektion auf Dextrose-Medium erlauben. </li></ol> 2. Transformation des Hsp104 Bibliothek <ol><li> Integrieren Sie die krankheitsassoziierten Substrat in W303aΔ hsp104 Hefe mit einem Standard-Lithium-Acetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Wählen einzelne Kolonien zu screenen, und sie für Toxizität, einen Stamm mit einer hohen Toxizität der Krankheit assoziiert Substrat 23 zu isolieren. HINWEIS: Verwenden Sie eine integrierte Belastung und isolate einer Einzelkolonie auf Gleich Expression in allen Zellen zu gewährleisten. Klonen Sie die Krankheit Substrat in ein Plasmid ermöglicht die Integration des Gens unter einem anderen als Uracil-Marker (wir verwenden Histidin) und dem Hsp104 Bibliothek in das pAG416GAL Plasmid (Uracil-Marker) 24. Für 5-FOA Gegenselektion zu ermöglichen, sicherzustellen, dass die Bibliothek aus einem Plasmid mit der Uracil-Marker exprimiert. Andere Hefe-Stämme können ebenfalls verwendet werden. Wir haben eine ähnliche Toxizität Unterdrückung Phänotyp mit W303a und BY4741 Hefestämme in beiden WT und Δ hsp104 Hintergründe (MEJ und JS, unveröffentlichte Beobachtungen) festgestellt. </li><li> Transformieren Sie das Hsp104 Bibliothek in diesen Stamm mit dem gleichen Lithiumacetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Scale up die Transformation entsprechend dem Sequenzraum der Bibliothek zu erhalten und um die vorhergesagte Größe der Bibliothek zu erhalten. </li><li> Platte der Transformationsansatz auf noninducing, Selektivplatten (zB SD-His-Ura) mit genug Plattensicherzustellen Wachstum einer großen Anzahl von Kolonien. Verwenden Sie große Petrischalen (150 mm), die Anzahl der Platten erforderlich minimieren. Gewinnen Anten unter Verwendung von Platten ermöglicht Transformationseffizienz zu bewerten. </li><li> Trans Hsp104 WT und Vektor Negativkontrollen parallel. </li></ol> 3. Screening zur Unterdrückung von proteotoxicity <ol><li> Verwendung Raffinose ergänzt Dropout Medien (zB sraff-His-Ura) Waschen Sie die Kolonien von den Platten. Verwenden Sie eine serologische Pipette und sterilen Holz Applikatoren, die Kolonien von den Platten lösen. Übertragen Sie die Flüssigkeit wäscht auf eine 50 ml konischen Röhrchen und vortexen, um alle Klumpen von Zellen zu trennen. Verdünnen, um eine leicht trübe Kultur, OD 600 ~ 0,025. HINWEIS: Hier Raffinose dient dazu, die Zellen Glucose-vermittelte Unterdrückung der Induktion zu entlasten, damit die Zellen Grundierung für Galaktose-vermittelte Induktion. </li><li> Wachsen die verdünnte Kultur über Nacht in Raffinose Dropout Medien mit 3 Schütteln0 ºC. Wachsen die Hsp104 WT und Vektorkontrollen parallel. </li><li> Am folgenden Morgen, Platte eine Reihe von Konzentrationen auf einzelne Galactose (zB SGal-His-Ura) Platten (1 ul bis 2 ml in 400 ul Gesamtvolumen konzentriert Kultur). Plattieren eines breiten Konzentrationsbereich wird sichergestellt, dass eine Platte wird einzelne Kolonien haben. Die tatsächliche erforderliche Konzentration hängt von der Toxizität des Krankheits Substrat von Interesse. </li><li> Normalisierung des Vektors und Hsp104 WT Kulturen der OD 600 der Bibliothek und der Platte gleichen Volumina, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen. </li><li> Um die Auswahl Stringenz zu bewerten, Plate Die Bibliothek auf Glukose (Repression) Medien. Inkubation erfolgt für 2-3 Tage bei 30 ° C, bis Kolonien erscheinen (Abbildung 2). Bewerten Sie die resultierenden Kolonien und im Vergleich zu den Kontrollen. HINWEIS: Oft große und kleine Kolonien erhalten werden, aber keine Korrelation zwischen Koloniegröße und handelnduktivität beobachtet. Bildschirm diese potenziellen Hits mit einem 5-FOA Gegenselektionstechnik (Schritt 4), um die Sequenzierung übertragenen Fehlalarme zu minimieren. </li></ol> 4. 5-FOA Gegenselektion und Spek, Fehlalarme zu eliminieren <ol><li> Streak aus Einzelkolonien in zweifacher Ausfertigung auf Doppel- und Einzel Dropout Medien (zB SD-His-Ura und SD-His-Platten) und über Nacht wachsen bei 30 ºC. Wiederholen Sie mit Vektor- und Hsp104 WT Kontrollen. Plattieren auf SD-His vor 5-FOA erhöht die Effizienz der 5-FOA Schritt durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen das Hsp104-Plasmid verloren haben, wenn sie auf 5-FOA plattiert sind. </li><li> Um Platten vor dem Austrocknen zu verhindern, wickeln Sie das SD-His-Ura Platten in Parafilm und bei 4 ºC während der Durchführung der 5-FOA-Bildschirm. Diese Platten werden schließlich für die Sequenzierung verwendet werden. </li><li> Streak die Kolonien von der SD-His-Platten, um einzelne Kolonien auf 5-FOA-Platten (YPD media + 1g / L 5-FOA) und Inkubation für 1-2 Tage bei 30 &amp;# 186; C, bis einzelne Kolonien erscheinen. Dabei wird 5-FOA in einen toxischen Stoff (5-Fluordeoxyuridin) in Zellen, die das URA3-Gen enthalten, umgewandelt. Somit werden alle Zellen noch beherbergen die Hsp104 Plasmid sterben. </li><li> Streak die Einzelkolonien aus den 5-FOA-Platten in doppelter Ausführung auf SD-Ura und SD-His-Platten. Test 3 Kolonien für jede getroffen, um die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer Kolonie, für jeden Treffer wird das Hsp104-Plasmid verloren haben, zu erhöhen. Inkubation für 1-2 Tage bei 30 ° C. Kolonien, die Hsp104 Plasmid wird auf SD-His-Platten, aber nicht SD-Ura Platten wachsen verloren haben. </li><li> Wachsen die Stämme, die Hsp104 Plasmide für Spek Assays verloren haben. Wachsen die Stämme in Raffinose Dropout Mediensättigung (zB sraff-His) in 96 Deepwell 2 ml Platten über Nacht bei 30 ºC unter Schütteln. Achten Sie darauf, um die 5-FOA behandelten Kontrollstämme gehören. </li><li> Bereiten Platten für Spotting-Assay. Mit einer Mehrkanalpipette, aliquoten 200 ul Raffinose Dropout Medien (zB sraff-His) proVertiefung einer 96-Well-Platte, Reservierung Spalten 1 und 7 für die gepflegte Kulturen. Aliquots von 250 &amp; mgr; l von jeder der 16 gesättigten Kulturen in den Spalten 1 und 7 der Platte. </li><li> Seriell verdünnten Kulturen 5-fach in jeder Spalte der Platte, gründliches Mischen mit einer Mehrkanalpipette. Entfernen 50 ul der verdünnten Kultur aus den Spalten 6 und 12, um das Endvolumen jeder Vertiefung 200 ul gewährleisten. Dies ist unerlässlich, um auch Schmierblutungen zu gewährleisten. </li><li> Mit einem 96-Loch-Replikator-Werkzeug (Frogger), vor Ort die Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf SD-His und SGal-His-Platten. Die Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li><li> Wählen Sie für die Sequenzierung Stämme, die Toxizität auf den SGal-His-Platten ähnlich dem der Kontrollen zeigen. Verwerfen als Fehlalarme Stämme, die nicht so giftig wie die Kontrollen sind. 5-FOA ist auch häufig auf eine eigene giftig, so verwerfen Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf SD-His-Platten oder dass eine wesentlich größere Toxizität aufweisen als die Krankheit Substrat allein ( <strong&gt; 3). </li></ol> 5. Sequenzierung des Hsp104 Varianten durch Kolonie-PCR <ol><li> Scrape ~ 10 ul Hefe aus den SD-His-Ura-Platten in 3 ul 20 mM NaOH in PCR Streifen Rohren und Lyse der Zellen durch Einfrieren und Auftauen. Legen Sie die Streifen Röhrchen in einem -80 ° C Gefrierschrank für 10 min oder in flüssigem Stickstoff, dann bei 99 ° C inkubieren in einem Thermocycler für 10 min. Verdünnen Sie die Stämme bis 100 &amp; mgr; l mit PCR-Wasser. </li><li> Bereiten PCR-Reaktionen: 5 ul PCR-Matrize, 0,5 ul 100 uM jeder Primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und stellen bis zu 25 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser. Design-Primer, die randomisierten Bereich plus etwa 100 bp an beiden Enden zu verstärken. Minimierung der Größe des amplifizierten Region, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation erhöhen. Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. </li><li> Analyse Proben durch Agarosegelelektrophorese zur Amplifikation eines PCR-Produkt der geeigneten siz bestätigene. Wiederholen PCR, wenn keine vorhanden ist. HINWEIS: PCR Ausfall ist in der Regel durch zu viel Hefe in Schritt 5.1 verwendet. </li><li> Vorbereitung der Proben für die DNA-Sequenzierung. Entfernen PCR-Primer entweder durch PCR Aufreinigung oder unter Verwendung eines PCR-Produkt Bereinigung Reagens wie Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase-Enzym (ExoSAP-IT), um einzelsträngige DNA abzubauen. Dieses Reagenz enzymatisch abbaut unincorporated Primern und dNTPs, so dass für einen höheren Durchsatz. </li><li> Sequenz, die die PCR-Produkte. Achten Sie darauf, gründlich zu analysieren Sequenzierung Chromatogramme für Mutationen. Mutationen können als Mischung von zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle (4) beobachtet werden, wie Hefe häufig beherbergen mehreren Plasmiden. </li></ol>

<ol><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases%3A+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+aging%2C+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+reveal+a+%27druggable%27+Rsp5%2FNedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li>
<li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein%2C+alpha-synuclein%2C+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%3A+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li>
<li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li>
<li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li>
<li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittrup%2C+KD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoeke%2C+JD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).</li>
<li>Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazaki%2C+K+%22eds+FrancesH+Arnold+%26+George+Georgiou%22">eds FrancesH Arnold & George Georgiou</a>. 231, Humana Press. 23-28 (2003).</li>
<li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+machines+for+protein+folding%2C+unfolding+and+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%C2%AE+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt in der 5-...

Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) 1-3 entwickelt. Expression der Proteine ​​TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 3 zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen 4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine ​​oder kleine Moleküle, die verhindern oder rückgängig diese Phänotypen 2,6-13. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Proteinen, die in der Lage umzukehren Aggregation und Toxizität durch TDP-43, FUS und α-syn sind. Wir konzentrieren uns auf Hsp104, ein AAA + Protein aus Hefe, die einzigartig in der Lage Disaggregieren Proteine ​​sowohl fr istom amorphen Aggregaten und Amyloid in Hefe, es hat noch keine menschliche Homolog 14,15. Hsp104 fein abgestimmt, um endogene Hefe Prionen zerlegen und hat nur begrenzte Fähigkeit, Substrate in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die es nie gewöhnlich begegnet 16,17 zerlegen. So wollen wir verbesserte Versionen von Hsp104, die in der Lage, wirksam zu zerlegen diese menschlichen Substrate sind Ingenieur. Dazu konstruieren wir große Bibliotheken Hsp104 Varianten mit fehleranfällige PCR; Diese Bibliotheken können mit den Hefe proteinopathy Modelle 17 zu sehen sein. Wir haben eine Domain-bezogenen Ansatz zur Konstruktion und Screening-Bibliotheken angenommen, wie Hsp104 ist sehr groß 17. Wir konzentrierte sich zunächst auf die Mitteldomäne (MD) von Hsp104 17, obwohl ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere Bereiche zu screenen. Diese Modelle ermöglichen für disaggregase Aktivität direkt Screening, im Gegensatz zu alternativen Techniken wie Oberflächen Display, das andere istricted zur Überwachung Bindungs ​​18 verwenden. Unser Protokoll auf zwei Screeningschritte (Abbildung 1). Zunächst werden Hsp104-Varianten, die die Toxizität der Krankheit Substrat in Hefe unterdrücken, ausgewählt ist. Um dies zu tun, Varianten der Hsp104 und krankheitsassoziierten Substrat in Δ hsp104 Hefe kotransformiert. Wir beschäftigen Δ hsp104 Hefe Hsp104 Sequenzraum in Abwesenheit von Wildtyp (WT) Hsp104 17 zu erkunden. Wichtig ist, dass das Löschen von Hsp104 nicht beeinträchtigt α-syn, FUS oder TDP-43 Toxizität in Hefe und die Expression von Hsp104 WT eine minimale Rettungs 1,13,17. Die Hefe wird dann auf induzierenden Medium, um die Expression der beiden Proteine ​​induzieren plattiert. Hefe beherbergen Hsp104 Varianten Toxizität der Krankheit assoziierten Substrat confer Wachstum der Kolonie zu unterdrücken. Diese Varianten werden zur weiteren Analyse ausgewählt, während Kolonien aufrechterhalten Varianten, die Toxizität sterben nicht unterdrücken müssen. JedochFehlalarme sind ein wesentliches Problem in diesem Bildschirm. Expression des TDP-43, FUS und α-syn hoch toxisch, was einen starken Selektionsdruck für das Auftreten von spontanen genetischen Suppressoren der Toxizität nicht mit dem Hsp104 Variante erstellt exprimiert. Somit haben wir einen zweiten Bildschirm, der auch relativ hohen Durchsatz, diese unspezifischen Toxizität Drücker 17 zu eliminieren. In diesem zweiten Bildschirm werden ausgewählte Hefe mit 5-Fluorootic Säure (5-FOA) behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid 19. Die Stämme werden dann auf Substrat (TDP-43, FUS oder α-syn) Toxizität gegen Fleckentest, um sicherzustellen, dass die Toxizität des Substrats nach dem Verlust des Hsp104 Plasmid wieder bewertet. Somit Hefe toxisch ist in diesem Sekundärbild wiederhergestellt vermutlich ursprünglich angezeigte Toxizität Unterdrückung aufgrund der Anwesenheit des Hsp104-Variante. Diese Hefe werden als &quot;Hits&quot; bezeichnet, und die Hsp104 Plasmid sollte danngewonnen und sequenziert, um die Mutationen in der Hsp104-Gens 17 (Figur 1) zu identifizieren. Alle Treffer soll dann durch den Bau die Mutation unabhängig unter Verwendung ortsgerichtete Mutagenese und dann erneute Prüfung auf Toxizität Unterdrückung rückbestätigt werden. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Protokoll sind breit. Mit Hilfe dieser Methoden können Bibliotheken von jeder Art von Proteinvarianten, die zur Toxizität von jedem Substrat Protein, das in Hefe toxisch ist drücken gescreent werden.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorosäure</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Platten</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 fettes Replikator-Werkzeug</td><td>V& P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolieren potenzierte hsp104 varianten unter verwendung von hefe proteinopathy models

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Viele Proteinfehlfaltungsstörungen können in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae modelliert werden. Proteine wie TDP-43 und FUS, die an der amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind, und α-Synuclein, das an der Parkinson-Krankheit beteiligt ist, sind toxisch und bilden zytoplasmatische Aggregate in Hefe. Diese Merkmale rekapitulieren Proteinpathologien, die bei Patienten mit diesen Erkrankungen beobachtet wurden. Daher ist Hefe eine ideale Plattform für die Isolierung von Toxizitätssuppressoren aus Bibliotheken von Proteinvarianten. Wir sind daran interessiert, Proteindisaggregase anzuwenden, um fehlgefaltete toxische Proteinkonformere zu eliminieren. Konkret entwickeln wir Hsp104, ein hexameres AAA+-Protein aus Hefe, das in einzigartiger Weise in der Lage ist, sowohl ungeordnete Aggregate als auch Amyloid zu lösen und die Proteine in ihre native Konformation zurückzuführen. Während Hsp104 in Eukaryoten und Eubakterien hoch konserviert ist, hat es kein bekanntes Metazoen-Homolog. Hsp104 hat nur eine begrenzte Fähigkeit, ungeordnete Aggregate und Amyloidfasern zu eliminieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind. Daher wollen wir Hsp104-Varianten entwickeln, um die Proteinfehlfaltung, die bei neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle spielt, rückgängig zu machen. Wir haben Methoden entwickelt, um große Bibliotheken von Hsp104-Varianten auf die Unterdrückung der Proteotoxizität in Hefe zu untersuchen. Da Hefen anfällig für eine spontane unspezifische Unterdrückung der Toxizität sind, wurde ein zweistufiges Screening-Verfahren entwickelt, um falsch positive Ergebnisse zu eliminieren. Mit diesen Methoden haben wir eine Reihe von potenzierten Hsp104-Varianten identifiziert, die die Toxizität und Aggregation von TDP-43, FUS und α-Synuclein stark unterdrücken. Hier beschreiben wir dieses optimierte Protokoll, das an Screening-Bibliotheken angepasst werden könnte, die mit einem beliebigen Proteinrückgrat erstellt wurden, um die Toxizität von Proteinen zu unterdrücken, die in Hefe toxisch sind.

Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp104 Variant...

Hefeproteinopathie-Modelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Toxizität und Aggregation von Proteinen zu bewerten, die an Krankheiten beteiligt sind. In dieser Arbeit stellen wir Methoden zum Screening von Hsp104-Variantenbibliotheken auf Toxizitätssuppressoren vor. Dieses Protokoll könnte so angepasst werden, dass jede Proteinbibliothek auf Toxizitätssuppressoren von Proteinen untersucht wird, die in Hefe toxisch sind.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, HS P 1 0 4 Bibliotheken auf die Auswahl von Varianten zu untersuchen, die die Toxizität der Proteine unterdrücken, die mit Proteinfehlfaltungsstörungen assoziiert sind. Dies wird durch die Co-Transformation von HSP 1 0 4-Variantenbibliotheken mit einem krankheitsassoziierten Substrat in Hefe und Coex erreicht, die die beiden Proteine in einem zweiten Schritt exprimieren. Die selektierten Hefen werden mit fünf Fluor utinsäure oder fünf FOA behandelt, um die Selektion für das HSP 1 0 4 Plasmid zu treffen.Anschließend werden die Treffer sequenziert, indem die Mutagenregion mittels Kolonie-PCR amplifiziert oder die Mutationen im HSP 1 0 4-Gen identifiziert werden. Letztendlich kann die Suppression der Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats evaluiert werden, um die HS P 1 0 4-Varianten zu identifizieren, die für die weitere Charakterisierung am vielversprechendsten sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der bindungsbasierten Selektion besteht darin, dass diese Technik die Selektion von Varianten ermöglicht, die die Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats unterdrücken.Diese Methode kann helfen, Sc

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung von hochaktiven Hsp104, ein hexameren AAA +-Protein aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Disaggregation. Dieses Schema nutzt eine His6-markierten Konstruktes zur Affinitätsreinigung...

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzenden Protokolle zur Beurteilung der Toxizität von Polyglutamin (Polyglutamindomänen)-Expansion Proteinen in der...

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu...

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

Dieser Artikel beschreibt Protokolle, um die Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf die Aggregation und Toxizität von fehlgefaltete Trinukleotiderkrankungen Erweiterung für die schnelle Bewertung eines neu Fußgelenkes fluoreszierenden Proteins im Rahmen des fluoreszierenden Reporter zu bewerten.

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Charakterisierung von genomweiten Änderungen in der Höhe von Histon post-translationalen Modifikationen (PTM) in Verbindung mit der Überexpression der Proteine zugeordnet ALS und Parkinson in auftretenden Saccharomyces Cerevisiae Modelle. Nach der Trennung der SDS-PAGE werden einzelne Histon PTM Ebenen mit Modifikation-spezifische Antikörper über Western blotting erkannt.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Erfahren Sie, wie Sie Hsp104-Varianten in Hefe-Modellen screenen, um Toxizität bei Proteinfehlfaltungserkrankungen zu unterdrücken. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung vielversprechender Kandidaten für weitere Charakterisierungen.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Weitere Videos entdecken