Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, HS P 1 0 4 Bibliotheken auf die Auswahl von Varianten zu untersuchen, die die Toxizität der Proteine unterdrücken, die mit Proteinfehlfaltungsstörungen assoziiert sind. Dies wird durch die Co-Transformation von HSP 1 0 4-Variantenbibliotheken mit einem krankheitsassoziierten Substrat in Hefe und Coex erreicht, die die beiden Proteine in einem zweiten Schritt exprimieren. Die selektierten Hefen werden mit fünf Fluor utinsäure oder fünf FOA behandelt, um die Selektion für das HSP 1 0 4 Plasmid zu treffen.

Anschließend werden die Treffer sequenziert, indem die Mutagenregion mittels Kolonie-PCR amplifiziert oder die Mutationen im HSP 1 0 4-Gen identifiziert werden. Letztendlich kann die Suppression der Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats evaluiert werden, um die HS P 1 0 4-Varianten zu identifizieren, die für die weitere Charakterisierung am vielversprechendsten sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der bindungsbasierten Selektion besteht darin, dass diese Technik die Selektion von Varianten ermöglicht, die die Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats unterdrücken.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Proteinfaltung zu beantworten, indem sie die Proteine identifiziert, die die Proteinfehlfaltung rückgängig machen können. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Potenzierung von HS P 1 0 4 geben kann, kann sie auch auf das Screening von Bibliotheken beliebiger Proteine auf die Toxizitätsunterdrückung von Substraten angewendet werden, die in Hefe toxisch sind. Im Allgemeinen werden Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da viele Kolonien möglicherweise gescreent werden müssen, um gültige Treffer zu finden. Um auf Protea-Toxizitätsunterdrückung zu screenen, beginnen Sie mit dem Waschen von HSP 1 0 4-Kolonien von den Platten mit mit Raffinose-supplementiertem Dropout-Medium, einer serologischen Pipette und sterilem Holz und Applikatoren. Übertragen Sie die flüssigen Waschungen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie die Kolonien gründlich durch, um Zellklumpen zu trennen.

Anschließend verdünnen Sie die Zellsuspension zu einer leicht trüben Kultur und züchten die Zellen über Nacht in Raffinose-Dropout-Medien unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Erweitern Sie zu diesem Zeitpunkt auch die Wildtype- und Vektorsteuerelemente HSP 1, 0, 4 parallel. Die folgende Morgenplatte, ein Bereich von Zellkonzentrationen auf einzelne Galaktoseplatten, um mindestens eine Platte pro Gruppe mit einzelnen Kolonien zu erzeugen.

Normalisieren Sie den Vektor und die HSP 1 0 4 Welttypkulturen auf den OD 600 der Bibliothek und der Platte. Gleiche Volumina dieser Zellen wie die experimentellen Stammkonzentrationen, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen und die Selektion zu bewerten. Bei der Stringenz wird die Bibliothek auch auf Glukoseunterdrückungsmedien plattiert und dann alle Platten zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert, bis die Kolonien anscheinend fünf FOA für die Selektion der Zellen verwenden, die HSP 1 0 4 exprimierende Plasmide nicht mehr aufrechterhalten und anschließend die einzelnen Kolonien jedes Stammes in Duplikaten auf Doppel- und Einfach-Dropout-Medienplatten pro Inkubation über Nacht bei 30 Grad Celsius streifen.

Diese Platten werden später für die Sequenzierung verwendet, um ein Austrocknen der Platten zu verhindern. Wickeln Sie die SD Hiss Europlatten in Para-Folie ein und installieren Sie sie bei vier Grad Celsius, während Sie den Fünf-FOA-Bildschirm durchführen. Streifen Sie dann die Kolonien von den SD-Hissplatten zu einzelnen Kolonien auf fünf FOA-Platten für eine ein- bis zweitägige Inkubation bei 30 Grad Celsius, bis einzelne Kolonien erscheinen. Nächster.

Wählen Sie aus jeder fünf FOA-Platte aus und streichen Sie. Drei überlebende Völker auf einen SD Euro und einen SD seine Platte pro überlebendem Volk nach weiteren ein bis zwei Tagen Inkubation bei 30 Grad Celsius. Die Kolonien, die das Plasmid HSP 1 0 4 verloren haben, wachsen auf SD-Hiss-Platten, aber nicht auf SD-Euro-Platten.

Züchten Sie diese Stämme bis zur Sättigung in Raffinose-Dropout-Medien im Jahr 96. Tief wohl zwei Milliliter Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln tief. Um Fehlalarme zu vermeiden, führen Sie dann einen Schmierblutungstest durch.

Gegen Ende der Inkubation wird eine Mehrkanalpipette verwendet, um 200 Mikroliter Raffinose-Dropout-Medium pro Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte zu aliquotieren, wobei die Spalten eins und sieben für die reinen Kulturen reserviert sind. Als nächstes aliquotieren Sie 250 Mikroliter jeder der 16 gesättigten Kulturen in die Spalten eins und sieben der Platte und verdünnen die Kulturen seriell fünffach in jede Säule der Platte, wobei Sie sie gründlich mit der Mehrkanalpipette mischen. Um eine gleichmäßige Schmierblutung zu gewährleisten, entfernen Sie dann 50 Mikroliter der verdünnten Kultur aus den Spalten sechs und 12, um sicherzustellen, dass das endgültige Volumen jeder Vertiefung 200 Mikroliter beträgt.

Verwenden Sie dann ein 96-Volt-Replikator-Werkzeug, um die Kulturen in Duplikaten auf SD-Hiss- und Escal-Hiss-Platten zu erkennen. Nach einer zwei- bis dreitägigen Inkubation bei 30 Grad Celsius wählen Sie für die Sequenzierungsstämme aus, die auf den Escal-Zischplatten Toxizität aufweisen. Ähnlich wie bei den Kontrollen können falsch positive Stämme, die nicht so toxisch sind wie die Kontrollen, verworfen werden.

Verwerfen Sie auch Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf der sd aufweisen. Seine Platten weisen eine wesentlich höhere Toxizität auf als das Krankheitssubstrat allein. Um die HSP 1 0 4-Varianten durch Kolonie-PCR zu sequenzieren, kratzen Sie zunächst etwa 10 Mikroliter Hefe von den SD-Hiss-Europlatten in drei Mikroliter 20 Milli Natriumhydroxid in PCR-abgestreiften Röhrchen, um die Zellen durch Einfrieren und Auftauen zu reinigen.

Legen Sie die Streifen zuerst in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Nach 10 Minuten im Gefrierschrank inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 99 Grad Celsius im Thermocycler und verdünnen Sie dann die Stämme mit einer hohen Primerkonzentration auf 100 Mikroliter mit Wasser in PCR-Qualität. Führen Sie anschließend ein Standard-PCR-Programm für die Proben aus und analysieren Sie die Proben dann durch Agelelektrophorese, um die Amplifikation eines A-PCR-Produkts der entsprechenden Größe zu bestätigen.

Sequenzieren Sie abschließend die PCR-Produkte und achten Sie darauf, die Sequenzierungschromatogramme gründlich auf Mutationen zu analysieren. Mutationen können als Mischung aus zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle beobachtet werden, da Hefe oft mehrere Plasmide beherbergt. In diesem repräsentativen Experiment wurde nach dem Aufbau einer Bibliothek von HSP 1 0 4-Varianten, die in der mittleren Domäne randomisiert wurden, die Bibliothek in Hefe transformiert, die ein Plasmid für die Galactose-induzierbare TDP 43-Expression enthält.

Die Transformanten wurden dann zurückgewonnen und auf Glukose- und Galaktoseplatten plattiert, um die Stringenz des Screenings zu beurteilen. Die Hits wurden aus der Galaktoseplatte ausgewählt. Nach fünf FOA-Behandlungs-Spotting-Assays einer Untergruppe der Varianten, die im ersten Screening ausgewählt wurden. Es zeigte sich, dass von den vier ausgewählten Kolonien zwei HSP 1 0 4 eine TDP 43-Toxizitätssuppression aufwiesen.

Einer war falsch positiv und einer wies eine erhöhte Toxizität auf. Nach fünf FOA-Behandlungen wurden die beiden wahren Treffer durch Kolonie-PCR sequenziert, um die Mutationen der mittleren Domäne zu identifizieren. Diese HS P 1 0 4-Mutationen können dann im elterlichen HSP 1 0 4-Plasmid durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden, um ihre Toxizitätsunterdrückung zu bestätigen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie verwendet werden, um bis zu 200 Treffer gleichzeitig in den fünf FO zu screenen, ein Schritt über einen Zeitraum von ein bis zwei Wochen, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sequenzierungsergebnisse sorgfältig zu analysieren, da nach diesem Verfahren häufig Mischungen von Plasmiden erhalten werden. Andere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie die HSP 1 0 4-Varianten die Aggregation des krankheitsassoziierten Substrats beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Bibliotheken von HSP 1 0 4-Varianten für die Auswahl von Toxizitätssuppressoren überprüft werden.