Name: Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Hsp104-Varianten in Hefe-Modellen screenen, um Toxizität bei Proteinfehlfaltungserkrankungen zu unterdrücken. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung vielversprechender Kandidaten für weitere Charakterisierungen.

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Wir danken Sue Lindquist, Aaron Gitler und Martin Duennwald für die freundliche Bereitstellung von Reagenzien. Unsere Studien wurden unterstützt durch: ein Post-Doctoral Fellowship (M.E.J.) der American Heart Association; NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH vergibt R21NS067354, R21HD074510 und R01GM099836, einen Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), das Packard Center for ALS Research an der Johns Hopkins University, Target ALS, und einen Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Herstellung von Bibliotheken <ol><li> Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase 20. </li><li> Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion. </li><li> Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und mit Wasser auf 50 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser 20 . Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. HINWEIS: Spezifische Primer verwendet wird, basierend auf dem bestimmten Bereich des Gens, das zu amplifizierende variieren. <ol><li> Nach der PCR verdauen Eltern Template DNA mit 1 &amp; mgr; l DpnI-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Verwandeln Sie die Bibliothek durch Elektroporation oder andere Mittel in ultrakompetente E. coli und reinigen es durch Miniprep. HINWEIS: Bibliothek Generationvariiert im wesentlichen von den Zielen einer gegebenen Experiment basiert. Hsp 104 ist ein sehr großes Protein, so dass es unpraktisch ist, das gesamte Gen, weshalb wir nutzen domänenspezifischen fehleranfällige PCR zufällig ist. Darüber hinaus bleibt die Struktur des Hsp104 schlecht verstanden, dass das Design von gerichteten Bibliotheken anspruchs 21. Bibliotheken können mit gerichteten oder zufälligen Ansätze zur Mutagenese konstruiert werden, mit der einzigen Einschränkung, dass die Templat-Plasmid-Rückgrat ist das URA3-Gen für die 5-FOA Gegen Selektion auf Dextrose-Medium erlauben. </li></ol> 2. Transformation des Hsp104 Bibliothek <ol><li> Integrieren Sie die krankheitsassoziierten Substrat in W303aΔ hsp104 Hefe mit einem Standard-Lithium-Acetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Wählen einzelne Kolonien zu screenen, und sie für Toxizität, einen Stamm mit einer hohen Toxizität der Krankheit assoziiert Substrat 23 zu isolieren. HINWEIS: Verwenden Sie eine integrierte Belastung und isolate einer Einzelkolonie auf Gleich Expression in allen Zellen zu gewährleisten. Klonen Sie die Krankheit Substrat in ein Plasmid ermöglicht die Integration des Gens unter einem anderen als Uracil-Marker (wir verwenden Histidin) und dem Hsp104 Bibliothek in das pAG416GAL Plasmid (Uracil-Marker) 24. Für 5-FOA Gegenselektion zu ermöglichen, sicherzustellen, dass die Bibliothek aus einem Plasmid mit der Uracil-Marker exprimiert. Andere Hefe-Stämme können ebenfalls verwendet werden. Wir haben eine ähnliche Toxizität Unterdrückung Phänotyp mit W303a und BY4741 Hefestämme in beiden WT und Δ hsp104 Hintergründe (MEJ und JS, unveröffentlichte Beobachtungen) festgestellt. </li><li> Transformieren Sie das Hsp104 Bibliothek in diesen Stamm mit dem gleichen Lithiumacetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Scale up die Transformation entsprechend dem Sequenzraum der Bibliothek zu erhalten und um die vorhergesagte Größe der Bibliothek zu erhalten. </li><li> Platte der Transformationsansatz auf noninducing, Selektivplatten (zB SD-His-Ura) mit genug Plattensicherzustellen Wachstum einer großen Anzahl von Kolonien. Verwenden Sie große Petrischalen (150 mm), die Anzahl der Platten erforderlich minimieren. Gewinnen Anten unter Verwendung von Platten ermöglicht Transformationseffizienz zu bewerten. </li><li> Trans Hsp104 WT und Vektor Negativkontrollen parallel. </li></ol> 3. Screening zur Unterdrückung von proteotoxicity <ol><li> Verwendung Raffinose ergänzt Dropout Medien (zB sraff-His-Ura) Waschen Sie die Kolonien von den Platten. Verwenden Sie eine serologische Pipette und sterilen Holz Applikatoren, die Kolonien von den Platten lösen. Übertragen Sie die Flüssigkeit wäscht auf eine 50 ml konischen Röhrchen und vortexen, um alle Klumpen von Zellen zu trennen. Verdünnen, um eine leicht trübe Kultur, OD 600 ~ 0,025. HINWEIS: Hier Raffinose dient dazu, die Zellen Glucose-vermittelte Unterdrückung der Induktion zu entlasten, damit die Zellen Grundierung für Galaktose-vermittelte Induktion. </li><li> Wachsen die verdünnte Kultur über Nacht in Raffinose Dropout Medien mit 3 Schütteln0 ºC. Wachsen die Hsp104 WT und Vektorkontrollen parallel. </li><li> Am folgenden Morgen, Platte eine Reihe von Konzentrationen auf einzelne Galactose (zB SGal-His-Ura) Platten (1 ul bis 2 ml in 400 ul Gesamtvolumen konzentriert Kultur). Plattieren eines breiten Konzentrationsbereich wird sichergestellt, dass eine Platte wird einzelne Kolonien haben. Die tatsächliche erforderliche Konzentration hängt von der Toxizität des Krankheits Substrat von Interesse. </li><li> Normalisierung des Vektors und Hsp104 WT Kulturen der OD 600 der Bibliothek und der Platte gleichen Volumina, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen. </li><li> Um die Auswahl Stringenz zu bewerten, Plate Die Bibliothek auf Glukose (Repression) Medien. Inkubation erfolgt für 2-3 Tage bei 30 ° C, bis Kolonien erscheinen (Abbildung 2). Bewerten Sie die resultierenden Kolonien und im Vergleich zu den Kontrollen. HINWEIS: Oft große und kleine Kolonien erhalten werden, aber keine Korrelation zwischen Koloniegröße und handelnduktivität beobachtet. Bildschirm diese potenziellen Hits mit einem 5-FOA Gegenselektionstechnik (Schritt 4), um die Sequenzierung übertragenen Fehlalarme zu minimieren. </li></ol> 4. 5-FOA Gegenselektion und Spek, Fehlalarme zu eliminieren <ol><li> Streak aus Einzelkolonien in zweifacher Ausfertigung auf Doppel- und Einzel Dropout Medien (zB SD-His-Ura und SD-His-Platten) und über Nacht wachsen bei 30 ºC. Wiederholen Sie mit Vektor- und Hsp104 WT Kontrollen. Plattieren auf SD-His vor 5-FOA erhöht die Effizienz der 5-FOA Schritt durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen das Hsp104-Plasmid verloren haben, wenn sie auf 5-FOA plattiert sind. </li><li> Um Platten vor dem Austrocknen zu verhindern, wickeln Sie das SD-His-Ura Platten in Parafilm und bei 4 ºC während der Durchführung der 5-FOA-Bildschirm. Diese Platten werden schließlich für die Sequenzierung verwendet werden. </li><li> Streak die Kolonien von der SD-His-Platten, um einzelne Kolonien auf 5-FOA-Platten (YPD media + 1g / L 5-FOA) und Inkubation für 1-2 Tage bei 30 &amp;# 186; C, bis einzelne Kolonien erscheinen. Dabei wird 5-FOA in einen toxischen Stoff (5-Fluordeoxyuridin) in Zellen, die das URA3-Gen enthalten, umgewandelt. Somit werden alle Zellen noch beherbergen die Hsp104 Plasmid sterben. </li><li> Streak die Einzelkolonien aus den 5-FOA-Platten in doppelter Ausführung auf SD-Ura und SD-His-Platten. Test 3 Kolonien für jede getroffen, um die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer Kolonie, für jeden Treffer wird das Hsp104-Plasmid verloren haben, zu erhöhen. Inkubation für 1-2 Tage bei 30 ° C. Kolonien, die Hsp104 Plasmid wird auf SD-His-Platten, aber nicht SD-Ura Platten wachsen verloren haben. </li><li> Wachsen die Stämme, die Hsp104 Plasmide für Spek Assays verloren haben. Wachsen die Stämme in Raffinose Dropout Mediensättigung (zB sraff-His) in 96 Deepwell 2 ml Platten über Nacht bei 30 ºC unter Schütteln. Achten Sie darauf, um die 5-FOA behandelten Kontrollstämme gehören. </li><li> Bereiten Platten für Spotting-Assay. Mit einer Mehrkanalpipette, aliquoten 200 ul Raffinose Dropout Medien (zB sraff-His) proVertiefung einer 96-Well-Platte, Reservierung Spalten 1 und 7 für die gepflegte Kulturen. Aliquots von 250 &amp; mgr; l von jeder der 16 gesättigten Kulturen in den Spalten 1 und 7 der Platte. </li><li> Seriell verdünnten Kulturen 5-fach in jeder Spalte der Platte, gründliches Mischen mit einer Mehrkanalpipette. Entfernen 50 ul der verdünnten Kultur aus den Spalten 6 und 12, um das Endvolumen jeder Vertiefung 200 ul gewährleisten. Dies ist unerlässlich, um auch Schmierblutungen zu gewährleisten. </li><li> Mit einem 96-Loch-Replikator-Werkzeug (Frogger), vor Ort die Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf SD-His und SGal-His-Platten. Die Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li><li> Wählen Sie für die Sequenzierung Stämme, die Toxizität auf den SGal-His-Platten ähnlich dem der Kontrollen zeigen. Verwerfen als Fehlalarme Stämme, die nicht so giftig wie die Kontrollen sind. 5-FOA ist auch häufig auf eine eigene giftig, so verwerfen Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf SD-His-Platten oder dass eine wesentlich größere Toxizität aufweisen als die Krankheit Substrat allein ( <strong&gt; 3). </li></ol> 5. Sequenzierung des Hsp104 Varianten durch Kolonie-PCR <ol><li> Scrape ~ 10 ul Hefe aus den SD-His-Ura-Platten in 3 ul 20 mM NaOH in PCR Streifen Rohren und Lyse der Zellen durch Einfrieren und Auftauen. Legen Sie die Streifen Röhrchen in einem -80 ° C Gefrierschrank für 10 min oder in flüssigem Stickstoff, dann bei 99 ° C inkubieren in einem Thermocycler für 10 min. Verdünnen Sie die Stämme bis 100 &amp; mgr; l mit PCR-Wasser. </li><li> Bereiten PCR-Reaktionen: 5 ul PCR-Matrize, 0,5 ul 100 uM jeder Primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und stellen bis zu 25 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser. Design-Primer, die randomisierten Bereich plus etwa 100 bp an beiden Enden zu verstärken. Minimierung der Größe des amplifizierten Region, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation erhöhen. Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. </li><li> Analyse Proben durch Agarosegelelektrophorese zur Amplifikation eines PCR-Produkt der geeigneten siz bestätigene. Wiederholen PCR, wenn keine vorhanden ist. HINWEIS: PCR Ausfall ist in der Regel durch zu viel Hefe in Schritt 5.1 verwendet. </li><li> Vorbereitung der Proben für die DNA-Sequenzierung. Entfernen PCR-Primer entweder durch PCR Aufreinigung oder unter Verwendung eines PCR-Produkt Bereinigung Reagens wie Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase-Enzym (ExoSAP-IT), um einzelsträngige DNA abzubauen. Dieses Reagenz enzymatisch abbaut unincorporated Primern und dNTPs, so dass für einen höheren Durchsatz. </li><li> Sequenz, die die PCR-Produkte. Achten Sie darauf, gründlich zu analysieren Sequenzierung Chromatogramme für Mutationen. Mutationen können als Mischung von zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle (4) beobachtet werden, wie Hefe häufig beherbergen mehreren Plasmiden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt in der 5-...

Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) 1-3 entwickelt. Expression der Proteine ​​TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 3 zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen 4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine ​​oder kleine Moleküle, die verhindern oder rückgängig diese Phänotypen 2,6-13. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Proteinen, die in der Lage umzukehren Aggregation und Toxizität durch TDP-43, FUS und α-syn sind. Wir konzentrieren uns auf Hsp104, ein AAA + Protein aus Hefe, die einzigartig in der Lage Disaggregieren Proteine ​​sowohl fr istom amorphen Aggregaten und Amyloid in Hefe, es hat noch keine menschliche Homolog 14,15. Hsp104 fein abgestimmt, um endogene Hefe Prionen zerlegen und hat nur begrenzte Fähigkeit, Substrate in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die es nie gewöhnlich begegnet 16,17 zerlegen. So wollen wir verbesserte Versionen von Hsp104, die in der Lage, wirksam zu zerlegen diese menschlichen Substrate sind Ingenieur. Dazu konstruieren wir große Bibliotheken Hsp104 Varianten mit fehleranfällige PCR; Diese Bibliotheken können mit den Hefe proteinopathy Modelle 17 zu sehen sein. Wir haben eine Domain-bezogenen Ansatz zur Konstruktion und Screening-Bibliotheken angenommen, wie Hsp104 ist sehr groß 17. Wir konzentrierte sich zunächst auf die Mitteldomäne (MD) von Hsp104 17, obwohl ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere Bereiche zu screenen. Diese Modelle ermöglichen für disaggregase Aktivität direkt Screening, im Gegensatz zu alternativen Techniken wie Oberflächen Display, das andere istricted zur Überwachung Bindungs ​​18 verwenden. Unser Protokoll auf zwei Screeningschritte (Abbildung 1). Zunächst werden Hsp104-Varianten, die die Toxizität der Krankheit Substrat in Hefe unterdrücken, ausgewählt ist. Um dies zu tun, Varianten der Hsp104 und krankheitsassoziierten Substrat in Δ hsp104 Hefe kotransformiert. Wir beschäftigen Δ hsp104 Hefe Hsp104 Sequenzraum in Abwesenheit von Wildtyp (WT) Hsp104 17 zu erkunden. Wichtig ist, dass das Löschen von Hsp104 nicht beeinträchtigt α-syn, FUS oder TDP-43 Toxizität in Hefe und die Expression von Hsp104 WT eine minimale Rettungs 1,13,17. Die Hefe wird dann auf induzierenden Medium, um die Expression der beiden Proteine ​​induzieren plattiert. Hefe beherbergen Hsp104 Varianten Toxizität der Krankheit assoziierten Substrat confer Wachstum der Kolonie zu unterdrücken. Diese Varianten werden zur weiteren Analyse ausgewählt, während Kolonien aufrechterhalten Varianten, die Toxizität sterben nicht unterdrücken müssen. JedochFehlalarme sind ein wesentliches Problem in diesem Bildschirm. Expression des TDP-43, FUS und α-syn hoch toxisch, was einen starken Selektionsdruck für das Auftreten von spontanen genetischen Suppressoren der Toxizität nicht mit dem Hsp104 Variante erstellt exprimiert. Somit haben wir einen zweiten Bildschirm, der auch relativ hohen Durchsatz, diese unspezifischen Toxizität Drücker 17 zu eliminieren. In diesem zweiten Bildschirm werden ausgewählte Hefe mit 5-Fluorootic Säure (5-FOA) behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid 19. Die Stämme werden dann auf Substrat (TDP-43, FUS oder α-syn) Toxizität gegen Fleckentest, um sicherzustellen, dass die Toxizität des Substrats nach dem Verlust des Hsp104 Plasmid wieder bewertet. Somit Hefe toxisch ist in diesem Sekundärbild wiederhergestellt vermutlich ursprünglich angezeigte Toxizität Unterdrückung aufgrund der Anwesenheit des Hsp104-Variante. Diese Hefe werden als &quot;Hits&quot; bezeichnet, und die Hsp104 Plasmid sollte danngewonnen und sequenziert, um die Mutationen in der Hsp104-Gens 17 (Figur 1) zu identifizieren. Alle Treffer soll dann durch den Bau die Mutation unabhängig unter Verwendung ortsgerichtete Mutagenese und dann erneute Prüfung auf Toxizität Unterdrückung rückbestätigt werden. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Protokoll sind breit. Mit Hilfe dieser Methoden können Bibliotheken von jeder Art von Proteinvarianten, die zur Toxizität von jedem Substrat Protein, das in Hefe toxisch ist drücken gescreent werden.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorosäure</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Platten</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 fettes Replikator-Werkzeug</td><td>V& P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolieren potenzierte hsp104 varianten unter verwendung von hefe proteinopathy models

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Viele Proteinfehlfaltungsstörungen können in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae modelliert werden. Proteine wie TDP-43 und FUS, die an der amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind, und α-Synuclein, das an der Parkinson-Krankheit beteiligt ist, sind toxisch und bilden zytoplasmatische Aggregate in Hefe. Diese Merkmale rekapitulieren Proteinpathologien, die bei Patienten mit diesen Erkrankungen beobachtet wurden. Daher ist Hefe eine ideale Plattform für die Isolierung von Toxizitätssuppressoren aus Bibliotheken von Proteinvarianten. Wir sind daran interessiert, Proteindisaggregase anzuwenden, um fehlgefaltete toxische Proteinkonformere zu eliminieren. Konkret entwickeln wir Hsp104, ein hexameres AAA+-Protein aus Hefe, das in einzigartiger Weise in der Lage ist, sowohl ungeordnete Aggregate als auch Amyloid zu lösen und die Proteine in ihre native Konformation zurückzuführen. Während Hsp104 in Eukaryoten und Eubakterien hoch konserviert ist, hat es kein bekanntes Metazoen-Homolog. Hsp104 hat nur eine begrenzte Fähigkeit, ungeordnete Aggregate und Amyloidfasern zu eliminieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind. Daher wollen wir Hsp104-Varianten entwickeln, um die Proteinfehlfaltung, die bei neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle spielt, rückgängig zu machen. Wir haben Methoden entwickelt, um große Bibliotheken von Hsp104-Varianten auf die Unterdrückung der Proteotoxizität in Hefe zu untersuchen. Da Hefen anfällig für eine spontane unspezifische Unterdrückung der Toxizität sind, wurde ein zweistufiges Screening-Verfahren entwickelt, um falsch positive Ergebnisse zu eliminieren. Mit diesen Methoden haben wir eine Reihe von potenzierten Hsp104-Varianten identifiziert, die die Toxizität und Aggregation von TDP-43, FUS und α-Synuclein stark unterdrücken. Hier beschreiben wir dieses optimierte Protokoll, das an Screening-Bibliotheken angepasst werden könnte, die mit einem beliebigen Proteinrückgrat erstellt wurden, um die Toxizität von Proteinen zu unterdrücken, die in Hefe toxisch sind.

Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp104 Variant...

Hefeproteinopathie-Modelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Toxizität und Aggregation von Proteinen zu bewerten, die an Krankheiten beteiligt sind. In dieser Arbeit stellen wir Methoden zum Screening von Hsp104-Variantenbibliotheken auf Toxizitätssuppressoren vor. Dieses Protokoll könnte so angepasst werden, dass jede Proteinbibliothek auf Toxizitätssuppressoren von Proteinen untersucht wird, die in Hefe toxisch sind.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, HS P 1 0 4 Bibliotheken auf die Auswahl von Varianten zu untersuchen, die die Toxizität der Proteine unterdrücken, die mit Proteinfehlfaltungsstörungen assoziiert sind. Dies wird durch die Co-Transformation von HSP 1 0 4-Variantenbibliotheken mit einem krankheitsassoziierten Substrat in Hefe und Coex erreicht, die die beiden Proteine in einem zweiten Schritt exprimieren. Die selektierten Hefen werden mit fünf Fluor utinsäure oder fünf FOA behandelt, um die Selektion für das HSP 1 0 4 Plasmid zu treffen.Anschließend werden die Treffer sequenziert, indem die Mutagenregion mittels Kolonie-PCR amplifiziert oder die Mutationen im HSP 1 0 4-Gen identifiziert werden. Letztendlich kann die Suppression der Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats evaluiert werden, um die HS P 1 0 4-Varianten zu identifizieren, die für die weitere Charakterisierung am vielversprechendsten sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der bindungsbasierten Selektion besteht darin, dass diese Technik die Selektion von Varianten ermöglicht, die die Toxizität des krankheitsassoziierten Substrats unterdrücken.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Proteinfaltung zu beantworten, indem sie die Proteine identifiziert, die die Proteinfehlfaltung rückgängig machen können. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Potenzierung von HS P 1 0 4 geben kann, kann sie auch auf das Screening von Bibliotheken beliebiger Proteine auf die Toxizitätsunterdrückung von Substraten angewendet werden, die in Hefe toxisch sind. Im Allgemeinen werden Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da viele Kolonien möglicherweise gescreent werden müssen, um gültige Treffer zu finden. Um auf Protea-Toxizitätsunterdrückung zu screenen, beginnen Sie mit dem Waschen von HSP 1 0 4-Kolonien von den Platten mit mit Raffinose-supplementiertem Dropout-Medium, einer serologischen Pipette und sterilem Holz und Applikatoren. Übertragen Sie die flüssigen Waschungen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie die Kolonien gründlich durch, um Zellklumpen zu trennen.Anschließend verdünnen Sie die Zellsuspension zu einer leicht trüben Kultur und züchten die Zellen über Nacht in Raffinose-Dropout-Medien unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Erweitern Sie zu diesem Zeitpunkt auch die Wildtype- und Vektorsteuerelemente HSP 1, 0, 4 parallel. Die folgende Morgenplatte, ein Bereich von Zellkonzentrationen auf einzelne Galaktoseplatten, um mindestens eine Platte pro Gruppe mit einzelnen Kolonien zu erzeugen.Normalisieren Sie den Vektor und die HSP 1 0 4 Welttypkulturen auf den OD 600 der Bibliothek und der Platte. Gleiche Volumina dieser Zellen wie die experimentellen Stammkonzentrationen, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen und die Selektion zu bewerten. Bei der Stringenz wird die Bibliothek auch auf Glukoseunterdrückungsmedien plattiert und dann alle Platten zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert, bis die Kolonien anscheinend fünf FOA für die Selektion der Zellen verwenden, die HSP 1 0 4 exprimierende Plasmide nicht mehr aufrechterhalten und anschließend die einzelnen Kolonien jedes Stammes in Duplikaten auf Doppel- und Einfach-Dropout-Medienplatten pro Inkubation über Nacht bei 30 Grad Celsius streifen.Diese Platten werden später für die Sequenzierung verwendet, um ein Austrocknen der Platten zu verhindern. Wickeln Sie die SD Hiss Europlatten in Para-Folie ein und installieren Sie sie bei vier Grad Celsius, während Sie den Fünf-FOA-Bildschirm durchführen. Streifen Sie dann die Kolonien von den SD-Hissplatten zu einzelnen Kolonien auf fünf FOA-Platten für eine ein- bis zweitägige Inkubation bei 30 Grad Celsius, bis einzelne Kolonien erscheinen. Nächster.Wählen Sie aus jeder fünf FOA-Platte aus und streichen Sie. Drei überlebende Völker auf einen SD Euro und einen SD seine Platte pro überlebendem Volk nach weiteren ein bis zwei Tagen Inkubation bei 30 Grad Celsius. Die Kolonien, die das Plasmid HSP 1 0 4 verloren haben, wachsen auf SD-Hiss-Platten, aber nicht auf SD-Euro-Platten.Züchten Sie diese Stämme bis zur Sättigung in Raffinose-Dropout-Medien im Jahr 96. Tief wohl zwei Milliliter Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln tief. Um Fehlalarme zu vermeiden, führen Sie dann einen Schmierblutungstest durch.Gegen Ende der Inkubation wird eine Mehrkanalpipette verwendet, um 200 Mikroliter Raffinose-Dropout-Medium pro Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte zu aliquotieren, wobei die Spalten eins und sieben für die reinen Kulturen reserviert sind. Als nächstes aliquotieren Sie 250 Mikroliter jeder der 16 gesättigten Kulturen in die Spalten eins und sieben der Platte und verdünnen die Kulturen seriell fünffach in jede Säule der Platte, wobei Sie sie gründlich mit der Mehrkanalpipette mischen. Um eine gleichmäßige Schmierblutung zu gewährleisten, entfernen Sie dann 50 Mikroliter der verdünnten Kultur aus den Spalten sechs und 12, um sicherzustellen, dass das endgültige Volumen jeder Vertiefung 200 Mikroliter beträgt.Verwenden Sie dann ein 96-Volt-Replikator-Werkzeug, um die Kulturen in Duplikaten auf SD-Hiss- und Escal-Hiss-Platten zu erkennen. Nach einer zwei- bis dreitägigen Inkubation bei 30 Grad Celsius wählen Sie für die Sequenzierungsstämme aus, die auf den Escal-Zischplatten Toxizität aufweisen. Ähnlich wie bei den Kontrollen können falsch positive Stämme, die nicht so toxisch sind wie die Kontrollen, verworfen werden.Verwerfen Sie auch Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf der sd aufweisen. Seine Platten weisen eine wesentlich höhere Toxizität auf als das Krankheitssubstrat allein. Um die HSP 1 0 4-Varianten durch Kolonie-PCR zu sequenzieren, kratzen Sie zunächst etwa 10 Mikroliter Hefe von den SD-Hiss-Europlatten in drei Mikroliter 20 Milli Natriumhydroxid in PCR-abgestreiften Röhrchen, um die Zellen durch Einfrieren und Auftauen zu reinigen.Legen Sie die Streifen zuerst in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Nach 10 Minuten im Gefrierschrank inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 99 Grad Celsius im Thermocycler und verdünnen Sie dann die Stämme mit einer hohen Primerkonzentration auf 100 Mikroliter mit Wasser in PCR-Qualität. Führen Sie anschließend ein Standard-PCR-Programm für die Proben aus und analysieren Sie die Proben dann durch Agelelektrophorese, um die Amplifikation eines A-PCR-Produkts der entsprechenden Größe zu bestätigen.Sequenzieren Sie abschließend die PCR-Produkte und achten Sie darauf, die Sequenzierungschromatogramme gründlich auf Mutationen zu analysieren. Mutationen können als Mischung aus zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle beobachtet werden, da Hefe oft mehrere Plasmide beherbergt. In diesem repräsentativen Experiment wurde nach dem Aufbau einer Bibliothek von HSP 1 0 4-Varianten, die in der mittleren Domäne randomisiert wurden, die Bibliothek in Hefe transformiert, die ein Plasmid für die Galactose-induzierbare TDP 43-Expression enthält.Die Transformanten wurden dann zurückgewonnen und auf Glukose- und Galaktoseplatten plattiert, um die Stringenz des Screenings zu beurteilen. Die Hits wurden aus der Galaktoseplatte ausgewählt. Nach fünf FOA-Behandlungs-Spotting-Assays einer Untergruppe der Varianten, die im ersten Screening ausgewählt wurden. Es zeigte sich, dass von den vier ausgewählten Kolonien zwei HSP 1 0 4 eine TDP 43-Toxizitätssuppression aufwiesen.Einer war falsch positiv und einer wies eine erhöhte Toxizität auf. Nach fünf FOA-Behandlungen wurden die beiden wahren Treffer durch Kolonie-PCR sequenziert, um die Mutationen der mittleren Domäne zu identifizieren. Diese HS P 1 0 4-Mutationen können dann im elterlichen HSP 1 0 4-Plasmid durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden, um ihre Toxizitätsunterdrückung zu bestätigen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie verwendet werden, um bis zu 200 Treffer gleichzeitig in den fünf FO zu screenen, ein Schritt über einen Zeitraum von ein bis zwei Wochen, wenn sie richtig durchgeführt wird.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sequenzierungsergebnisse sorgfältig zu analysieren, da nach diesem Verfahren häufig Mischungen von Plasmiden erhalten werden. Andere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie die HSP 1 0 4-Varianten die Aggregation des krankheitsassoziierten Substrats beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Bibliotheken von HSP 1 0 4-Varianten für die Auswahl von Toxizitätssuppressoren überprüft werden.

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