Name: Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung von Photorezeptoraußensegmenten aus Schweine- oder Rinderretina mittels Ultrazentrifugation und Saccharose-Gradient. Diese Methode ermöglicht die Lagerung bei -80 °C für Phagozytose-Assays an Netzhautpigmentepithelzellen.

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Diese Arbeit wurde von Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs zu EFN), Fondation Voir et Entendre und Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Zuwendungen EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, Festanstellung für EFN) unterstützt und das National Eye Institute der National Institutes of Health (R01-EY13295 zu SCF). Darüber hinaus ist das Institut de la Vision by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique und Kauf de Paris finanziert.

Das POS-Isolationsexperiment ist zeitaufwendig und kann bis zu 12 Stunden benötigen, um abzuschließen, wenn POS sind vor der Lagerung gekennzeichnet. Das Protokoll wurde von einem Papier von RS Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 1997 10 veröffentlicht und von SC Finnemann und Kollegen geändert angepasst. Die Tiere wurden nach der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt. Protokolle wurden überprüft und von der Charles Darwin Ethikkommission der Universität Pierre und Marie Curie-Paris 06 und der Fordham University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Allgemeine Set Up <ol><li> Erhalten 80 frische Schwein oder Kuh Augen so frisch wie bald nach der Schlachtung wie möglich und halten sie gekühlt im Dunkeln. Geben Sie Anweisungen an den Provider, damit das Unternehmen geht auf die gleiche Weise. Dieses Protokoll wird für 80 Augen optimiert. Bisgehen Sie mit den Augen und größer werden Aktien (zB aus 160 Augen), das Doppelte der Lösungsmengen und führen 2 Runden Ultrazentrifugation; Poolproben später an der Sammelschritt (siehe Schritt 2.2.2). </li><li> Auf die Bank gesetzt die rote Dunkelkammerleuchte, absorbierende Kissen, Tücher (Material Tabelle). Bereiten Sie 15 cm Geschirr und Biohazard-Beutel für die Abfallsammlung (unbenutzt Augenteile, Glaskörper, ...). Tragen Sie eng anliegende Laborkittel, Handschuhe, Ärmelschoner und Schutzbrillen. </li><li> Vorsichtsmaßnahmen: <ol><li> Pre-Chill alle Lösungen dann kalt halten sie in allen Phasen. Halten Sie die Augen und Farbverläufe auf Eis so viel wie möglich gekühlt. </li><li> Halten Sie die Augen und abgeleitete Gewebe in der Dunkelheit so viel wie möglich, bis der Sammelschritt nach der Ultrazentrifugation zu vermeiden Bleichen der visuellen Pigmente und Verlust der Orange-rosa Farbe der aktiven Form der Photopigmente. </li></ol></li></ol> 2. Protokoll Aktionen <ol><li> Werden die Lösungen und Steigungen: <ol><li> Thaw Taurin Lager komplett mit einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Bereiten Sie alle Lösungen aus Stammlösungen (Tabelle 1, Stammlösungen) und mischen Sie die Saccharose mit anderen Inhaltsstoffen mit einem Magnetrührer für jede Lösung. <ol><li> Vorbereitung 15 ml der Homogenisierung Lösung auf eine Endkonzentration von 20% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 2 mM MgCl 2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die 25% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 25% Saccharose (unter Verwendung von 70% Saccharose stock), 20 mM Tris-Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die 60% igen Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 60% Saccharose (unter Verwendung von Saccharose-Pulver), Tris 20 mM Acetat pH 7,2, 10 mM Glucose und 5 mM Taurin. </li><li> Die Waschlösung 1 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li><li> Bereiten Sie die Waschlösung 2bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Tris-Acetat pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li><li> Die Waschlösung 3 bis zu einer Endkonzentration von 10% Saccharose, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2 und 5 mM Taurin. </li></ol></li><li> Beruhigen die Steigung Macher auf einen Magnetrührer und legen einen Rührstab in der Kammer in der Nähe der Ausfahrt, wo die 60% ige Lösung wird eingefügt. Verwenden Sie einen Cut-off-P200 Pipettenspitze am Ausgang des Rohres platziert, um eine ordnungsgemäße Gießgeschwindigkeit zu erzielen. </li><li> Guss linearen Gradienten zart durch Verdünnen und Rühren der 60% Saccharose-Lösung mit 25% eine mit 12 ml von jeder Lösung (dh insgesamt 6 Röhrchen für 80 Augen) in vorgekühlte Ultrazentrifugenröhrchen. Rühren Sie die allmählich-Verdünnung 60% Saccharose-Lösung gut. Beruhigen die Geschwindigkeit Gradientenfluss, Eingießen der Lösung reibungslos und nicht zu schnell. HINWEIS: Um einen kontinuierlichen, linearen Gradienten zu erhalten, halten Sie die Pipettenspitze Öffnung direkt an der Oberfläche der Lösung für den gesamten Gradienten Formation. </li><li> Lassen Sie die Gradienten sitzen auf Eis für etwa 1 Stunde zur Stabilisierung. Halten Sie die Steigungen gekühlt, bis geladen. Die Röhrchen nicht schütteln, um eine Unterbrechung des Gradienten zu vermeiden. </li></ol></li><li> Tissue Sammlung: <ol><li> Sammeln Gewebe unter dim rotes Licht. Nehmen Sie ein Auge in der einen Hand und stecken Sie die Front mit Rand Rasierklinge, während das Auge weg halten (um Spritzer zu vermeiden; Abbildung 1). Verwenden die Rasierklinge an der vorderen Augapfel in 2 Hälften (Kornea plus mindestens 5 mm in die Sklera) geschnitten. Entfernen Sie das Objektiv und drehen Sie die Augenmuschel von innen nach außen, so dass es über die Spitze eines Fingers damit Freilegen der Netzhaut kann stattfinden. </li><li> Mit der Rasierklinge in einem Winkel, sanft kratzen die Netzhaut, Abnehmen leicht und als rosa Schicht erscheinen, vor der Tapetum Oberfläche und an der Sehnervenkopf (Abbildung 1) zu schneiden. Sammeln Sie alle Netzhaut in 2 x 50 ml Röhrchen jeweils mit 15 ml der Homogenisierung Lösung auf Eis. </li><li> Retina homogenisierung: <ol><li> Schütteln Sie die Suspension kräftig von Hand für 2 Minuten, um die verschiedenen Zellschichten unterbrechen, brechen POS aus dem Rest der PR-Zelle, Fragment POS und homogenisieren die Netzhaut Federung. </li><li> Filter 3x durch eine Doppelschicht von sauberen Gaze, um große Gewebestücke entfernen und die Durchströmung in saubere 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1). Die Netzhaut-Suspension ziemlich dick, um den Ertrag zu maximieren, drücken Sie vorsichtig auf die Gaze, um die verbleibenden fragmentiert Gewebe nach jeder Filtration lösen. </li></ol></li></ol></li><li> Photorezeptoraußensegment Fragment (POS) Isolierung: <ol><li> Legen Sie vorsichtig das rohe Netzhaut prep, um 6-7 ml pro Röhrchen, über 6 x 30 ml Ultrazentrifugenröhrchen mit jeweils 24 ml frisch, gekühlt kontinuierlichen 25-60% Saccharose-Gradienten (Abbildung 1). Gleichen Sie die gegnerischen Rohre entsprechend der Rotor verwendet werden. Ultrazentrifuge bei 106,000 × g für 50 min bei 4 ° C. </li&gt; <li> Verringert sich die Lösung über der orangerosa Band im oberen Drittel des Gradienten durch Aspiration (2A). Sammeln Sie die orange rosa Band mit einem Cut-off-P1000 Spitze in ein Becherglas. Entsorgen Sie die Ruhe nach dem Neutralisieren mit Bleichmittel (Biomüll). </li><li> Verdünnen mit ~ 4-5 Volumina eiskaltem Wash 1 Lösung. Trennen in so viele 30-ml-Röhrchen nach Bedarf. Zentrifuge bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Pellets in 10 ml Waschlösung 2 und Schleudern bei 3.000 × g für 10 min wie oben beschrieben. Resuspendieren Pellets in 15 ml waschen 3 und Spin wieder bei 3.000 × g für 10 min. Kombinieren Suspensionen aus mehreren Pellets, um die Anzahl der Rohre vor dem Zentrifugieren benötigt in Wash 2 zu reduzieren und waschen 3 Lösungen. </li></ol></li><li> POS Aliquotierung ohne Etikettierung: <ol><li> Resuspendieren POS in 10 - 20 ml DMEM. Vorverdünnungsvertiefung 10 ul in 490 ul DMEM (1:50) und zählen als auch länglich wie wirbelte POS in eineZellzählung Kammer (2B). Berechnen Ausbeute und Konzentration im POS Partikel pro ml. HINWEIS: Die Ausbeute variiert in Abhängigkeit hauptsächlich vom Alter und der Stamm des Schweine / Kühen und Größe der Augen, beispielsweise eine gute Vorbereitung Bereiche 5-8 x 10 9 POS 80 Schweineaugen. </li><li> Entscheiden über die endgültige DMEM Volumen (typischerweise 10 - 20 ml) und füge Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 2,5% Saccharose zu ergeben. </li><li> Bereiten Aliquots der gewünschten Größe, beispielsweise 5 x 10 7 POS pro Röhrchen für eine 2 ml Resuspensionsvolumen für eine 96-Well-Experiment bei 40 &amp; mgr; l / Vertiefung. Spin 1 Aliquot für 5 min bei 2.300 × g bei RT und auswerten Pelletgröße. Bereiten verschiedenen aliquoten Größen für unterschiedliche Anwendungsmengen wie POS sollte nicht eingefroren und aufgetaut werden zweimal. </li><li> Gefriert POS Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. HINWEIS: Aliquots werden für viele Monate stabil. In unseren Händen können unmarkierten oder markierten POS für mindestens ein Jahr gelagert werden. </li></ol></li><li> POS-Kennzeichnung und Aliquotierung: HINWEIS: Wir verwenden typischerweise FITC POS zur Quantifizierung der Phagozytose Assays zu markieren, aber auch andere Farbstoffe, können ebenfalls verwendet werden, je nach Bedarf. <ol><li> Resuspendieren 1 10 mg FITC Ampulle bei einer 2,5 mg / ml Konzentration in 0,1 M Na-Carbonat-Puffer pH 9,5 hergestellt, indem 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3, pH 8,4, mit 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabelle 2, Stock-Lösungen). Drehen Sie für 1 Stunde bei RT während der Schutz vor Licht und Spin für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit zu pelletieren, nicht suspendiert FITC Feststoffe. </li><li> Resuspendieren POS Pellet in 10 ml Wash 3 -Lösung (oder DMEM) und 2 ml FITC-Lösung für 80 Augen. Bewahren Sie übrig gebliebenen FITC gefrorenen bei -80 ° C. Drehen für mindestens 1,5 h bei RT. Vor Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Wie in Abschnitt 2.3.4 beschrieben waschen beschriftet POS zweimal mit Waschlösung 3, dann ein- oder zweimal in DMEM, bis fast keine freien FITC im Überstand f gesehenraction. Resuspendieren POS in DMEM und gehen Sie wie bei nicht markierten POS zum Zählen und Aliquotierung (Abschnitt 2.4). </li></ol></li><li> Mit POS in Experimenten: <ol><li> Thaw POS bei RT, und halten Sie sie in der Dunkelheit so viel wie möglich, wenn sie fluoreszenzmarkierten sind. Spin für 5 min bei 2300 × g bei RT. Saugen Sie den Überstand. </li><li> Sofort in geeigneten Volumen Assay-Lösung zu resuspendieren, wie durch das Experiment bestimmt. Bei verschiedenen Zeiten des POS Herausforderung, resuspendiert Shop POS bei RT im Dunkeln zwischen Zeitpunkten für mehrere Stunden. </li></ol></li></ol>

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Drei Schritte und Bedingungen sind von entscheidender Bedeutung für eine optimierte Reinigung: Qualität der Guss Gradienten und zarte Farbverlauf Rohre Manipulation, wobei Gewebe gekühlt und im Dunkeln, bis die Sammlung Schritt, Stärke Schütteln von Netzhaut Homogenate die richtige POS Isolation vom Rest der PR zu erhalten Zelle. Wenn einige Probleme in richtig sehen Sie die orange Band auftreten, sind sie sehr wahrscheinlich auf einer der drei oben genannten Gründen (siehe auch den zweiten Absatz des Abschnitts <strong...

In der Netzhaut ist das Sehvermögen durch Isomerisierung von lichtempfindlichen Moleküle, so genannte Opsine, bevor es in ein Signal, das zwischen den Nervenzellen bis zu den bildenden Bereiche im Gehirn übertragen werden können, verwandelt ausgelöst. Diese Moleküle werden in Stapeln von membranöse Scheiben ähnlich Pfannkuchen, die die äußeren Segmentieren von Teilen der Photorezeptorzellen (PRs) bilden eingebettet. An ständige Exposition gegenüber Licht und damit erhebliche Mengen an oxidativen Stress ausgesetzt, PRs kontinuierlich erneuern ihre äußeren Segmente auf mögliche oxidative Schäden zu begrenzen. Photorezeptoraußensegmente sind in engem Kontakt mit apikalen Mikrovilli der benachbarten retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen. RPE-Zellen bilden den äußeren Teil der Blut-Retina-Schranke und gewährleisten eine Vielzahl von Aufgaben, die entscheidend für Photorezeptoren Gesundheit und Funktion 1 sind, wie beispielsweise Abschrecken Lichtstrahlen über die Melaninpigmente Rückisomerisierung der photoreaktiven Komponente Opsin Retinal, Bereitstellung von Nährstoffen und gACHSTUM Faktoren, die Teilnahme an PR-Metaboliten zur Verfügung. Außerdem RPE-Zellen eliminieren verbrachte POS und recyceln ihre Komponenten, eine tägliche Beschäftigung, die durch die zirkadianen Rhythmus in Säugernetzhaut 2,3 geregelt ist. Die Clearance von Schuppen POS ist für PR Überleben absolut notwendig. Wenn es vollständig außer Kraft gesetzt wird, POS Schmutz ansammeln und PRs degenerieren raschem Sehverlust 4,5. Wenn die rhythmische Profil verloren geht und durch eine konstante Aktivität ersetzt, PR und RPE-Defekte zu akkumulieren mit 6 Jahren. Daher ist es sehr wichtig, die molekularen Regulierung der RPE Phagozytose in vitro um Phänotypen seiner Dysfunktion verknüpft verstehen charakterisieren. Interessanterweise ist die molekulare Maschinerie in RPE-Zellen sehr ähnlich dem von Makrophagen verwendet, um apoptotische Zellen zu löschen, und beide sind von der Anerkennung der exponierten Phosphatidylserin auf phagozytischen Trümmer 7-9. Dennoch RPE-Zellen und Makrophagen regulieren phagocytosis verschieden Makrophagen sich für sofortige Beseitigung apoptotischer Zellen bei Begegnung Zeit während RPE Zellen rhythmisch verschlingen POS nur einmal am Tag trotz dauerndem Kontakt mit äußeren Segmenten. Dies legt nahe, spezifischen Regulationsmechanismen, die noch nicht vollständig verstanden sind. Viele der Moleküle in der RPE phagozytischen Maschinen gebracht wurden identifiziert oder bestätigt durch die Verwendung von isolierten POS und Zellkulturassays Phagozytose. Die alphavbeta5 Integrin-Rezeptor an der RPE apikalen Zelloberfläche lokalisiert, in Abstimmung mit seinem Liganden MFG-E8, bindet spezifisch an POS-10-12, die dann über die MerTK Tyrosinkinase-Rezeptor 13-15 internalisiert. Die CD36-Scavenger-Rezeptor wurde gezeigt, dass im POS Aufnahme teilnehmen und sie beeinflussen die Geschwindigkeit 16,17 und könnte als Sensor von oxidierten Phospholipiden am POS Fläche 18 dienen. Internalisierung muss die Einstellung von F-Aktin-Zytoskelett-associated Proteine ​​wie Annexin 2 19, Myosin II 20 und Myosin VIIA 21,22. Einheimische oder oxidierte POS in vitro auch genutzt werden, um Alterungs Phänotypen der RPE-Zellen in vivo, um die Ansammlung von schlecht verdauten oxidiert POS 23-28 verbunden zu verstehen. Die Erzeugung von RPE-Zellen aus Stammzellen hat eine neue Anwendung für isolierte POS, die verwendet werden, um die Funktionalität der Zellen nachweisen, bevor sie an Tieren oder Patienten transplantiert 29,30,27 eingeleitet. Zuerst von Molday und Kollegen im Jahr 1987 31 beschrieben, das Protokoll für die Isolierung von Rinder POS kombiniert eine Ultrazentrifugationsschritt retinaler Homogenate auf kontinuierliche Saccharosegradienten mit Beobachtung der charakteristische orange Aussehen ungebleichtem retinalen Photopigment (Buch 11-cis Retinal). In den letzten 10 Jahren, aufgrund Vorsichtsmaßnahmen, um das Risiko von Rinderwahnsinn zu minimieren, die Verwendung von Schweineaugen geworden increasingly prominent. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie man große Mengen von POS vom Schwein oder Rind Augen, aliquotiert und für längere Zeiträume gelagert werden können, zu erhalten. Dies beseitigt die Notwendigkeit, POS Nagetier Augen, die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren pro POS Aufbereitung und Analyse 32,33,21,22 erfordert vorzubereiten. Zusätzlich werden Informationen über POS Kennzeichnung vor der Lagerung unter Verwendung von fluoreszierenden Molekülen gegeben, zu quantifizieren und zu visualisieren POS in einer vereinfachten und vergleichbarer Weise für einige Anwendungen im Vergleich zur Kennzeichnung POS nach dem Phagozytosetest 32,10. Daher sind diese große Bestände ermöglichen Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit in vielen verschiedenen Arten von Experimenten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Spezifisches Material/Ausrüstung</td></tr><tr><td>2-Kammer-Gradientenmacher</td><td></td><td></td><td>Gradientenmacher mit 30-ml-Kammern</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td></td><td></td> mit 3 mm Durchmesser <td>für das Gradientengießen</td></tr><tr><td>Kleiner magnetischer Rührstab</td><td></td><td></td><td>Rührstab, der in die Gradientenmacherkammer passt</td></tr><tr><td>Rote Safelight-Lampe</td><td></td><td></td><td>Inaktinische Lampe zum Sezieren in der dunkel</td></tr><tr><td>Ultra Clear 25 x 89 cm Röhrchen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Ultrazentrifugationsröhrchen</td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Röhrchen</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>30 ml Zentrifugationsröhrchen</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultrazentrifuge</td></tr><tr><td>SW 32Ti Ausschwingrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Ausschwingrotor für Ultrazentrifuge</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>JA-25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>Rotor für Avanti J-26 XP Zentrifuge</td></tr><tr><td>FITC Isomer I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Fluoreszierender Farbstoff</td></tr><tr><td colspan="4">Sonstiges Material/Ausrüstung</td></tr><tr><td>Zählkammer (z.B.</td> Neubauer oder Malassez)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkle Eiskübel mit Deckel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waagen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer und Haltepol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &°; C Wasserbad-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C gefrierschrank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td>Laborkittel Gesundheits-</td><td></td><td></td><td>und Sicherheitshandschuhe</td></tr><tr><td>Ärmelschützer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schutzbrillen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saugeinlagen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Müllsäcke und Mülleimer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weck-Prep Klingen</td><td></td><td>Dissektion</td><td>60 mm/2,25 Zoll breite Rasierklingen</td></tr><tr><td>15 cm Kunststoffschale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mullblätter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 und 50 ml Röhrchen</td><td></td><td></td><td>Gängige Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

groß reinigung von schwein oder rind photorezeptoraußensegmente für phagozytose assays auf netzhautpigmentepithelzellen

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analyse eines der lebenswichtigen Funktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) -Zellen, die Phagozytose von verbrauchtem gealtert distalen Fragmente Photorezeptor äußeren Segmente (POS) kann in vitro durchgeführt werden. Photorezeptoraußensegmente mit Stapeln von membranöse Scheiben die Phototransduktion Maschinen, die kontinuierlich in der Netzhaut erneuert. Gesamte POS werden täglich von RPE-Zellen eliminiert. Nagetier, Schwein / Rind und humanen RPE-Zellen erkennen POS verschiedener Spezies in einer ähnlichen Weise. Zur Erleichterung der Durchführung von großen Versuchsreihen mit geringer Variabilität kann ein großes Lager an POS aus Schweineaugen isoliert und gelagert werden in Aliquots eingefroren werden. Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaft des Photopigmente, die eine orange Farbe an, wenn im Dunkeln gehalten. Unter schwachem Rotlicht, Netzhaut werden in einem Puffer aus geöffneten Augenmuscheln halbieren gesammelt. Das Retinazellsuspension homogenisiert, filtriert und auf einem kontinuierlichen Saccharosegradienten geladen. Nach centrifugation, POS in einer diskreten Bande im oberen Teil des Gradienten, der eine charakteristische orange Farbe hat entfernt. POS werden dann gesammelt, zentrifugiert, resuspendiert nacheinander in Waschpuffer, gezählt und aliquotiert. POS auf diese Weise erhalten wird, kann für die Phagozytose-Assays und Analyse von Protein-Aktivierung, Lokalisierung oder Wechselwirkung zu verschiedenen Zeiten nach POS Herausforderung verwendet werden. Alternativ kann POS mit Fluorophoren markiert werden, e. G., FITC, bevor Aliquotieren für nachfolgende Fluoreszenz Quantifizierung POS Bindung oder Phagozytose. Weitere mögliche Anwendungen umfassen die Verwendung von modifizierten POS oder Kassen Herausforderung verbunden mit Stressbedingungen, um die Wirkung von oxidativem Stress oder Alterung auf die RPE-Zellen zu untersuchen.

Die Kombination aus der linearen Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation ermöglicht die Trennung der verschiedenen Komponenten des retinalen Suspension durch Dichtegradientenzentrifugation. Schwer größeren retinalen Trümmer und RPE Zellen sinken auf oder nahe dem Boden des Gradienten (2A). Feuerzeug POS und leichter einzelne Zellen oder Zelltrümmer von der Netzhaut wandern als separate Bänder, um die obere Hälfte des Gradienten, der durch das Ende der Zentrifugationsdauer erreichen. Indem die Augen...

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Reinigung von Photorezeptor-Fragmenten des äußeren Segments (POS) durch Ultrazentrifugation aus Schweine-/Rindernetzhaut unter Verwendung von Homogenisierung und Saccharosegradientenzentrifugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Vorbereitung großer Bestände an POS-Aliquoten, etikettiert oder unbeschriftet, die dann bei -80 °C gelagert werden können.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, großflächige Bestände an Photorezeptor-Außensegmenten zu erzeugen, die von Kriegszeichen oder Rinderaugen gereinigt wurden. Eine der wichtigsten Funktionen des retinalen Pigments, der Epithelzellen, soll untersucht werden, ihre rhythmische tägliche OC-Säureaktivität. Dies wird erreicht, indem zunächst 25 bis 60 % Saccharose, Gradienten, in Ultrazentrifugenröhrchen gegossen werden.Anschließend werden Schweine- oder Rinderaugen präpariert und die Rey gesammelt und homogenisiert. Als nächstes werden die re filtriert und auf den Saccharosegradienten geladen und zentrifugiert, um die äußeren Segmente der Photorezeptoren zu trennen. Schließlich wird die orangefarbene Bande, die die äußeren Segmente des Photorezeptors enthält, entweder in Aliquot gesammelt, so wie sie ist, oder vor Ali markiert, zitieren und lagern.Letztendlich werden automatisierte Fluoreszenzscans, Fluoreszenzmikroskopie oder Immunoblotting eingesetzt, um die phagozytische Aktivität von Zelllinien, differenzierten Zellen aus Stammzellen oder Primärkulturen unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Isolierung von Autosegmenten von Masse oder Augen für jedes Experiment besteht darin, dass derselbe Materialpool für mehrere Experimente verwendet werden kann, was ein höheres Maß an Reproduzierbarkeit ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist praktisch, da ein kritischer Schritt im Ionenguss liegt, da es den Bereich der isolierten äußeren Segmente bedingt.Celia Parino, eine Doktorandin und zufrieden ein Techniker aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie 80 frische Schweine- oder Kuhaugen gemäß dem Textprotokoll erhalten haben, bewahren Sie sie so dunkel wie möglich im Dunkeln und gekühlt auf Eis auf. Um das Ausbleichen von Sehpigmenten und den Verlust der orangerosa Farbe auf der Bank zu vermeiden, werden die roten sicheren Lichtlampen absorbierende Pads und Tücher verwendet. Bereiten Sie eine 15 Zentimeter große Schale, Biohazard-Beutel für die Abfallsammlung und Rasierklingen vor.Sobald alle Lösungen gemäß dem Textprotokoll zubereitet wurden, kühlen Sie sie vor und halten Sie sie während aller Schritte kalt. Befestigen Sie den Gradientenbereiter auf einer magnetischen Rührplatte und setzen Sie den Rührstab in die Kammer ein, die dem Ausgang am nächsten liegt, wo die 60%ige Lösung gegossen wird. Verwenden Sie eine abgeschnittene Pipettenspitze P 200, die am Ausgang des Schlauchs platziert wird, um die richtige Gießgeschwindigkeit mit 12 Millilitern jeder 25%igen und 60%igen Saccharoselösung zu erreichen.Gießen Sie unter Rühren der 60%igen Lösung einen linearen Saccharosegradienten in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen, wobei die Öffnung der Pipettenspitze an der Oberfläche der kontinuierlich aufsteigenden Gradientenlösung belassen wird. Um Gewebe zu entnehmen, tragen Sie einen eng anliegenden Laborkittel, Handschuhe, Ärmelschützer und eine Schutzbrille bei schwachem rotem Licht, während Sie ein Auge in einer Hand halten und die Schnittfläche abgewandt halten, und verwenden Sie die Schneide einer Rasierklinge, um die Vorderseite des Auges zu durchstechen. Schneide dann mit der Rasierklinge den vorderen Augapfel in zwei Hälften.Nehmen Sie die Linse ab und drehen Sie die Augenmuschel auf links, so dass sie über die Spitze eines Fingers gehalten werden kann. Legen Sie also die Netzhaut mit der Rasierklinge in einem Winkel frei, kratzen Sie vorsichtig die Netzhaut ab, die sich leicht ablöst und als rosafarbene Schicht von der Tetumoberfläche erscheint und am Kopf des Sehnervs schneidet. Übertragen Sie die Netzhaut in eines von zwei bis 50 Milliliter Röhrchen mit 15 Millilitern Homogenisierungslösung auf Eis.Nachdem Sie alle Netzhäute gesammelt haben, schütteln Sie die Suspension zwei Minuten lang kräftig von Hand. Um die verschiedenen Zellschichten zu stören, brechen Sie die äußeren Segmente oder POS der Photorezeptoren vom Rest der Photorezeptoren ab, fragmentieren Sie das POS und homogenisieren Sie die Netzhautsuspension. Um große Gewebefragmente zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension mit der doppelten Schicht sauberer Gaze dreimal in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Drücken Sie vorsichtig auf die Gaze, um verbleibende fragmentierte Gewebe freizusetzen. Nach jeder Filtration legen Sie das rohe Netzhautpräparat vorsichtig auf sechs bis 24 Milliliter, 25 bis 60 % Saccharosegradienten. Nach dem Ausbalancieren der Röhrchen zentrifugieren Ultra 50 Minuten lang bei 106.000 g bei vier Grad Celsius.Wenn die Drehung abgeschlossen ist, aspirieren Sie den größten Teil der Lösung über dem orange-rosa Band im oberen Drittel des Gradienten. Dann mit einer P 1000 Spitze das orange-rosa Band in einem Becherglas auffangen. Verwenden Sie etwa vier bis fünf Volumina Wash One, um die Lösung zu verdünnen, und aliquotieren Sie sie in so viele 30-Milliliter-Röhrchen wie nötig.Bei 3000 GS 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen. Dann mit dem Waschen von zwei Lösung reus die Pellets suspendieren, bevor sie erneut geschleudert werden. Verwenden Sie die Lösung zum Waschen der Pellets.Ein drittes Mal. Um den POS zu aliquotieren, verwenden Sie 10 bis 20 Milliliter DMM, um die Zellen zu resuspendieren.Verwenden Sie dann 490 Mikroliter DMM, um 10 Mikroliter Zellen zu verdünnen, und berechnen Sie die Ausbeute und Konzentration in POS-Partikeln pro Milliliter neu. Entscheiden Sie sich für ein endgültiges DMM-Volumen und fügen Sie Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 2,5 % zu. Bereiten Sie die gewünschten Aliquote vor. Schleudern Sie ein einzelnes Aliquot bei 2.300 GS für drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur.Bewerten Sie die Pelletgröße und bereiten Sie verschiedene aliquote Volumina vor, um ein mehrmaliges Auftauen des Frosts zu vermeiden. Um die Zellen vor dem Eloqua-Watting zu markieren. Verwenden Sie 0,1 molaren Natriumcarbonatpuffer, um eine 10-Milligramm-Durchstechflasche ZI auf eine Konzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu resuspendieren.Eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln drehen und fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit drehen, um die restlichen ZI-Feststoffe zu pelletieren. Mit 10 Millilitern Wash Three Solution oder dmm resuspendieren Sie das POS-Pellet und fügen Sie zwei Milliliter der Fite-Lösung für 80 Augen hinzu. Verwenden Sie zum Schutz vor Licht Alufolie und drehen Sie sie mindestens 1,5 Stunden lang.Bei Raumtemperatur. Verwenden Sie die Waschlösung dreimal, um die Zellen zweimal zu waschen, wie zuvor im Video beschrieben, und dann DM EM ein- bis zweimal, bis fast keine freie Passform mehr im Überstand zu sehen ist. Verwenden Sie DM EM, um POS wiederherzustellen und einen Quat zu zählen, ähnlich wie bei unbeschrifteten POS, wie hier zu sehen.Dadurch, dass die Augen und die Proben bis nach dem Zentrifugationsschritt im Dunkeln bleiben, ist das POS-haltige Saccharose-Gradientenverbot sofort an seiner leuchtend orangefarbenen Farbe zu erkennen. Und wenn sie beschädigt sind, erscheinen sie als viel kleinere Stücke, ein wenig wie ein staubiger Hintergrund. In der Regel sollte POS, wenn es richtig isoliert ist, länglich, gerade oder gebogen erscheinen.Bei der Betrachtung unter dem Mikroskop können sie je nach Fokusebene des Mikroskops entweder dunkel oder glänzend erscheinen. Wenn sie nicht richtig resuspendiert werden, bleiben sie in Klumpen. Isolierte POS dienen dazu, die phagozytische Fähigkeit mutierter RPE-Zellen direkt zu testen.In diesem Beispiel werden POS von primären RPE-Zellen aus Wildtyp-Mäusen leicht phagozytiert, während Zellen von Beta-Fünf-Integrin- und MFG-Acht-Knockout-Mäusen in der gleichen Zeitspanne tito weniger POS aufweisen. Die Quantifizierung der POS-Phagozytose kann entweder durch manuelles Zählen von FSE-markiertem POS auf Mikroskopbildern durch Messung der Fluoreszenzintensität oder durch Durchflusszytometrie nach Zelltrypsin erfolgen. In dieser Abbildung wird die Proteinrekrutierung mittels Immunfluoreszenz, Kolokalisierungsassays analysiert, und die Rekrutierung oder Aktivierung von Proteinen kann an Immunblöcken nach Immunpräzipitation oder durch Überprüfung auf Phosphorylierung nach ihrer Entwicklung validiert werden.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der phosphatvermittelten Phagozytose, um die molekulare Maschinerie in retinalen Pigmentblütenzellen zu erforschen und zu charakterisieren und die Ergebnisse mit anderen phagozytären Zellen wie Makrophagen zu vergleichen.

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video beschreiben wir eine Technik zur Isolierung von Iris- und retinalen Pigmentepithelzellen aus Schweineaugen, um ihre Primärkulturen für in vivo und ex vivo Studien zu erhalten. Diese Pigmentzellen könnten genetisch verändert werden, um regenerative Ansätze zur Behandlung von Augenerkrankungen zu untersuchen.

Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung pigmentierter Epithelzellen aus isoliertem Schweineauge

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Isolierung der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) und der Irispigmentepithelzellen (IPE) aus geernteten Rinderaugen. Die isolierten Zellen können kultiviert werden, um ihre Rolle bei der Behandlung von Augenerkrankungen zu untersuchen.

Isolierung von RPE- und IPE-Zellen aus Rinderauge: Ein Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären Pigmentepithelzellen von Rindern

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Erfahren Sie die Reinigung von Photorezeptoraußensegmenten aus Schweine- oder Rinderretina mittels Ultrazentrifugation und Saccharose-Gradient. Diese Methode ermöglicht die Lagerung bei -80 °C für Phagozytose-Assays an Netzhautpigmentepithelzellen.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

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