Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine embryonale Cochlea abzubilden, die von einer fluoreszierenden Reportermaus in Abständen von 30 Minuten über einen Zeitraum von fünf Tagen entnommen wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Cochlea am Tag 13 von fluoreszierenden Reportermäusen entnommen wird. Anschließend werden die Cochlea in vitro kultiviert.

Anschließend werden die Cochlea-Explan-Kulturen in ein Inkubatormikroskop gelegt. Schließlich wird eine automatisierte Bildgebungsroutine eingerichtet und die Cochlea E abgebildet. Letztendlich kann die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung von Cochlea-Explankulturen verwendet werden, um morphogenetische Bewegungen des Cochlea-Epithels als Ganzes sowie Veränderungen der Reportergenexpression im Laufe der Zeit und die Auswirkungen langsam wirkender pharmakologischer Wirkstoffe zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem manuellen Fotografieren von X-Fondskulturen über einen längeren Zeitraum, besteht darin, dass dieses System vollständig automatisiert ist. Es ermöglicht die Erfassung von mehr Zeitpunkten und stellt sicher, dass dieselbe Region der Cochlea oder Zellgruppe zu jedem Zeitpunkt in der gleichen Ausrichtung abgebildet wird, während sie in einem unregelmäßigen Gewebekultur-Inkubator wächst. Nach der Supplementierung von KO's modifiziertem Eagle Medium oder DMEM und Hank's Balance Salt Solution oder HBSS gemäß dem begleitenden Textprotokoll.

Verwenden Sie unter einer Laminar-Flow-Haube fünf Milliliter mit unsu-supplementiertem DMEM, um 200 Mikroliter Basalmembransubstrat zu resuspendieren, und pipettieren Sie 150 Mikroliter in die Mitte jeder 10-Millimeter-Vertiefung einer Kulturschale mit Glasboden mit einem Durchmesser von 35 Millimetern. Inkubieren Sie 40 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 35 Grad Celsius. Um den Arbeitsplatz und die Werkzeuge vorzubereiten, schalten Sie die Laminar-Flow-Reinbank ein und verwenden Sie 70 % Ethanol, um sie abzusprühen und Pinzetten, Löffel und eine schwarze, mit Silikon beschichtete Schale einzuweichen.

Ernten Sie an der sauberen Arbeitsstation Embryonen der entsprechenden Trächtigkeit im Eis. Kaltes HBSS ergänzt mit 1%Heaps. Identifizieren Sie mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop Embryonen, die außerhalb oder innerhalb eines sichtbaren Organs Reporteraktivität zeigen, und übertragen Sie sie mit einer kühlen Lichtquelle und einer feinen Pinzette in frische, eiskalte HBSS mit 1%-Haufen zur Entnahme von Schläfenknochen.

Arbeiten Sie schnell an den Halswirbeln und unterhalb des Kiefers, um die Köpfe zu sammeln. Nach der Entnahme der Embryoköpfe gemäß dem Textprotokoll öffnen Sie vorsichtig den Schädel, entfernen dann den Hirnschnitt von der Vorderseite des Kopfes und legen den hinteren Schädel in eine Schüssel mit frischem Eis. Kalt. HBSS-Häufchen, präparieren Sie vorsichtig die erdnussförmigen Schläfenknochen und achten Sie darauf, dass das vestibuläre System intakt bleibt.

Um die Cochlea zu präparieren, übertragen Sie die Schläfenknochen in eine mit schwarzem Silikonelastomer beschichtete Schale in eiskalten HBSS-Häufchen. Stecken Sie den vestibulären Bereich des Knochens fest, indem Sie Stifte in einem schrägen Winkel einführen, um das Schläfenbein zu stabilisieren und Platz für die Pinzette zu schaffen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Knorpel, der die Cochlea umgibt, indem Sie ein Band der Pinzette am äußeren Rand der Cochlea-Basis in den Knorpel einführen und ein Loch in den Knorpel schneiden.

Clippen Sie horizontal über die Oberseite und heben Sie den vorderen Teil der Kapsel diagonal und vorsichtig ab. Führen Sie einen Zacken der Pinzette zwischen den verbleibenden Knorpel und den Gang ein und schneiden Sie den restlichen Knorpel vorsichtig ab. Die apikale Oberfläche der Cochlea ist nun freigelegt.

Beginnen Sie an der Basis, erfassen Sie den Bereich, an dem das Dach des Kanals auf das Cochlea-Epithel trifft, und öffnen Sie den Cochlea-Gang. Ziehen Sie die Dachverkleidung bei Bedarf vorsichtig ab, bis sie vollständig entfernt ist. Schneiden Sie alle Teile der Membran ab, die auf der medialen Seite des Kanals verbleiben.

Reinigen Sie dann den Gang von überschüssigem mesenchymalem Gewebe und lösen Sie den Gang vom Vestibularsystem, um Implantate zu kultivieren. Platzieren Sie eine luminale Oberfläche nach oben in der Mitte einer substratbeschichteten Kulturschale mit Glasboden. Ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig ab und lassen Sie sie zwei Minuten einwirken.

Dann tropfenweise. Geben Sie 150 Mikroliter zugesetztes DMEM in den X-Plan und achten Sie darauf, ihn nicht zu stören, damit er sich auf dem Substrat absetzen kann. Stellen Sie die Glasschalen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 12 Zentimetern und einer kleinen Schale mit sterilem Wasser, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

Legen Sie die Kulturen über Nacht in einen 35 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sich der Explan an das Substrat anheften und abflachen kann, um eine Live-Bildgebung durchzuführen. Verwenden Sie nach der Auswahl der Proben ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um den Zustand jeder explantierten Cochlea zu beurteilen, und wählen Sie nur Explantate aus, bei denen der Kanal intakt ist, und befestigen Sie sie von der Basis bis zur Spitze am Glas. Stellen Sie den Inkubator auf 35 Grad Celsius mit 5% CO2 ein, um ihn zu kultivieren.

Cochlea-Gewebe saugt das supplementierte DMEM schonend aus den Kulturen ab und ersetzt es durch mindestens 500 Mikroliter, ein frisches Medium. In Fällen, in denen Explan lose befestigt sind, pipettieren Sie einen Ring aus Medium um den Rand der Schale. Diese zusätzliche Flüssigkeit bildet eine befeuchtete Miniaturkammer, ohne den Explan zu stören, während er sich weiterhin an die Matrix anheftet.

Das Mikroskop in diesem Beispiel verfügt über eine rotierende Plattform, die 8 35-Millimeter-Probenschalen unter der Laminar-Flow-Haube hält. Ersetzen Sie die Kunststoffdeckel durch Glasdeckel und setzen Sie die Schalen in den Probenschalenhalter ein. Wenn es notwendig ist, das Medium während des Versuchs zu wechseln.

Um eine Störung des Explans zu vermeiden, verwenden Sie aufklappbare Schalenabdeckungen, die das Öffnen der Deckel ermöglichen, während die Schale im Mikroskop an ihrem Platz bleibt. Platzieren Sie den Probenschalenhalter in das Inkubatormikroskop und achten Sie darauf, dass sich der Explan nicht vom Boden der Schale löst oder das Medium stört. Um die Bildgebungsroutine einzurichten, schalten Sie die UV-Lampe und die Kamera des Mikroskops ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Wählen Sie für jede lokalisierte Probe eine Fokus- und Belichtungsebene des Bildgebungsbereichs aus und berücksichtigen Sie dabei nicht nur die Ansicht des Plans zum Zeitpunkt des Beginns, sondern auch die Art und Weise, wie sich das Gewebe im Laufe des Laufs bewegen wird.

Legen Sie im Fluoreszenzkanal einen Z-Stapel fest, der um die ausgewählte Fokusebene zentriert ist. Legen Sie dann die Häufigkeit und Länge der Abtastung für das Experiment fest. Dies wird durch die Zeit begrenzt, die benötigt wird, um Bilder zu sammeln, um am Ende eines Zeitrafferzeitraums einen Film zu erstellen.

Verwenden Sie eine Software wie METAMORPH, um die Bilddateien für ein Beispiel Bild für Bild zu öffnen. Wählen Sie die beste Fokusebene aus, um die gewünschte Zellpopulation anzuzeigen. Konvertieren Sie abschließend die Bilder in eine Punkt-a-VI-Datei oder exportieren Sie sie als Montage, um eine Reihe von Bildern zu generieren, die in einer Bildverarbeitungssoftware geöffnet und analysiert oder in andere Formate konvertiert werden können.

Hier ist ein Film zu sehen, der zeigt, wie ein organotypischer Cochlea-Explan wächst, wenn er plattiert wird. An E 13.5 wurde eine SOX-Zwei-Reporter-Maus verwendet, um die sensorische Region des Profis zu visualisieren, wie sie in Grün zu sehen ist, während sich die Zellen der nicht-sensorischen Regionen teilen und bewegen. Die nicht-proliferative sensorische Region in Grün erfährt Gewebeumlagerungen und konvergente Extensionsbewegungen.

Ein zweites Zeitraffer-Experiment, das sich auf die mittlere Basis eines anderen Cochlea-Explans konzentriert, zeigt, dass sich die sensorische Region verengt, wenn sie zum ersten Mal in Kultur auftritt. Die Gewebedicke ermöglicht es, Expressionsregionen, nicht aber einzelne Zellen zu identifizieren.

Nach drei Tagen in Kultur ist das Gewebe jedoch stark abgeflacht, so dass es möglich ist, einzelne fluoreszierende Zellen sichtbar zu machen. Andere Methoden wie Immunfluoreszenzfärbung oder Protein- und RNA-Extraktion können durchgeführt werden, um Veränderungen in der Genexpression auf molekularer Ebene zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Cochlea präpariert und kultiviert und wie man ein Inkubatormikroskop verwendet, um über einen Zeitraum von mehreren Tagen eine Live-Bildgebung auf dem gesamten Explan durchzuführen.