Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mithilfe der RNA-Sequenzierungstechnologie potenzielle Schlüsselregulatoren für die Selbsterneuerung und Differenzierung von EML-Zellen in der Maus zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst negative CD 34-positive und negative CD 34-negative EML-Zellen der Abstammungslinie anhand von Oberflächenmarkern getrennt werden. Der zweite Schritt besteht darin, mRNA zu isolieren, die mRNA in cDNA umzuwandeln und die Bibliothek für die Sequenzierung vorzubereiten.

Als nächstes wird die DNA-Bibliothek einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Der letzte Schritt besteht darin, die Sequenzierungsergebnisse zu analysieren und nach differentiell exprimierten Transkriptionsfaktoren zu suchen. Letztendlich wird die RNA-Sequenzierungstechnologie verwendet, um differentiell exprimierte Transkriptionsfaktoren in CD 34-positiven und CD 34-negativen EML-Zellen der Abstammungslinie zu zeigen.

Der Hauptvorteil der RNA-Sequenzierung gegenüber anderen G-Expressions-Prolene-Methoden, wie z. B. Mikrostrahlen, besteht darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit, Genauigkeit und einen größeren Dynamikbereich aufweist und nicht auf bereits vorhandene Genannotationsinformationen angewiesen ist. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Stammzellen zu beantworten, z. B. was die wichtigsten Transkriptfaktoren sind, die die Selbsterneuerung und Differenzierung der Zellen regulieren. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie von Blutkrankheiten, da ein besseres Verständnis des Schlüsselregulators, der die hämatopoetischen Vorläuferzellen, die Selbsterneuerung und die Differenzierung steuert, zur Entwicklung wirksamer Behandlungen führen kann.

Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da für die Sequenzierungsanalyse verschiedene Bioformatik-Werkzeuge erforderlich sind. Die Babyhamsterniere oder BHK-Zellen für die Gewinnung von Stammzellfaktoren werden in dmem Medium kultiviert, das 10 % FBS in einem 25 Quadratzentimeter großen Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 enthält. Wenn die Zellen eine Konfluenz-Trypsin-Augenzahl von 80 bis 90 % erreicht haben und sie durch Zentrifugation bei 200 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur gesammelt werden, entsorgen Sie die Snat und resuspendieren Sie die Zellpalette in 10 Millilitern frischem BHK-Zellkulturmedium.

Übertragen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in eine neue 75-Quadratzentimeter-Flasche und fügen Sie 48 Milliliter frische BHK-Zellkultur hinzu. Medium zur Kolbenkultur. Die BHK-Zellen für zwei Tage.

Nach zwei Tagen wird das Nährmedium aufgefangen und durch einen 45-Mikrometer-Filter geleitet. Lagern Sie das Medium bei minus 20 Grad Celsius. Die erythroiden, myeloischen und lymphozytären oder EML-Zellen der Maus, die in diesem Protokoll verwendet werden, werden in Suspension in EML-Basismedium kultiviert, das BHK-Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 enthält.

Halten Sie die EML-Zellen auf einer niedrigen Zelldichte mit einer Spitzendichte von weniger als 600.000 Zellen pro Milliliter. Teilen Sie die Zellen alle zwei bis drei Tage in einem Verhältnis von eins zu fünf Passage zu den Zellen sanft, aber nicht länger als 10 Generationen, um die abstammungspositiven Zellen zu erschöpfen. Ernten Sie die EML-Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für fünf Minuten.

Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und zentrifugieren Sie sie erneut, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Suspendieren Sie die Zellen erneut in PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Anzahl der Zellen wird benötigt, um im nächsten Schritt die Antikörperkonzentration zu bestimmen.

Isolieren Sie die Abstammungs-negativen oder liniennegativen Zellen mit einem Abstammungs-Antikörper-Cocktail und einem magnetisch aktivierten Zellsortiersystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um diesen Vorgang zu starten, drehen Sie die negativen Zellen fünf Minuten lang bei 200 G nach unten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit Faxpuffer. Nach dem zweiten Waschen pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 G. Beschriften Sie die fünf 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Nummern 1, 2, 3, 4 bzw. fünf.

Resuspendieren Sie die Zellen mit einem geeigneten Volumen an Faktenpuffer auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro 100 Mikroliter. Aliquotieren Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension in jedes der fünf Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie ein Mikrogramm Anti-Maus-Antikörper CD 34 FE in das erste und das zweite Röhrchen.

Mischen Sie die Röhrchen, inkubieren Sie alle Röhrchen vorsichtig bei vier Grad Celsius für eine Stunde im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie Punkt 25 Mikrogramm PE-konjugierte Antika, einen Antikörper und 20 Mikroliter einer PC-konjugierten Linie hinzu. Cocktail-Antikörper zu zwei eins, fügen Sie Punkt 25 Mikrogramm PE-konjugierter Antika-Eins-Antikörper zu Röhrchen drei und 20 Mikroliter einer PC-konjugierten Linie hinzu.

Cocktail-Antikörper gegen Röhrchen vier. Mischen Sie die Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für weitere 30 Minuten im Dunkeln. Geben Sie nach 30 Minuten 300 Mikroliter Faxpuffer in alle Röhrchen und schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 G.

Waschen Sie die Zellen nach dem letzten Waschen dreimal mit 500 Mikrolitern Faxpuffer. Reanimation: Suspendieren Sie jedes Zellpellet in 500 Mikrolitern Faxpuffer, isolieren Sie lin-negative SCA-positive CD 34-positive und lin-negative SCA-negative CD 34-negative Zellen in Röhrchen eins durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die Gesamt-RNA wird aus den lin-negativen CD 34-positiven und lin negativen CD 34-negativen Zellen mit Triol extrahiert und die kontaminierte DNA wird mit der Desoxyribo-Nuklease eins entfernt.

Beurteilen Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers die Qualität der Gesamt-RNA mit einem Bioanalysator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die mRNA-Extraktion und die anschließenden Verfahren zum Aufbau der Bibliothek werden nur RNA-Proben mit einer RNA-Integritätsnummer oder einer RIN von mehr als neun verwendet. Diese Abbildung zeigt das Ergebnis einer hochwertigen RNA-Probe mit einer RIN von 9,4. Das hier verwendete Bibliothekskonstruktionsprotokoll ist spezifisch für die Illumina RNA-Sequenzierungsplattform und verwendet ein RNA-Probenvorbereitungskit.

Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, da in diesem Video nur ausgewählte Schritte gezeigt werden. Beginnen Sie mit der positiven Selektion von Poly-MNA unter Verwendung von Oligo-DT-Magnetkügelchen. Als nächstes fragmentieren Sie die Poly-mRNA und führen eine reverse Transkription mit zufälligen Primern durch, um die mRNA in CD NA umzuwandeln. Anschließend wird der synthetisierte zweite Strang CD NA zur Erzeugung doppelsträngiger DNA verwendet.

Als nächstes werden die drei Prime-Überhänge entfernt und die fünf Prime-Überhänge mit DNA-Polymerase-Denat gefüllt. Die drei Primzahlen von CD NA fragmentieren von der Ligation aneinander. Fügen Sie Multiplex-Indexierungsadapter an beiden Enden der doppelsträngigen CD NA für die Sequenzierung hinzu.

Führen Sie schließlich eine PCR zur Anreicherung der CD-NA für Fragmente mit einem Spektralphotometer durch, messen Sie die Extinktion zwei 60 über die Absorption zwei 80 der amplifizierten DNA. Um Informationen über die Konzentration der Bibliothek zu erhalten, beurteilen Sie die Qualität der Bibliothek und messen Sie den Größenbereich der DNA-Fragmente mit einem Bioanalysator. Die Methoden zur Datenanalyse der RNA-Sequenzierung sind im begleitenden Protokoll Text zu finden und umfassen die Verarbeitung von Datendateien für die nachgelagerte Analyse, den Nachweis neuartiger Transkripte und die Bewertung des Expressionsniveaus, den Nachweis differentiell exprimierter Gene und die Identifizierung differentiell exprimierter Transkriptionsfaktoren.

Lineage-negative EML-Zellen wurden mit Anti-CD 34-Antica-One- und Lineage-Cocktail-Antikörpern sowie lin-negativen Schädel-positiven, CD 34-positiven und Lin-negativen SCA-Antikörpern gefärbt. Negative CD 34-negative Zellen wurden ausschließlich durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung getrennt. Lin-negative Zellen wurden für die Analyse der Expression von SCA one und CD 34 gegated.

Zwei Populationen von EML-Zellen wurden beobachtet, als der Bibliotheksbau abgeschlossen war. Die Größe der DNA-Fragmente in der Bibliothek wurde mit einem Bioanalysator überprüft. Diese repräsentativen Daten zeigen eine qualitativ gute Bibliothek, aber die Fragmentgröße erreicht einen Spitzenwert von etwa 300 Basenpaaren.

Der D-E-S-E-Q-Algorithmus wurde für die differentielle Expressionsanalyse mit Schwerpunkt auf differentiell exprimierten Transkriptionsfaktoren verwendet, da Transkriptionsfaktoren für die Sulfatbestimmung entscheidend sind. Es wurden Transkriptionsfaktoren gefunden, die sich mehr als 1,5-fach zwischen lin-negativer CD 34-positiver und lin-negativer CD 34-negativer CD 34-negativen ändern und in dieser Heatmap dargestellt sind. Bemerkenswert ist, dass das relative Expressionsniveau von TCF sieben in lin-negativen CD 34-positiven Zellen mehr als 100-fach höher ist als das in lin-negativen CD 34-negativen Zellen.

Daher wurde TCF seven für weitere Chromatin-Immunpräzipitations- und Sequenzierungsanalysen sowie Funktionstests ausgewählt, um seine Funktion bei der Regulation der Selbsterneuerung und Differenzierung in EML-Zellen zu bestätigen. Sobald die RNA-Bibliothek beherrscht ist, kann sie in wenigen Tagen fertiggestellt werden, und das gesamte Verfahren kann in etwa einem Monat abgeschlossen sein, wenn es nach seiner Entwicklung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Diese Technologie ebnete den Weg für Forscher, die bereit sind, die differentielle Genexpression zwischen verschiedenen Zelltypen und Geweben wie B-Zellen und bösartigen B-Zellen zu erforschen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine hohe CAR-TRNA zu verwenden, da dies die Grundlage des gesamten RNA-Sick-Verfahrens ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie wichtige Regulatoren identifizieren können, die die Erneuerung und Differenzierung von EML-Zellen steuern.