Synergetische Nutzung von neuralen Vorläuferzellen und Self-Montage Peptide in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Einführung eines Contusionskompressionsclip-Modells der zervikalen Querschnittlähmung bei Ratten und eines Protokolls für eine kombinierte Behandlung mit SAP-Injektion und NPC-Transplantation. Zuerst wird ein Aneurysmaclip um das Rückenmark gelegt und eine Minute lang an Ort und Stelle gehalten. Daraus resultiert eine beidseitige Prellung, Kompressionsverletzung.

Als nächstes werden SAPs im Epizentrum der Verletzung injiziert, NPCs werden unmittelbar nach der SAP-Injektion injiziert. Eine osmotische Pumpe mit einem subduralen Katheter wird für die nachhaltige Abgabe von Wachstumsfaktoren eingeführt. Dieses Verfahren führt dazu, dass NPCs an das verletzte Rückenmark abgegeben werden.

Das Überleben und die Transplantation von NPCs wird durch eine kombinatorische Behandlung mit SAPs und Wachstumsfaktoren unterstützt. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf eine Therapie für traumatische Rückenmarksverletzungen, da sie ein klinisch relevantes Modell darstellt, das zur Untersuchung zellbasierter COMBINATOR-Therapien verwendet werden kann, die die Regeneration des Rückenmarks fördern. Das folgende Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care Committee des University Health Network, Toronto, Kanada, genehmigt und steht in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die in dem vom Canadian Council of Animal Care erstellten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren festgelegt sind.

Alle chirurgischen Eingriffe müssen unter sterilen Bedingungen mit sterilen Geräten und Lösungen durchgeführt werden, und gemäß den Richtlinien der Institution und der Regierung werden bei diesem Verfahren vor Beginn des Eingriffs Ratten mit einem Gewicht von 250 bis 270 Gramm behandelt. Stellen Sie den Tieren am Tag des Eingriffs zwei Tage lang Antibiotika im Trinkwasser zur Verfügung. Nachdem Sie die Ratte in eine Anästhesiekammer gelegt und eine Minute lang eine Anästhesie mit 5 % ISO-Fluor in eins zu eins Sauerstoff und Distickstoffmonoxid eingeleitet haben, reduzieren Sie den ISO-Fluorgehalt auf 1,8 bis 2,2 %. Tragen Sie die Lambic-Salbe auf die Augen auf und bestätigen Sie die chirurgische Anästhesie, indem Sie eine Pfotenkneifung durchführen.

Legen Sie dann die Ratte auf ein beheiztes Kissen und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen mit einem Nasenkonus. Nach der Rasur des Fells um die Halswirbelsäule desinfizieren Sie die Haut durch Abtupfen mit Povidon-Jod, gefolgt von 70% Ethanol, nachdem Sie einen Mittellinienschnitt von der Region der beiden Halswirbel C bis zu den hervorstehenden Fortsätzen des Brustwirbelkörpers T zwei gemacht haben. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die äußere Schicht der Wirbelmuskulatur direkt an der Mittellinie in Schädelrichtung durch, mit einer chirurgischen Schere stumpf die tieferen Muskelschichten bis zur Processis, Osis und Laminat ab

Winkelmesser einsetzen und festhalten. Öffnen Sie die Muskelschichten, richten Sie dann die prominente Prozessposition der beiden Wirbelkörper aus und identifizieren Sie die Zielebenen für die Laminektomie. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell Nr. 15 die Bandhäutung durch, um die Lamellen und die Processis posis zu lockern.

Verwenden Sie als Nächstes einen Knochenschneider, um die Lamellen lateral des Rückenmarks zu durchtrennen, und entfernen Sie die Lamelle vorsichtig, ohne das Rückenmark zu komprimieren. Nehmen Sie sich nun einen Moment Zeit, um die entstehenden Nervenwurzeln zu identifizieren, um sie vor dem Clipping zu schützen. Lösen Sie dann mit einem Haken die ventrale Dura von der dorsalen Seite der Wirbelkörper und bereiten Sie einen Korridor für den Clip vor.

Stellen Sie sicher, dass die Ringfeder des Clips so eingestellt ist, dass sie die gewünschte Kraft abgibt. Die Clipkraft bestimmt das Ausmaß des Traumas und der Kompression. Führen Sie den offenen Clip um das Rückenmark ein und lassen Sie ihn zuschnappen, um eine Prellung herbeizuführen.

Häufig werden Clipkräfte zwischen 15 und 35 Gramm mit einer Clipdauer von einer Minute nach der Querschnittlähmung eingesetzt. Entfernen Sie den Clip und schließen Sie die Muskeln in zwei Schichten, gefolgt von einem Verschluss der Haut. Sobald die Wunde richtig verschlossen ist, stoppen Sie die Narkose und beobachten Sie die Ratte, während sie aufwacht.

Nachdem das Tier wieder genügend Bewusstsein für das Brustbein und Liegen erlangt hat, setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig. Aufgrund der Schwere dieser Art von Verletzung ist es zwingend erforderlich, dass die folgenden postoperativen Behandlungen befolgt werden. Achten Sie zunächst darauf, Schmerzmittel wie Buprenorphin und Meloxicam je nach Symptomen drei bis fünf Tage lang zu verabreichen.

Verhindern Sie auch Dehydration durch subkutanes Essen. Injektion von fünf bis 10 Millilitern Kochsalzlösung zweimal täglich für drei Tage und weitere Antibiotika im Trinkwasser für fünf Tage. Nach der Operation. Drücken Sie die Harnblase zwei- bis dreimal täglich zusammen, bis eine konsistente Wiederherstellung der Blasenfunktion erkennbar ist, auch wenn die Tiere wieder gesund zu sein scheinen.

Achten Sie darauf, die operierten Tiere auf neurologische Defizite und physiologischen Zustand zu beobachten. Die Injektion erfolgt 14 Tage nach einer Rückenmarksverletzung. Bereiten Sie vor Beginn der Operation die SAPs in einer Konzentration von 1 % Gewicht pro Volumen in sterilem Wasser vor und füllen Sie eine 100-Mikrometer-Glaskapillare, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist.

Befestigen Sie mit der Lösung die Hamilton-Spritze am stereotaktischen Rahmen. Nach der Betäubung fixiert die Ratte den Kopf in den stereotaktischen Rahmen und desinfiziert die Operationsstelle mit Povidon, Jod und 70%igem Alkohol. Wie zuvor wird nach dem Öffnen der Haut das Paar der Wirbelmuskulatur vorsichtig präpariert und Retraktoren eingesetzt.

Verwenden Sie ein Skalpell mit der Nummer 15, um das Narbengewebe von der Dura zu entfernen und die Läsionsstelle wieder freizulegen. Dann mit der Spitze einer scharfen Nadel die Dura vorsichtig öffnen. Zum Schluss führst du stereotaktisch die Glaskapillare bis zu einer Tiefe von zwei Millimetern in das traumatisierte Rückenmark ein und injizierst die SAPs.

Lassen Sie die Kapillare nach der Injektion der SAPs eine Minute lang an der Injektionsstelle verbleiben, bevor Sie sie entfernen, damit das Gewebe gedehnt werden kann, um die injizierte Lösung aufzunehmen. Wiederholen Sie dann die Injektion an der nächsten Stelle. Hier wurden NPCs aus der paraventrikulären Zone einer adulten roten DS-Maus isoliert und nach zuvor veröffentlichten Verfahren kultiviert.

Kurz vor der Mikroinjektion verdünnen Sie die NPCs in Wachstumsmedium auf eine Konzentration von 50 mal 10 bis zum dritten lebenden Zellen pro Mikroliter für die Zelltransplantation und laden Sie sie in eine Glaskapillare auf einer Hamilton-Spritze. NPCs werden sofort nach der Injektion von SAPs injiziert. Führen Sie dazu die Glaskapillare der Hamilton-Spritze 0,2 Millimeter rostral der Verletzungsstelle und 1,5 Millimeter unterhalb der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks ein.

Injizieren Sie zwei Mikroliter der Zellsuspension mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 Mikrolitern pro Minute. Lassen Sie die Kapillare nach Abschluss der ersten Injektion eine Minute lang wie zuvor im Rückenmark verbleiben, ziehen Sie dann die Kapillare zurück, bewegen Sie sie an eine benachbarte Stelle und wiederholen Sie den Injektionsvorgang. Nachdem Sie wie zuvor eine Minute gewartet haben, ziehen Sie die Kapillare zurück und bewegen Sie sie zwei Millimeter weit zur Verletzungsstelle.

Führen Sie an dieser Stelle zwei Zwei-Mikroliter-Injektionen durch. Dieses Bild zeigt alle Injektionsstellen relativ zur Rückenmarksverletzung. Die Implantation von subduralen Mini-Osmosepumpen zur Unterstützung des Wachstumsfaktors erfolgt unmittelbar nach der NPC-Injektion.

Wählen Sie zunächst eine Implantationsstelle. Bevorzugte Stellen sind die lateralen Flanken der thorakoabdominalen Region, um Beschwerden zu vermeiden, die durch die Pumpe selbst verursacht werden. Nach der Desinfektion des Bereichs wird wie zuvor eine subkutane Aussparung für die Pumpe vorbereitet.

Führen Sie anschließend eine Skip-Laminektomie des oberen oder unteren Wirbels durch, der an die Rückenmarksverletzung angrenzt. Hier wurde die Rückenmarksverletzung bei C sieben T eins durchgeführt, so wird die Laminektomie bei C fünf durchgeführt. Platzieren Sie nun die Pumpe in der Unterhautaussparung, schneiden Sie den Katheter auf die erforderliche Länge und befestigen Sie ihn schließlich mit 6.0-Nähten an den Wirbelmuskeln.

Vermeidung von bewegungsbedingten Luxationen. Verwenden Sie die Spitze einer scharfen Nadel, um die Dura unterhalb der Laminektomie zu öffnen. Führen Sie dann den Katheter in den Subduralraum ein und lassen Sie ihn in Koppelrichtung gleiten, ohne Widerstand und ohne die Nabelschnur zu verletzen.

Überprüfen Sie nun, ob der Katheter reibungslos läuft und keine Knicke oder Falten aufweist, wie hier gezeigt. Dann verschließen Sie die Muskeln Schicht für Schicht mit Nähten oder Clips und schließen Sie dann die Haut. Sobald die Wunde richtig verschlossen ist, stoppen Sie die Narkose und beobachten Sie das Tier, während es aufwacht.

Nachdem das Tier wieder genügend Bewusstsein für das Brustbeinliegen erlangt hat, setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig. Achten Sie darauf, alle postoperativen Behandlungsverfahren zu befolgen, einschließlich der Überwachung des Tieres und der postoperativen Analgesie. Die Immunsuppressionsbehandlung ist zwei Tage vor der NPC-Injektion und bis sieben Tage nach der Transplantation bzw. bis zur Opferung zu verabreichen.

Diese fluoreszenzmikroskopische Aufnahme zeigt einen Längsschnitt eines traumatisierten Rückenmarks einer Ratte. Die Färbung besteht aus DPI-Fluoreszenz-SAPs, die mit QL sechs markiert sind. Die Anfälle erscheinen grün und haben sich im Epizentrum der Läsion angesammelt.

Injizierte DS-Rot-positive NPCs sind in rostraler und verhätschelter Richtung diffundiert, was durch die rote Fluoreszenz angezeigt wird. Der Maßstabsbalken stellt fünf Millimeter dar. Hier zeigt ein Rasterelektronenmikroskop-Bild die Bildung von Nanofaser-Gerüsten aus zusammengesetzten SAPs.

Der Maßstabsbalken stellt einen Mikrometer dar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die chirurgischen Verfahren haben, die mit der Clip-Kompression und der Rückenmarksverletzung verbunden sind, und wie der vielversprechende Ansatz der kombinierten Behandlung mit SAPs und NPCs in diesem Modell untersucht werden kann.