Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Bauchnervenstrang vom Krebs zu trennen, um ihn in elektrophysiologischen Studien zu verwenden. Dies wird erreicht, indem der Krebs zunächst betäubt wird. Als nächstes wird eine grobe Dissektion durchgeführt, um die Bauchplatte des Krebses zu isolieren.

Dann wird eine Feindissektion durchgeführt, um das Zentralnervensystem von den Ganglien rais bis zu den Bauchganglien vollständig zu isolieren. Eine Sechs. Schließlich wird die Ganglienscheide von allen Ganglien entfernt, um elektrophysiologische Experimente zu ermöglichen.

Letztendlich wird die Kette der Bauchganglien für zusätzliche oder intrazelluläre Aufzeichnungen verwendet. Um die Koordination zentraler Mustergeneratoren zu untersuchen oder um die Morphologie und den synaptischen Kontext identifizierter Neuronen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Bereitstellung praktischer Erfahrungen über die Funktion des Nervennetzwerks, um die fic FLA-Bewegung im isolierten Nervensystem aufzeichnen zu können, oder die Charakterisierung der Morphologie von Bauchganglien oder der von spezifischen Neuronen.

Diese Methode kann jedoch einen Einblick in das Schwimmratensystem von Krebsen geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. ein neuronales Netzwerk, das das Schwanzschlagverhalten bei Krebsen steuert. Arbeiten mit dem Krebs Pacific Stacia Linea Guus. Nachdem Sie ein Tier gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, halten Sie es mit der Bauchseite nach oben und schneiden Sie mit einer starken Schere beide Krallen an ihren Basen in der Nähe des Thorax ab.

Entfernen Sie dann die linken und rechten Europods. Legen Sie das Tier mit der Bauchseite nach oben in eine mit schwarzer Sarde ausgelegte Sezierschale, bevor Sie mit kalter Kochsalzlösung durch die Krallenöffnung perfundieren. Als nächstes machst du mit einer starken Schere einen einzelnen Querschnitt direkt hinter den Augen des Krebses, um ihn zu enthaupten.

Entfernen Sie dann alle Gehbeine in der Nähe der Basisgelenke, um den Bauch zusammen mit den letzten Brustsegmenten vom Rest des Brustkorbs zu isolieren. Führen Sie die Spitze der Schere in die Öffnung des zweiten Laufbeins ein und schneiden Sie zur gegenüberliegenden Seite. Nachdem Sie den Schnitt zu beiden Seiten durch den Thorax verlängert und einige der inneren Organe freigelegt haben, wie im Textprotokoll beschrieben, entfernen Sie den vorderen Teil des Thorax.

Entfernen Sie nun die inneren Organe und spülen Sie das Tier mit kalter Kochsalzlösung ab. Setzen Sie die Dissektion mit einem Schnitt in maximaler lateraler Position zwischen dem Lumon und den Schwimmratten über die gesamte Länge der Brustbeinplatte fort. Machen Sie den gleichen Schnitt auf der anderen Seite.

Lege den Bauch des Krebses mit der Bauchseite nach oben in die Sezierschale. Verwenden Sie Insektenstifte, um das Exemplar nach hinten am Tellson und nach vorne an den Resten der Carabase zu befestigen. Füllen Sie die Schale mit Krebssalzlösung, so dass sie das Exemplar bedeckt.

Greifen Sie mit einer groben Pinzette in der linken Hand durch eine Laufbeinöffnung und ziehen Sie die Probe auf. Identifiziere die beiden großen Stränge der dorsalen Beugemuskulatur. Fixieren Sie sie und schneiden Sie ihre ventralen Basen sowie die Brustbeinarterie durch.

Legen Sie die ersten Bauchganglien A eins und die zugehörigen Nerven N eins N zwei frei. Kommen wir nun zum zweiten Bauchsegment. Entfernen Sie die Basis der Muskelstränge in der Nähe der ventralen Basis.

Zu sehen ist nun das Bauchganglion A zwei mit den zugehörigen Nerven N eins, N zwei und N drei. Die Nerven N drei an der am weitesten vom Nervenstrang entfernten Stelle durchschneiden. Wiederholen Sie diese Schritte für die nächsten drei Bauchsegmente mit den Bauchganglien.

Eine Drei bis eine Fünf. Beim Erreichen des Bauchganglion wird eine Sechs. Schneiden Sie die Sternumplatte hinter den Nerven einer Sechs.

Behalten Sie den ventralen Teil und stecken Sie ihn fest. Mit der Rückenseite nach oben in der mit Kochsalzlösung gefüllten Schale unter dem Mikroskop. Verwenden Sie eine Pinzette, um die vordersten Teile des Cephalon thorakalis zu entfernen.

Schneide dann die Muskeln zwischen den verbliebenen Exoskelett-Strukturen durch. Nachdem Sie das vordere Ende des ventralen Nervenstrangs vorsichtig angehoben haben, schneiden Sie die Thoraxnerven seitlich durch. Fokussiere dich auf eine Eins und schneide die Nerven N eins und N zwei von eins mit maximal einem Zentimeter Länge durch, um sie festzustecken.

Gehen Sie als nächstes zu A zwei und identifizieren Sie die Nerven N eins, N zwei und N drei dieses Segments. Die Nerven n einer der Bauchganglien, eine zwei bis eine fünf. Sie befinden sich zwischen zwei sternalen Kutikularen in Entfaltungen in jedem Segment und sind von der Muskulatur bedeckt.

Dann, beginnend am lateralen Rand des Bauches, machen Sie einen Schnitt entlang der hinteren sternalen Kutikularfaltung und fahren Sie in Richtung Mittellinie fort, nachdem Sie N eins gemäß dem Textprotokoll freigelegt haben. Gegebenenfalls den Nerv so distal wie möglich durchtrennen. Fahren Sie mit der kontralateralen Seite fort und beginnen Sie, den Nerv N eins von der Mittellinie in der Nähe des Ganglions in Richtung des lateralen Randes zu isolieren, indem Sie entlang der hinteren sternalen kutikulären Hülle schneiden.

Schneiden Sie nun die Nerven N zwei dieses Ganglions auf eine geeignete Länge zum Feststecken. Wiederholen Sie dann die für die Bauchganglien gezeigten Schritte. Eine Zwei für eine Drei bis eine Fünf so distal wie möglich.

Schneiden Sie die Nerven des Ganglions eine Sechs. Greife mit einer Pinzette mehrere Sechsernerven, um das Ganglion anzuheben und die Ganglienkette von der Sternumplatte zu isolieren. Nachdem Sie den Nervenstrang vollständig isoliert haben, übertragen Sie die Ganglienkette in eine Petrischale, die mit einem durchsichtigen Schwellerschutz ausgekleidet und mit Kochsalzlösung gefüllt ist, indem Sie kleine Stifte aus Edelstahldraht verwenden, während Sie eine sanfte Dehnung anwenden.

Stecken Sie die Ganglienkette in einer geraden Linie fest, wobei der Nervenstrang mit der dorsalen Seite nach oben angeordnet ist. Behalten Sie nur die letzten beiden Brustganglien und stecken Sie die Brustnerven zur Seite. Stecken Sie die Nerven einer Eins in einem 90-Grad-Winkel relativ zum Nervenstrang fest.

Fahren Sie dann mit einer Zwei fort und stecken Sie die Nerven N zwei in einem Winkel von 35 bis 45 Grad relativ zum Nervenstrang. Sobald die Nerven N eins getrennt und gemäß dem Textprotokoll festgesteckt sind, wird der vordere Ast des Nervs N eins in einem 90-Grad-Winkel an den Nervenstrang geheftet. Stecken Sie dann den hinteren Ast des Nervs N eins zwischen den vorderen N einen Ast und den Nerv N zwei.

Da alle Bauchganglien ummantelt werden müssen, wird mit einer feinen Federschere ein kleiner seitlicher Schnitt durch die Ganglienscheide hinter dem Ganglion und zwischen den Nerven N zwei und N drei gemacht. Quer über die Scheide oberhalb des Verbindungsgewebes schneiden. Schneiden Sie es dann weiter entlang der seitlichen Ränder des Ganglions, bevor Sie die Scheide entfernen.

Verwenden Sie bei Bedarf eine feine Pinzette, um die Hülle anzuheben, um extrazelluläre Aufzeichnungen durchzuführen. Nach dem Aufbau der Werkzeuge und Reagenzien, die im Textprotokoll aufgeführt sind, legen Sie die Ganglienkette auf den Mikroskoptisch und beleuchten Sie sie von unten. Die Aufzeichnungselektrode wird in der Nähe des Zielnervs und die Referenzelektrode in der Nähe, aber lateral der Ganglien, in den Sylschutz eingeführt.

Beugen Sie dann den Zielnerv um die Aufnahme. Nachdem Sie den Nerv gedehnt und gesichert haben, verwenden Sie eine mit Vaseline gefüllte Spritze und eine 20-Gauge-Nadel mit abgerundeter Spitze, um den Zielnerv von der Badelösung zu isolieren. Wiederholen Sie dies für alle Nerven, deren Aktivität aufgezeichnet werden soll.

Beginnen Sie schließlich mit der Aufnahme, wie hier gezeigt, beginnt die extrazelluläre PS-Aktivität von ipsilateralen PS zwei bis PS fünf Motoneuronen mit einem PS-Ausbruch in einer Fünf und die Erregungswelle breitet sich in anteriore Richtung aus. Darüber hinaus bleibt die Zeit, die vom Beginn eines Bursts bis zum Beginn des nächsten Bursts in jedem Segment gemessen wird, konstant und ist definiert als die Periode der Rhythmusperioden und des Bursts. Die Dauer kann zwischen verschiedenen Präparationen variieren, aber die Phasenverzögerung zwischen den Segmenten bleibt unabhängig von der Frequenz des Rhythmus bei etwa einem Viertel des Zyklus konstant.

Diese Koordinationsmuster lassen sich am besten in den hier gezeigten Phasenhistogrammen erkennen. Hier zeigen intrazelluläre Ableitungen aus den Dendriten von Ps.Motoneuronen mit Hilfe von scharfen Mikroelektroden Enphase-Oszillationen einzelner Neuronen mit der extrazellulär aufgezeichneten Aktivität aller PS-Motoneuronen desselben Hemiganglions. Um intrazellulär aufgezeichnete Neuronen zu identifizieren, können Zellen mit scharfen Mikroelektroden und Iontophorese gefüllt werden.

In dieser Abbildung befindet sich das ventrale Soda von zwei gefüllten PS-Motoneuronen hinter der Basis des Nervs N eins. Der primäre Neurit projiziert nach anterior und verzweigt sich innerhalb der lateralen Neuropille. Das Axon projiziert durch den hinteren Ast des Nervs N eins zur Muskulatur.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten bis zu einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Kochsalzlösung in regelmäßigen Abständen zu wechseln, um das Nervengewebe gesund zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die intrazelluläre Aufzeichnung von Motoneuronen oder Interneuronen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Analyse des zellulären Koordinationsmechanismus, die Messung von Ionenströmen oder die Untersuchung der Wirkung von Neuromodulatoren auf die rhythmische Aktivität bestimmter Zellen.