A Novel In vitro Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkungen zwischen Blut und Endothelzellen mit Hilfe eines neuartigen Blut-Endothelkammer-Assays zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blut von einem gesunden Freiwilligen durch Venenpunktion mit offenem System entnommen wird. Im zweiten Schritt wird das Blut vorsichtig auf mit Heparinoberfläche beschichtete Blutkammern geschichtet, die mit Endothelzellkulturen plattierten Objektträgern gekoppelt sind.

Anschließend werden diese Endothelzellkammern im Blut sanft rotiert, um die Interaktion zwischen dem Blut und den Endothelzellen zu erleichtern. Letztendlich können die Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen dem Blut und den Endothelzellen und die daraus resultierende Produktion des Thrombin-Antithrombin-Komplexes durch Immunfluoreszenzmikroskopie bzw. Eliza beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. denen mit Tiermodellen, besteht darin, dass hier ein humanes Modellsystem verwendet werden kann, um Gefäßerkrankungen vor Beginn des Experiments zu untersuchen.

Koppeln Sie eine 18-Gauge-Injektionsnadel an ein Stück mit einem Innendurchmesser von zwei Millimetern aus heparinbeschichtetem Silikonschlauch. Die Kunststoffoberflächen sind mit Heparin beschichtet, um eine unspezifische Aktivierung der Gerinnung zu verhindern. In diesem Bild ist zum Beispiel ein Gerinnsel in dieser unbeschichteten Kammer deutlich zu erkennen.

Nach 30 Minuten Blutkontakt schützt die Behandlung der Kammer mit der Heparinoberfläche das Blut vor unkontrollierter Aktivierung und stellt sicher, dass die Ergebnisse auf die Wechselwirkungen mit dem Blut der Endothelzellen zurückzuführen sind. Erst nach dem Anschließen des Schlauchs entnehmen Sie vorsichtig eine Blutprobe von einem gesunden Spender durch Venenpunktion des offenen Systems in ein 50 Milliliter heparinbeschichtetes Röhrchen. Ergänzen Sie das gesammelte Blut mit unfraktioniertem Heparin, um eine Endkonzentration von 0,75 IE pro Milliliter zu erreichen, und drehen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal um, um es schonend zu mischen.

Zur Analyse der anfänglichen Blutproteinkonzentration mischen Sie vorsichtig einen Milliliter Blut pro Röhrchen in Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 Mikrolitern 10 Millimolar K drei EDTA und stellen Sie die Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie dann eine mit Heparin beschichtete Pipettenspitze, um 1,5 Milliliter Blut in jede mit Heparinoberfläche beschichtete Endothelzellkammer zu übertragen, wobei darauf zu achten ist, dass das Blut langsam und ohne Blasenbildung fließt, um eine Aktivierung zu vermeiden. Entfernen Sie anschließend die Kunststoffwände von den Objektträgern der Endothelzellkultur gemäß den Anweisungen des Herstellers und waschen Sie die Endothelzellen vorsichtig.

Bei PBS entfernen wir so viel wie möglich von der Wäsche aus den Zellen, ohne die Kulturen austrocknen zu lassen, und platzieren die Objektträger auf den Blutkammern, wobei die Zellen dem Blut zugewandt sind. Dann mit Kunststoffrutschen für zusätzlichen Halt. Um einen Bruch der Zellkultur-Objektträger zu vermeiden, platzieren Sie eine Klammer um jede Blut-Endothelzellkammer, um die Objektträger zu sichern.

Drehen Sie nun die Kammern auf einem rotierenden Rad in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad bei 0,5 g für 30 Minuten. Nach der Rotation die Endothelzellkammern des Blutes zerlegen, die Zellkultur-Objektträger in PBS waschen und die Zellen 10 Minuten lang in eiskaltem 1%Paraldehyd fixieren. Zur Bestimmung der aktivierten Blutproteinkonzentration wird schließlich ein Milliliter Blut aus jeder Kammer in Mikrozentrifugenröhrchen gemischt, die 30 Mikroliter 0,34 molare K drei EDTA enthalten, und die Röhrchen für maximal eine Stunde auf Eis legen.

Nach dem Schleudern der Zellen wird das Plasma bis zur weiteren Analyse in neuen Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 70 Grad Celsius gelagert. Eine Aktivierung der Gerinnungsfaktoren tritt eher bei stagnierendem Blut auf, da die Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung zwischen den aktivierten Faktoren erhöht ist. Tatsächlich ist das Blutvolumen ohne Bewegung durch Luftblasen zweieinhalb Mal größer.

Wenn 1,75 Milliliter Blut in die Kammer gegeben werden, verglichen mit 1,5 Millilitern Blut, deuten die gemessenen Thrombin-Antithrombin-Werte auf eine erhöhte Thrombin-Antithrombin-Bildung mit einem erhöhten Blutvolumen hin. Interessanterweise werden bei der Inkubation von ve mit einem der beiden Vollblutvolumen keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Endothelzellen die Aktivierung der Gerinnung modulieren könnten, um die Wirkung von TNF alpha auf die Leukozytenrekrutierung zu untersuchen. In diesem Experiment wurden qve vier Stunden vor dem Blutkontakt mit 20 Nanogramm pro Milliliter TT NF alpha behandelt, woraufhin die Anzahl der CD 16-positiven Zellen quantifiziert wurde.

Die Rekrutierung der CD 16-positiven Zellen stieg mit der TNF-alpha-Behandlung signifikant an, von 100 auf 256 CD 16-positive Zellen pro Quadratmillimeter und 1,5 Liter Blut und von 172 auf 378 und 1,75 Milliliter Blut. Die Bildung der Thrombin-Antithrombin-Komplexe wurde dann in den entsprechenden Plasmaproben aus dem Blut gemessen, das entweder mit TNF-alpha-behandelten oder unbehandelten Zellen inkubiert worden war. Wie erwartet induzierten die TNF-alpha-stimulierten Zellen nach ihrer Entwicklung eine annähernde Verdopplung der Thrombin-Antithrombin-Komplexe im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen.

Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg ebnen, um die Erkundung, Ergänzung und Gerinnung in einem In-vitro-Modell mit menschlichen Primärzellen und menschlichem Vollblut zu erforschen, zu ergänzen und zu koagulieren.