Name: Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie PAD4-Aktivität mit einem fluoreszenzbasierten Assay quantitativ messen. Diese Methode nutzt ein Pro-Fluoreszenz-Substratanalogon und ermöglicht hochdurchsatzfähige Screening-Anwendungen in der Biochemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch das Start-up-Paket der Lehigh University unterstützt. Wir danken Dr. Walter Fast für die Bereitstellung des GST-PAD4-Plasmids für die Proteinexpression.

1. PAD4 Transformation, Expression und Reinigung <ol><li> Für PAD4 Transformation, verwandeln den pGEX-Plasmid, das PAD4 GST-Fusions in chemisch kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) Zellen zur Proteinexpression unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Bereiten chemisch kompetente (Calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3) Zellen) nach Standardprotokollen. <ol><li> Tau 50 &amp; mgr; l eines zuvor hergestellten chemisch kompetente BL21 (DE3) Zellen auf Eis und mit 1 &amp; mgr; l der Plasmid pGEX enthält PAD4 Gens in einer 5 ml-Kulturröhrchen gemischt. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min unter leichtem Schütteln alle 2 min. </li><li> Hitzeschock der Zellen, indem die Mischung in einem 42 ° C Wasserbad für 40 sec. Unmittelbar danach ist die Zell-Plasmid-Gemisch wieder auf Eis für 2 min, damit die Zellen sich zu erholen. 1 ml steriles LB-Medium zu der Mischung und auf Eis für 1 min. </li><li> Inkubiere die Zellen einem Hitzeschock bei 37 ° C, unter Schütteln bei 250 rpm für 1hr. Je 75 ul der transformierten Zellen auf einer Ampicillin-resistenten Agarplatte und bei 37 ° C für 15 Stunden. Store Platte bei 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Wählen 1 Kolonie von BL21 (DE3) Zellen aus dem Ampicillin-Agar-Platte und in 5 ml LB aus 1x Ampicillin. Platz in Inkubator und schütteln O / N bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die 5 ml LB (Starter) in 1 l sterilem LB aus 1x Ampicillintrihydrat (MW 403,45 g / mol). Ort Wachstum in einem 37 ° C Schüttelinkubator. Überwachen Sie die OD 600 des Wachstums. Wenn das Wachstum einer OD 600 von 0,3 erreicht, bewegen Wachstum in 16 ° C Schüttelinkubator. </li><li> Bei Erreichen einer OD 600 von 0,6 induziert, die Zellen mit 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Sodass die Zellen 15 h bei 16 ° C geschüttelt. </li><li> Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 min bei 0 ° C. Überstand abgießen und speichern Pellet bei -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Reinigung <ol><li> Re-suspendieren des Pellets, welches das exprimierte PAD4 in BL21 (DE3) Zellen in einem Puffer von 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Folgende Beschallung, zentrifugieren Zelllysat bei 20000 × g für 20 min bei 0 ° C. Abgießen und den Überstand. Batch der Überstand mit Glutathion (GSH) Agaroseperlen für 30 min bei RT. </li><li> Ablassen Stand von GST Perlen / Kolonne über die Schwerkraft. Mit 4 x 25 ml 1x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH = 8,0) bei RT Waschen Perlen. </li><li> Eluieren PAD4 mit 2 x 10 ml Elutionspuffer, 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM Glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Konzentrieren PAD4 mit 100k MW cut-off Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 4.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Aliquot Protein in 200 ul Volumen in 1,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereiten Lizenzlösungen für Puffer <ol><li> Abwiegen Natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung, pH = 8,0. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) und bereiten eine 500 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) und bereiten eine 200 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) und bereiten eine 1 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Vorbereiteneine 0,5% ige Lösung von Triton X-100. </li><li> Abwiegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, MW 292,24 g / mol) und bereiten eine 100 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin Hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) und bereiten eine 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay bei 37 ° C <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, und 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 96-Well-Platte und Benennung einer Anzahl von Vertiefungen für die Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Pipette 160 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 160 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Auf die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen Pipette 10 ul Lösung D. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 Assay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 50 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 50 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Je 25 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 25 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 25 ul der Lösung C in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Um die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen, pipettE 10 ul Lösung D. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Zeitverlauf Assays bei 37 ° C und RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Wobei 2 Platten mit 96 Vertiefungen und einer Pipette 160 ul der Lösung B in # Menge von Vertiefungen (# Vertiefungen wird, wie viele Zeitpunkten abhängen). </li><li> Inkubieren einer 96-Well-Platte bei 37 ° C. Inkubieren Sie die anderen 96-Well-Platte bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in alle Vertiefungen in beiden 96-Well-Platten und sofort Pipette 10 ul Lösung C in die t = 0 min Brunnen. Fügen Sie weitere 10 ul Lösung C zu bestimmten Zeitpunkten, bis alle Vertiefungen wurden abgeschreckt. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Inhibitionsassay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 83 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 83 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Abwiegen Cl-Amidin (MW 424,8 g / mol) und bereiten eine 100 uM Stammlösung. Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thist wird Lösung D. sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung E. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4), Testbohrungen (+ PAD4) und Hemmung Brunnen (PAD4 + Cl-Amidin). </li><li> Je 25 ul der Lösung C in die Testbohrungen und Pipette 25 ul Lösung D in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 10 ul der Lösung B in Hemmung Vertiefungen pipettieren und für 20 min bei RTE. </li><li> Pipette 15 ul Lösung A in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul Lösung E in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 7. Rohzelllysat Assaybei RT <ol><li> Nach Ernten der Zellen aus PAD4 1 L Wachstum, Zellen in 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 20.000 × g für 20 min bei 0 ° C. Konzentrieren des klaren Überstandes auf das halbe Volumen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm bei 4 ° C unter Verwendung von 100K MW cut-off-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 250 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 250 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2 und 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Besorgen Sie sich einen schwarzen 384-Well-Platte und Designaß Vertiefungen für Kontrollen (kein Zelllysat) und Aufschlussbohrungen (+ Zelllysat). </li><li> Je 100 ul der Lösung B in alle Vertiefungen und Pipetten 60 ul Zelllysat in Testbohrungen. Inkubation für 20 min bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul der Lösung C in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Besorgen Sie sich eine Fluoreszenz Lesen auf multimodale Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol>

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein fluoreszenzbasierter Assay entwickelt, der die Aktivität von PAD4 überwacht. Der Assay hat sich unter einer Reihe von Hochdurchsatzbedingungen als unglaublich robust erwiesen und ist auch mit Ganzzelllysaten37 kompatibel.
Die Affinität zwischen den Histonproteinen und den sie umgebenden DNA-Strängen löst sich durch die Neutralisation der positiven Ladung an der Arginin-Seitenkette bei der Citrullinierung. Es wurde angenommen, dass die Neutralis...

Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine ​​sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen 1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen 4 unterzogen. Histon-Proteine ​​sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) 5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung 8 beobachtet werden. Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. 9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine ​​und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz 11 lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk 14 ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen 15,16. Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose 17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis 18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs 19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein 22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel 17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest 26 zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen 27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken. Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika 28 erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat 27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige 31 zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay 32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin 33 und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt 34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen 32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><<td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicillin-Trihydrat (cremefarbenes Pulver), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019<</td><td>a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>Alle Puffersalze&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Kann bei Fisher Scieintifc kaufen; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathion (GSH) agarose&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &deg; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>Chloramidin&nbsp;</td><td>Kaiman-Chemie</td><td>10599</td><td>Bei -20 &° lagern; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell Platten (96 und 384)</td><td></td><td></td><td>Bei Corning kaufen; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control Mikroplatten-Reader-Software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-basierte Überwachung von pad4 aktivität über eine pro-fluoreszenz substratanalogon

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Posttranslationale Modifikationen können zu veränderten Proteinfunktionszuständen führen, indem sie die kovalenten Variationen an den Seitenketten vieler Proteinsubstrate erhöhen. Die Histonschwänze stellen eine der am stärksten modifizierten Strecken innerhalb aller menschlichen Proteine dar. Es wurde gezeigt, dass Peptidyl-Arginin-Deiminase 4 (PAD4) Argininreste in den nicht genetisch kodierten Citrullinrest umwandelt. Nur wenige der bisher beschriebenen Assays waren operativ einfach und mit zufriedenstellender Sensitivität. Daher hat der Mangel an adäquaten Assays wahrscheinlich zum Fehlen wirksamer nicht-kovalenter PAD4-Inhibitoren beigetragen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger fluoreszenzbasierter Assay beschrieben, der die Überwachung der PAD4-Aktivität ermöglicht. Ein pro-fluoreszierendes Substratanalogon wurde entwickelt, um die enzymatische Aktivität von PAD4 mit der Fluoreszenzfreisetzung nach Zugabe der Protease Trypsin zu verknüpfen. Es konnte gezeigt werden, dass der Assay mit Hochdurchsatz-Screening-Bedingungen kompatibel ist und ein starkes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist. Darüber hinaus kann der Assay auch mit rohen Zelllysaten durchgeführt werden, die überexprimiertes PAD4 enthalten.

Ursprünglich wurde gezeigt, dass ZRcoum kann auf die Aktivität des PAD4 in einer 96-Well-Plattenformat melden. Vertiefungen wurden mit dem Substrat ZRcoum und in der Gegenwart / Abwesenheit von PAD4 inkubiert. 475/15 nm-Filter (2A) - Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei 37 ° C wurde die Fluoreszenz mit einem 340/40 gemessen. Wie erwartet, werden die Fluoreszenzniveaus niedrig blieb als Fluorophor innerhalb ZRcoum (oder der citrullinated ZRc...

PAD4 ist ein Enzym, das für die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in Peptidyl-Citrullin verantwortlich ist. Eine Dysregulation von PAD4 wurde mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Es wird ein einfacher und hochdurchsatzkompatibler fluoreszenzbasierter PAD4-Assay beschrieben.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, quantitative Informationen über das Aktivitätsniveau von pad vier in einem leicht zu reproduzierenden Assay mittels Fluoreszenz zu erhalten. Dies wird durch Inkubation von Pad vier mit dem Designsubstrat Analogon ZR Co. erreicht. Das Protein wird entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius inkubiert, um die Umwandlung des Argininderivats in das Citralinprodukt zu ermöglichen, was zu einer kovalenten Modifikation des Substrats führt. Als nächstes wird der Lösung Trypsin zugesetzt, um die Fluoreszenzsignaldifferenz zu erzeugen.Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von aktivem Pad vier zu einer Lösung, die das prof. Fluoreszierende Substrat enthält, zu einer kovalenten Veränderung führt, die auf seiner verminderten Empfindlichkeit gegenüber Trypsin und damit den niedrigeren Fluoreszenzsignalen noles basiert. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Techniken, wie z. B. derjenigen, die sich mit der Freisetzung des flüchtigen Ammoniak-Nebenprodukts befasst, besteht darin, dass wir die Modifikation des Substrats durch Fluoreszenz überwachen.Mary Saki und Jonathan Fiera für mein Labor werden diese Technik demonstrieren: Um mit Pad vier zu arbeiten, transformieren Sie zunächst das pgx-Plasmid, das die Pad 4G ST-Fusion enthält, in chemisch kompetente E-Coli-Zellen für die Expression von Pad 4-Proteinen aller Zellen auf Eis. Zweitens mischen Sie die dritten Zellen mit einem Mikroliter des PGX-Plasmids, das das Pad-4-Gen in einem Fünf-Milliliter-Kulturröhrchen enthält. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis und schütteln Sie sie alle zwei Minuten vorsichtig.Dann schocken sie die Zellen jeweils 40 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius. Unmittelbar danach wird das Zellplasmidgemisch für zwei Minuten wieder auf Eis gelegt, damit sich die Zellen erholen können. Fügen Sie nun einen Milliliter steriles LB hinzu und halten Sie die Zellen eine weitere Minute lang gekühlt.Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie sie nach der Inkubation bei 250 U/min schütteln, pipettieren Sie 75 Mikroliter der transformierten Zellen auf eine Ampicillin-resistente Agarplatte und inkubieren Sie die Platte 15 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Lagern Sie diese Platte bei vier Grad Celsius.Übertragen Sie eine Kolonie von Transformationszellen auf fünf Milliliter LB, die Ampicillin enthalten. Legen Sie das Röhrchen in einen Inkubator und schütteln Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag.Übertragen Sie die fünf Milliliter Starterkultur auf einen Liter STO L LB, der ein x Ampicillin Tri enthält. Überwachen Sie den OD 600 der Zellen, während sie bei 37 Grad Celsius wachsen. Wenn ihre Absorption 0,3 erreicht.Den Kolben in einen 16 Grad Celsius warmen Raum stellen und weiter schütteln. Überwachen Sie weiterhin den OD des Wachstums. Wenn die OD der Kultur 0,6 erreicht.Induzieren Sie die Zellen mit 0,3 millimolar Isopropyl THAG GTO. Lassen Sie die Zellen 15 Stunden lang bei 16 Grad Celsius zittern. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Wachstumstemperatur bei 16 Grad Celsius liegt, bevor die Induktion mit IPTG eingeleitet wird.Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 G für 20 Minuten bei null Grad Celsius oder ohne SUP-Mittel angeboten und das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius gelagert, um das Pad zu sammeln. Vier Proteine resuspendieren das transformierte Zellpellet in einem Puffer, der EOL-Phenol, Methyl-Suen-Fluorid und Dihi drei ETOL enthält. Als nächstes werden die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius beschallt, nach der Beschallung zentrifugiert, die Lysate 20 Minuten lang bei 20.000 mal G und bei null Grad Celsius zentrifugiert.Sammeln Sie das Supinat und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Glutathion-Aeros-Kügelchen. Lassen Sie das Supinat aus den GST-Kügelchen durch die Schwerkraft ab, nachdem sich der Durchfluss angesammelt hat. Waschen Sie die Kügelchen viermal mit 25 Millilitern PBS bei vier Grad Celsius.Eluieren Sie dann das Protein von Pad vier aus den Kügelchen unter Verwendung von 10 Millilitern elucianischem Pufferpuffer und das Konzentrat von Pad vier im elucianischen Puffer unter Verwendung von Zentrifugenröhrchen mit 100 K Molekulargewicht. Schließlich wird Eloqua das gereinigte Pad-4-Protein in 200-Mikroliter-Volumina für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius überführt. Bereiten Sie für dieses Verfahren 83 mikromolare Arbeitslösung der mit ZR co-markierten Lösung A vor. Bereiten Sie auch die Lösungen B, D und die Pad-Lösung mit vier Lösungen vor C.In Bereiten Sie Lösung E vor, mischen Sie unbedingt, bis sich das TRIPSIN auflöst.Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte, und bezeichnen Sie den Notizblock, vier Kontroll-Wells, die Test-Wells und die Inhibitions-Wells für Pad vier plus Chloramadin. Geben Sie dann 25 Mikroliter Lösung C in jede Testvertiefung und 25 Mikroliter D in jede Kontrollvertiefung. Die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren.Geben Sie nach 20 Minuten 10 Mikroliter Lösung B in die Hemmvertiefungen und warten Sie weitere 20 Minuten. Geben Sie als Nächstes 15 Mikroliter Lösung A in alle Vertiefungen. Warten Sie dann 45 Minuten.Geben Sie nach 45 Minuten 10 Mikroliter Lösung E in alle Vertiefungen und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie Fluoreszenzmessungen durchführen. Verwenden Sie abschließend ein multimodales Lesegerät, um die Emissionsdaten zu erfassen. Zar CO wurde mit und ohne Pad vier für 45 Minuten ohne Pad vier inkubiert, die Zugabe von tripsin frei, die Fluor- und Fluoreszenzspiegel steigen an und das Vorhandensein von Pad vier Zar wird modifiziert und Trypsin setzt das Fluor nicht frei, wodurch die Fluoreszenz verringert wird.Der Assay wurde in Well-Platten mit hoher Dichte bei Raumtemperatur getestet, um Hochdurchsatz-Screening-Verfahren bei Raumtemperatur zu ermöglichen. Die Signale waren im Vergleich zu denen, die bei 37 Grad Celsius erhalten wurden, praktisch unverändert. Bei Raumtemperatur verlief die Reaktion langsamer.Es war innerhalb von 45 Minuten abgeschlossen. Die Stabilität des PED vier im Reaktionspuffer wurde dann über einen Zeitraum von 15 Stunden als hohe Stabilität getestet, die für ein Hochdurchsatz-Screening wichtig ist. Es wurde kein enzymatischer Aktivitätsverlust festgestellt.Die Hemmung von PLA vier mit Chlor AMADINE zeigt die erwarteten Trends unter diesen Testbedingungen bei Raumtemperatur. Um die Robustheit des PAD four zku-Assays in Frage zu stellen, wurde er verwendet, um ein rohes Zelllysat von E-Coli-Zellen zu testen, die GST pad vier exprimieren. Beim Test unter den gleichen Bedingungen wie bei gereinigtem GST-Pad wurde wie erwartet eine Fluoreszenz von vier beobachtet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie aktives Pad vier exprimieren und seine Aktivität mit diesem einfachen und zuverlässigen fluoreszenzbasierten Assay unter Verwendung eines Prof-Fluoreszenzsubstrats überwachen.

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Die Aktivierung der multifunktionalen Ser/Thr-Kinase AURKA zeichnet sich durch ihre Autophosphorylierung auf Thr288 aus. Fluoreszierende Sonden, die auf FRET setzen, können zwischen inaktivem und aktiviertem Zustand unterscheiden. Hier veranschaulichen wir einige Strategien für das Sonden-Engineering, zusammen mit einem schnellen FRET-Protokoll, um die Kinase-Aktivierung während der mitose zu verfolgen.

Echtzeitüberwachung der Aktivierung der Aurora-Kinase A mit konformationellen FRET-Biosensoren in lebenden Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll veranschaulicht die Wirksamkeit des cAMP Difference Detector In Situ  bei der Messung von cAMP durch zwei Methoden. Bei einer Methode wird ein 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer mit HEK-293-Zellen verwendet. Die andere Methode zeigt einzelne HASM-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Erfahren Sie, wie Sie PAD4-Aktivität mit einem fluoreszenzbasierten Assay quantitativ messen. Diese Methode nutzt ein Pro-Fluoreszenz-Substratanalogon und ermöglicht hochdurchsatzfähige Screening-Anwendungen in der Biochemie.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Weitere Videos entdecken