Name: Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA A Receptors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Lernen Sie die Bildung hemmender GABAergener Synapsen in einem Co-Kultur-Modell mit embryonalen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA-A-Rezeptoren exprimieren. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung synaptischer Kontakte.

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Wir möchten die finanzielle Unterstützung aus dem MRC UK (G0800498) quittieren. Wir möchte auch danken Professor JM Fritschy, Universität Zürich, für die Bereitstellung der GABA A -R-Untereinheit-spezifischen γ2 Antikörper und Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, für die Bereitstellung der pcDNA 3.1 (+) Expressionsvektoren, die Antibiotika-Resistenz Gene für die Herstellung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Obwohl dieses Protokoll ist technisch schwierig durchzuführen, gibt es mehrere wichtige Schritte, die befolgt werden müssen, um die genaue und reproduzierbare Co-Kultur-Assays erreicht werden. Erstens muss kultiviert mittelgroßen Projektionsneuronen bei einer optimalen Dichte ausgesät werden. Wenn ausgesät zu dünn, neigen Neuronen sehr langsam entwickeln und Überleben stark reduziert. Auf der anderen Seite, wenn zu dicht ausgesät, neigen Neuronen zu aggregieren, die die Analyse der Kontakte mit HEK293-Zellen beeinträchtigt. Zweitens ist es empfehlenswert, transient exprimieren ein fluoreszierendes Reporter, GFP oder mCherry in HEK293-Zellen, die GABA A Rs vor platting sie in dem Co-Kultur. Dies ermöglicht die zuverlässige Erkennung von HEK293-Zellen, die durch die Ähnlichkeit in der Form und Größe zwischen diesen Zellen und seltene Hinter Gliazellen in neuronalen Kulturen beeinträchtigt werden kann. Die effiziente Transfektion mit GFP oder mCherry cDNA zu erreichen, müssen in der exponentiellen Wachstumsphase werden HEK293-Zelllinien undin der geeigneten Dichte in 6-well Platten ausgesät. Sparse Aussaat gefolgt von Transfektion verursacht Zellen schlecht wachsen, während Über Aussaat werden die Zellen aus der Aufnahme der cDNA zu verhindern. Idealerweise sollten die Zellen ausgesät werden, dass sie zwischen 70 - 90% konfluent waren am Tag der Transfektion. Drittens muss der Transfektion für jede Zelllinie optimiert werden, da einige Zelllinien sind empfindlicher als andere. Dies ist, weil eine konstitutive GABA A R-Expression in HEK293-Zellen reduziert das Überleben der Zelle und die Fähigkeit der Zellen nach Transfektion erholen. Außerdem hängt das Überleben von der Art des GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert, wobei einige Zelllinien deutlich empfindlicher als die anderen. Transfektion mit liposomalen Reagenz ist eine optimale Verfahren zur Expression von Fremdproteinen in schnell wachsenden Zelllinien, die sowohl die hohe Transfektionseffizienz und Expressionsniveau. Führt dies jedoch zu viel Reagenz Beschädigung langsam wachsende Zelllinien, beispielsmit denen wir regelmäßig eine nicht-liposomale Transfektionsreagenz. Dies funktioniert in einer ähnlichen Weise zu der liposomalen Reagenz aber die Menge an DNA für die effiziente Transfektion benötigt wird deutlich reduziert. Dies ermöglicht eine größere Zellüberlebensrate (etwa 80 bis 90% gegenüber 60% mit Liposomen Reagenz), jedoch mit geringer Transfektionseffizienz (60%). Schließlich / β2 / γ2 HEK293-exprimierenden Zellen zu neuronalen Kulturen zugesetzt muss die Anzahl der Steuer HEK293 oder α1 optimiert werden. Hinzufügen zu wenige Zellen beeinträchtigt die erfolgreiche Analyse der Kontakte zwischen HEK293-Zellen und Neuronen, weil sie sehr selten geworden. Umgekehrt Zu viele HEK293-Zellen verursacht neuronalen Zelltod innerhalb von wenigen Stunden. Embryonale mittelgroßen Projektionsneuronenkulturen sollte idealerweise mit striatalen Gewebe aus embryonalen Alter von 15 Jahren seziert hergestellt werden - 17. Allerdings kommt es oft vor, dass Embryonen sind etwas jünger oder älter als die optimale Alter. In diesem Fall ist die Anzahl der Neuronen in Kultur angeimpft wirdmüssen verändert werden. Gewebe, die jünger als E15 müssen möglicherweise bei einer etwas niedrigeren Dichte ausgesät werden, während Gewebe, das älter als E17 müssen möglicherweise mit einer höheren Dichte ausgesät werden, um ein optimales Zellüberleben zu ermöglichen. Weiterhin müssen Cytosinarabinosid (Ara-C), um älteren Kulturen zugesetzt werden, um das Wachstum von Gliazellen, die häufiger bei älteren Gewebe verhindern. Beim Erstellen Co-Kulturen, ist es wichtig, die optimierte Anzahl von transfizierten HEK293 oder α1 / β2 / γ2 HEK293 Zellen exprimiert Platte, wie oben erwähnt. Jedoch kann es notwendig sein, das für jede einzelne Zelllinie aufgrund von Unterschieden in ihren Lebensrate zu bestimmen. Typischerweise 30.000 Zellen in einem Volumen von 50 ul zu jedem Well einer 24-Well-Platte, das bereits 500 ul neuronalen Kulturmedium gegeben werden, da dies sicherstellt, dass das konditionierte Medium neuronalen nicht zu stark verdünnt, und dass die Bedingungen innerhalb jeder Vertiefung weitgehend konstant bleiben, zB </em&gt; Die Konzentration der Wachstumsfaktoren. Hinzufügen Volumes größer als 50 &amp; mgr; l in jede Vertiefung würde generell töten die Neuronen. Einer der Hauptnachteile der Co-Kultur-Technik ist, daß die neuronalen Kulturen von dissoziierten Zellen als Monoschicht, was bedeutet, dass die Neuronen von ihren normalen Mikro entfernt und können ihre normale anatomische Organisation zu etablieren gewachsen erstellt. Daher fehlt ihnen die entsprechenden Verbindungen, Ein- und sekretierte Moleküle von anderen Zellen, die die Anfangsstadien der Synapsenentwicklung beeinflussen. Beispielsweise in vivo mittelgroßen Projektionsneuronen sind dicht von glutamatergen Eingaben von dem Cortex, Thalamus und anderen Hirnregionen 34 innerviert, jedoch in unserer neuronalen Kulturen glutamatergen Synapsen nicht bilden, da diese Eingänge werden bei der Präparation des striatalen Gewebe beschädigt. Wie das Fehlen von funktionellen glutamatergen Synapsen in kultivierten mittelgroßen Projektionsneuronen affECTS ihre Fähigkeit, GABAergen Synapsen untereinander und / oder HEK293-Zellen, die GABA A Rs bilden, bleibt eine offene Frage. Diese Frage könnte leicht durch Züchten zusammen mittelgroßen Projektionsneuronen mit kortikalen glutamatergen Neuronen damit sie in funktionelle Synapsen 35 vor der Zugabe von HEK293 Zellen bilden adressiert werden. Ein alternativer Ansatz wäre, eine Co-Kultur-Modell System zu entwerfen, basierend auf organotypischen Schnittkulturen, die einige der Zellarchitektur, die wichtig für die Reifung und Synapsenbildung sein kann halten. Allerdings haben organotypischen Schnittkulturen dichten und heterogenen Neuropil, das die Analyse hier geführt gefährden können. Ein weiterer wichtiger Nachteil der Verwendung von Co-Kultur-Assays ist, dass GABA A Rs ausgedrückt auf der Oberfläche der HEK293-Zellen werden nicht gruppiert, wie sie in Neuronen, obwohl dies scheint nicht Synapsenbildung gegeben eine ausreichend hohe Oberflächenexpressions 30 notwendig. Zum Beispiel wird in der r-Odent Gehirn und in Hippocampus-Kulturen, die α1 GABA A R-Untereinheit ist in den meisten GABAergen Synapsen auf allen postsynaptischen Domänen von Pyramidenzellen gefunden. Jedoch ist die α2 und zwar in einer Untergruppe von Synapsen auf der Zellkörper und Dendriten sind, aber ist sehr im Axon Anfangssegment angereichert durch Immunofluoreszenz und Elektronenmikroskopie 36 offenbart. Da die Synapsenbildung in den Co-Kulturen immer noch zuverlässig erkannt und analysiert werden 30 legt dies nahe, dass die Dichte des GABA A Rs auf der Zelloberfläche von HEK293-Zellen kann ähnlich oder sogar höher als die Dichte dieser Rezeptoren im synaptischen sein Clustern in Neuronen. Dies kann erklären, zumindest teilweise, warum synaptischen Adhäsionsproteine ​​wie neuroligin und postsynaptischen Dichte Proteine ​​wie Gephyrin, sind nicht für die Synapsenbildung in den Co-Kulturen notwendig, wenn man die entsprechend montiert GABA A Rs vorhanden sind bei ausreichender Dichte. Es ist gut dokumentiert, dass GABA A Rs sind strukturell und funktionell heterogen, dass die Rezeptor-Untereinheit-Zusammensetzung bestimmt ihre subzelluläre Lokalisierung und pharmakologischen Eigenschaften. Beispielsweise wird der Einbau von 2-Untereinheiten bekannt, die Voraussetzung für die synaptische Lokalisation des GABA A Rs, während die Untereinheit ist fast ausschließlich in Gegenwart extrasynaptischen GABA A Rs. Die Rezeptoren, die nur αβ Kombinationen einzubeziehen sind auch gedacht, um in erster Linie zu den extrasynaptischen Domains 12- 14 lokalisiert werden. Ob diese Spezifität wird in unserer co-Kultursystem aufrechterhalten kann leicht durch transiente Transfektion von cDNAs Einheit 2 oder in HEK293-Zelllinien, die stabil α und β-Untereinheiten, bevor sie auf neuronale Kulturen getestet werden. Unsere Vorversuche unter Verwendung dieses Ansatzes haben vorgeschlagen, dass die synaptische Kontakte werden einfach nur in Gegenwart der 2-Untereinheit gebildet wird, anzeigt, daß das spezifischeficity in vivo beobachtet wurde, ist wahrscheinlich in vitro erhalten werden (Daten nicht gezeigt). Weiterhin sind GABA A Rs Einbeziehung verschiedener α-Untereinheiten selektiv an synaptischen Kontakte mit bestimmten Arten von präsynaptischen Neuronen gebildet lokalisiert. Zum Beispiel im Globus pallidus, die α1-GABA A Rs werden im allgemeinen bei striatopallidalen (str-GP) und palliopallidal (GP-GP) Synapsen, die auf Dendriten und somatischen Bereiche der mittelgroßen Projektionsneuronen befinden, jeweils zu finden. Die α3-GABA A Rs werden in perisomatische Regionen mittelgroßen Projektionsneuronen und werden von lokalen GP Axonkollateralen kontaktiert, während die α2-GABA A Rs beruhen auf distalen Dendriten dieser Nervenzellen und in erster Linie durch die Eingänge aus dem Striatum 32 kontaktiert. Expression von spezifischen α-Untereinheiten in verschiedenen Arten von Synapsen und Neuronen in verschiedenen Kompartimenten wurde auch in anderen Hirngebieten wie Hipp nachgewiesenocampus 21 und Neocortex 18,20. Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, wie die spezifische inhibitorische Synapsen im Gehirn gebildet wird. Ist die Haftung von einer bestimmten Art von präsynaptischen Terminal induzieren die Einfügung spezifischer GABA A R-Subtypen in die Berührungspunkte? Werden die Rezeptoren spezifischen subzellulären Orten Handel nach ihrer Zusammensetzung Einheit, wobei die Plasmamembran Insertion ist eine Voraussetzung für die Haftung der axonalen Klemmen bestimmter Herkunft? Bis heute bleiben diese Fragen unbeantwortet. Die Verwendung von reduzierten Modellsystemen, wie die Co-Kultur-Modell-System, ermöglichen es uns, beginnen Beantwortung dieser komplexen Fragen, da das System leicht zugänglich Transfektion von DNA-Konstrukten und Anwendung von Reagenzien und, besonders wichtig, geeignet für Live Cell Imaging-Analyse ist es 30. Somit ist die Verwendung dieses Modellsystem können wir beginnen die Prüfung der Rolle der einzelnen Moleküle, darunter verschiedene Arten von GABA A Rs, weißn auf synaptische Kontakte vorhanden sein. Ein weiterer Vorteil ist, dass Synapsen in diesem Modellsystem Form schnell, innerhalb von Minuten bis Stunden, Verkürzung der Dauer der Experimente. Ähnliche Cokulturmodell Systeme wurden in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um für die neuen synaptogenic Moleküle 27,37,38 screenen. Verstehen, wie das zentrale Nervensystem entwickelt, reift und Formen Verbindungen zwischen Nervenzellen, so kunstvoll zu kontrollieren, zum Beispiel Verhalten oder Kognition, ist von grundlegender Bedeutung. Dieser entfernte Ziel wird nur durch Abgrenzung der molekularen Mechanismen, die die einzelnen Schritte der Anerkennung und von Zelle zu Zelle Kommunikation während der Entwicklung regieren erreicht werden. Durch schiere Komplexität, die molekularen Details dieser vielfältigen zellulären Interaktionen können derzeit mit Präzision nur in reduzierter Systeme untersucht werden. Allerdings ist die Fähigkeit, die Komplexität dieser Systeme durch Ausdrücken mehrere Kombinationen von Proteinen und untersucht, wie erhöhensie interagieren hat einige Vorteile im Vergleich zu beispielsweise genetische Deletion Ansätze. Denn die genaue Interpretation der Auswirkungen eines einzelnen Gens Deletion wird oft durch Veränderungen mit Kompensationsmechanismen Maskierung der Wirkung der ursprünglichen Läsionen, insbesondere bei der Entwicklung des Gehirns assoziiert beeinträchtigt. Die hier beschriebene einfache, aber informative Co-Kultur-Technik hat eine Entdeckung der strukturellen Rolle der GABA A Rs in Synapsenbildung erlaubt und eröffnete eine Möglichkeit zu untersuchen, wie GABA A Rs und andere Zelladhäsionsmoleküle und / oder synaptische Matrixproteine ​​miteinander interagieren während Synaptogenese. Synaptic Matrixproteine ​​sind von besonderem Interesse, da sie vor kurzem nachgewiesen, dass sie eine Schlüsselrolle in glutamatergen Synapse Formation 39 zu spielen. Weiterentwicklung der Co-Kultur-Modelle ist wichtig, weil sie das Potenzial haben, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die zu führen der &quot;normale &amp; voran# 8217; Entwicklung des Gehirns und damit unser Verständnis, wie diese Mechanismen werden in vielen der Entwicklung des Nervenerkrankungen, wie Epilepsie, Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen und viele andere verändert.

GABA ist einer der frühesten embryonalen Neurotransmitter im Gehirn, vor der am häufigsten vorkommende exzitatorische Neurotransmitter Glutamat 1. Während der Entwicklung depolarisiert GABA und regt unreifen Neuronen, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Zellproliferation, Migration und Bildung von neuronalen Netzwerken ohne eine Exzitotoxizität. Im erwachsenen Gehirn wird das Umkehrpotential für GABA A Rezeptorkanäle zu negativeren Potentialen aufgrund einer Abnahme der intrazellulären Konzentration von Chlor verschoben. Diese Verschiebung wird durch die Hochregulation des Kaliumchlorid-Co-Transporter (KCC2), das Chlorid aus der Zelle transportiert verursacht wird, und, parallel dazu, die Herunterregulierung der Natrium-Kalium-Chlorid-Transporter (NKCC1), die aufweist der gegenteilige Effekt 2. Im Gehirn GABA bindet primär entweder GABA A oder GABA B Rezeptoren, die schnell oder langsam synaptische Hemmung vermitteln jeweiligely. GABA A Rs sind eine Klasse von Rezeptoren auch als heteropentameren ionotrope oder Liganden-gesteuerte Cys-Loop-Ionenkanäle bekannt. Zwei Moleküle GABA zur Aktivierung des Rezeptors, die durchlässig für Chlorid-Ionen und in geringerem Ausmaß, Bicarbonat-Ionen erforderlich. Der Anstieg der Chloridleitfähigkeit verringert die Wirksamkeit der depolarisierenden, exzitatorischen Ereignisse in der Aktivierung der postsynaptischen Neuron 3. Strukturvielfalt der GABA A Rs ist seit langem als ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung ihrer breiten Palette von funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften erkannt worden. Nativen GABA A Rs sind hetero-Pentamere von Untereinheiten mit mehreren Isoformen klassifiziert zusammensetzt: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, θ π und 3, mit einem gemeinsamen Transmembrantopologie mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne, vier Transmembrandomänen (TMS) und eine intrazelluläre Hauptdomäne zwischen TMs 3 und 4 4. Dasβ3 und γ2 Untereinheiten sind für die synaptische Inhibition und Organismus überleben, weil Mäusen mit genetischen Löschung dieser Untereinheiten sterben nach der Geburt 5,6. Im Gegensatz dazu sind einzelnen Isoformen von α-Untereinheit für die Funktion des spezifischen synaptischen Verbindungen im Gehirn mit unterschiedlichen Verhaltensweisen wie Angst, Sedierung, Erregung und andere verbunden sind, sind nicht einzeln für das Leben wesentlich 7-9 aber. GABA A Rs sind die Hauptwirkorte für eine Vielzahl von Medikamenten mit starken Beruhigungsmittel, hypnotisch, angstlösende und krampflösende Wirkungen, wie Benzodiazepine, Barbiturate, Neuro und Anästhetika 7,10,11. Synaptic GABA A Rs enthalten typischerweise eine γ2-Untereinheit, zwei β-Untereinheiten (am häufigsten β2 oder β3) und zwei α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 12,13. Die vorherrschende Klasse von extra synaptischen Rezeptoren die δ-Untereinheit in Kombination enthältmit zwei α-Untereinheiten (α4 oder α6) und zwei β-Untereinheiten (β2 oder β3) 14. Subzelluläre Lokalisierung von GABA A Rs Axone, Dendriten oder Soma und Insertion in die Plasmamembran sind abhängig von der Gegenwart von β-Untereinheiten 15,16. Jedoch selektiven Einbau von verschiedenen GABA A R Subtypen in verschiedene Arten von Synapsen korreliert gut mit der Anwesenheit von spezifischen α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 7,17,18. Wichtig ist, dass das Löschen von α1 oder α2-Untereinheit in Mäusen bewirkt ultrastrukturelle Veränderungen bei hemmende Synapsen 19. Dies deutet darauf hin, dass GABA A Rs selbst können bei der Regulierung der Synapsenbildung eine direkte Rolle spielen. Beweise zeigen, dass GABAerge Synapsen Entwicklung ist eine präzise koordinierten Abfolge der Ereignisse, bei denen sowohl die neuronalen Ziele durch verschiedene Arten von Inhibitor Axonen und den Rezeptoren, die auf Cluster kontaktiertjede Klasse von hemmenden Synapsen sind selektive und funktional abgestimmt 17,20-22. Dieses Grundprinzip der Spezifität bei GABAergen Synapsen stellt sich die Frage, wie die prä- und postsynaptischen Partnern während der Einleitung der synaptischen Kontakte gegenseitig erkennen. In-vitro-Co-Kultur-Assays wurden erfolgreich eingesetzt, um einige der Mechanismen der Synapsenbildung zu untersuchen und die Rolle der einzelnen synaptischen Spalt überspannende Proteine ​​in diesem Verfahren getestet werden. Eines der gemeinsamen trans synaptischen interacting protein-Kombinationen, die bidirektional mit Synapsenbildung und Reifung vermitteln funktionieren, sind die Neurexine (Nrxns) und Neuroligine (NLS). Nrxns sind präsynaptischen Proteine, die das alternative Spleißen innerhalb ihrer Laminin-neurexin-Sexualhormon-bindendes Protein-Domänen aufweisen, was zu vielen unterschiedlichen Isoformen 23. Während die Nrxns auch mit anderen Proteinen interagieren, sind NLs dachte ihrer ubiquitären postsynaptischen partner 24. Zusammen bilden diese Proteine ​​tragen zur Aufnahme der präsynaptischen und postsynaptischen Membranen in enger und starrer Apposition 25. Die beiden am häufigsten vorkommenden Isoformen sind NL-1 und NL-2, die an erregenden und hemmenden Synapsen, jeweils 26 vorhanden sind. Eines der frühesten Cokulturmodell Systeme designt trans synaptische Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, verwendeten verschiedene Arten von nicht-neuronalen Zellen, am häufigsten unsterbliche Zelllinien, wie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293-Zellen, zu über-express NL- 2. Wenn diese Zellen mit pontis Neuronen kultiviert wurde eine Akkumulation von präsynaptischen Proteinen in der Nähe der Oberfläche der HEK-Zellen beobachtet, was die Bildung von Synapsen artigen Kontakten. Zugabe von löslichem β-neurexin diesen Co-Kulturen hemmte die Bildung von Kontakten, was darauf hindeutet, dass trans-synaptischen Interaktionen zwischen Nrxns und NLs für synaptische Kontaktbildung 27 notwendig sind. Außerdem transiente Expressionvon β-neurexin in COS (C V-1 (Simian) in O Rigin und Tragen des S V40 Erbgut) Zellen co-kultiviert mit dissoziierten hippocampalen glutamatergen und GABAergen Neuronen induziert die Expression des postsynaptischen Protein gephryin und der GABA A R-Untereinheiten γ2 und α2 an Kontaktpunkten zwischen diesen beiden Zelltypen 28. Ein weiteres Beispiel einer Co-Kultur-Modell zur Synapsenbildung Studie beteiligten HEK293-Zellen, die transient mit GABA A R transfizierten Untereinheiten α2 / β3 / γ2 und NL-2 und eine Mischpopulation von Hypothalamus Neuronen 29. Diese Studie ergab, dass die Expression von NL-2 ist eine absolute Voraussetzung für die Bildung von inhibitorischen Synapsen. Doch in der letzten Co-Kultur-Studie stabil transfizierten α1 / β2 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen wurden als ausreichend funktionelle Synapsen zu veranlassen, wenn co-kultiviert mit GABAergen medium Projektionsneuronen, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche trans-synaptische oder postsynaptischen Adhäsionsproteine. Allerdings wurde ein prominenter Anstieg Synapsenbildung und Festigkeit beobachtet, wenn NL-2 wurde mit GABA A Rs 30 koexprimiert. Dies deutet darauf hin, dass diese Co-Kultur-Modell-System hat Vorteile gegenüber zuvor beschriebenen Modellsysteme, die meisten offenbar eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der synaptischen Kontakterkennung. Zwei wichtige Faktoren für die Verbesserung der Gesamterfassungs der synaptischen Kontakte sind: i) Die Verwendung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien mit hoher und konstanter Ausdruck GABA A R-Untereinheiten an der Oberfläche der einzelnen Zellen. Diese Konsistenz erleichtert quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Co-Kulturbedingungen. ii) Die Verwendung einer reinen Population von GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums embryonalen 31 kultiviert entfernt Komplikationen und Unklarheiten bei der Verwendung von gemischten neuronalen Populationen und resultierende allows, beispielsweise die Auswahl der am besten geeigneten postsynaptischen GABA A R-Typen, die bei der Synapsenbildung miteinander verglichen werden können. Bildung von Synapsen wird gedacht, um viele trans-synaptischen Signale innerhalb prä- und postsynaptischen Zelladhäsion Komplexe beinhalten. Aufgrund der bidirektionalen Natur des synaptischen Signalisierung und die bloße Anzahl von Zelladhäsionsmolekülen, ist es schwierig, die Schlüsselkomponenten in der Synapsenbildung beteiligt sind. Somit Transfektion einer einzigen Zelladhäsionsprotein in eine nicht-neuronalen Zelle (in diesem Fall sind die beiden am häufigsten postsynaptischen Ziele für GABAerge mittelgroßen Projektionsneuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) erheblich reduziert die Komplexität der trans-synaptische Signale an postsynaptischen Oberfläche und ermöglicht eine genaue quantitative Analyse der Wirksamkeit dieses Proteins bei der Förderung der Synapsenbildung.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Warm im Wasserbad bei 37 &°; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Gefahr: reizend</td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>Life Technologies</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Neuralbasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Warm im Wasserbad bei 37 &°; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Säugetier-Expressionsvektor (Geneticin-Auswahl)</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Säugetier-Expressionsvektor (Zeocin-Auswahl)</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Säugetier-Expressionsvektor (Hygromycin-Auswahl)</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>Stabil HEK&alpha; 1&Beta; 2&Gamma; 2 Linien</td><td>Sanofi-Synthelabo, Paris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418 Disulfatsalz (Geneticin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>Gefahr: reizend</td></tr><tr><td>Phleomycin D1 (Zeocin)</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>Gefahr: giftig, reizend und ätzend</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Warm im Wasserbad bei 37 ° C C vor Gebrauch. Gefahr: reizend.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Nylon-Zellsieb</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin &beta;-D-Arabinofuranosid (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>Gefahr: Reizendes</td></tr><tr><td>Chelatbildner (Versen)</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Liposomales Transfektionsreagenz (Lipofectamine LTX) mit liposomalem Transfektionspufferreagenz (PLUS-Reagenz).</td><td>Life Technologies</td><td>15338-100</td><td>Alternative Transfektionsmethode: Effecten-Reagenz</td></tr><tr><td>Nicht-liposomales Transfektionsreagenz (Effecten-Reagenz)</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Anti-Synaptotagmin-Antikörper, konjugiert an Cy5</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Meerschweinchen Anti-& Gamma; 2 GABAA Rezeptor-Antikörper</td><td>Prof. Jean Marc Fritschy</td><td>N/A</td><td>(Institut Zürich, Schweiz) Fritschy, JM und Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Glutamat Decarboxylase (GAD)65 Antikörper</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Synapsin Antikörper</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-&Beta; 2/3 Antikörper (BD17)</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen anti-& alpha; 1 GABAARezeptor-Antikörper</td><td>Professor Anne Stephenson</td><td>N/A</td><td>(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Meerschweinchen, konjugiert mit Cy5-Antikörper</td><td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488-Antikörper</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 405 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 555 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckreagenz (Prolong Gold)</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>Bei Raumtemperatur verwenden</td></tr></tbody></table>

hemmende synapse formation in einer co-kultur modell mit gabaergen mittelgroßen projektionsneuronen und hek293-zellen, die gaba a receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitorische Neuronen regulieren im zentralen Nervensystem die Dynamik und die räumlich-zeitliche Koordination neuronaler Netzwerke. GABA (γ-Aminobuttersäure) ist der vorherrschende hemmende Neurotransmitter im Gehirn. Es wird von den präsynaptischen Enden hemmender Neuronen in hochspezialisierten interzellulären Verbindungen, den Synapsen, freigesetzt, wo es an GABA-A-Rezeptoren (GABAARs) bindet, die an der Plasmamembran der synapsenempfangenden, postsynaptischen Neuronen vorhanden sind. Die Aktivierung dieser GABA-gesteuerten Ionenkanäle führt zum Einstrom von Chlorid, was zu postsynaptischen Potentialänderungen führt, die die Wahrscheinlichkeit verringern, dass diese Neuronen Aktionspotentiale erzeugen. 
Während der Entwicklung haben verschiedene Arten von inhibitorischen Neuronen mit unterschiedlichen morphologischen, elektrophysiologischen und neurochemischen Eigenschaften die Fähigkeit, ihre Zielneuronen zu erkennen und Synapsen zu bilden, die spezifische GABAARS Subtypen enthalten. Dieses Prinzip der selektiven Innervation neuronaler Ziele wirft die Frage auf, wie sich die entsprechenden synaptischen Partner gegenseitig identifizieren. 
Um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufzuklären, wurde ein neuartiges in vitro Co-Kultur-Modellsystem etabliert, in dem mittelstachelige GABAerge Neuronen, eine hochhomogene Population von Neuronen, die aus dem embryonalen Striatum isoliert wurden, mit stabil transfizierten HEK293-Zelllinien kultiviert wurden, die unterschiedliches GABAA exprimierenR-Subtypen. Synapsen bilden sich in diesem System schnell, effizient und selektiv und sind für die Quantifizierung leicht zugänglich. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich verschiedene GABAAR-Subtypen in ihrer Fähigkeit unterscheiden, die Synapsenbildung zu fördern, was darauf hindeutet, dass dieses reduzierte in vitro Modellsystem verwendet werden kann, um zumindest teilweise die in vivo Bedingungen zu reproduzieren, die für die Erkennung der geeigneten synaptischen Partner und die Bildung spezifischer Synapsen erforderlich sind. Hier werden zunächst die Protokolle für die Kultivierung der mittleren stacheligen Neuronen und die Generierung von HEK293-Zelllinien, die GABAARS exprimieren, beschrieben, gefolgt von detaillierten Anweisungen, wie diese beiden Zelltypen in Co-Kultur kombiniert und die Bildung synaptischer Kontakte analysiert werden können.

Das Protokoll für diese Neuron-HEK293 Zell Cokulturmodell System wurde fein abgestimmt, um eine optimale Zellüberleben zu ermöglichen. In diesem System Synapsenbildung förmigen Kontakte und deren Analyse beruht auf stabile und konsistente Expression aller drei GABA A R-Untereinheiten, die in einen funktionellen Rezeptor zu montieren. Es ist daher wichtig, immunzytochemische Analyse von Testeinheit für die Expression an der Oberfläche der HEK293-Zelle, bevor sie auf neuronale Kulturen verwenden. In diesen Experimenten wurde die Zelloberflächenexpression von α1, β2 und γ2-Untereinheiten (1A), oder α1, β3 und γ2-Untereinheiten (1B), unter Verwendung von Untereinheit-spezifischen Antikörpern, die an die extrazelluläre Epitope dieser Untereinheiten zu binden, nachgewiesen. Ein hoher Grad der Co-Lokalisierung zwischen den Untereinheiten im HEK293 Oberfläche nachgewiesen. Nach der Bestätigung der Oberflächenexpression und Co-Lokalisierung von GABA AR-Untereinheiten in HEK293-Zellen, Co-Kulturen wurden mit HEK293-Zellen, die α1 / β2 / γ2 GABA A R-Untereinheiten und mittelgroßen Projektionsneuronen für 14 Tage (14 Tage in vitro (DIV)) kultiviert vorbereitet. Zellen in Co-Kultur wurden für 24 h inkubiert, fixiert und mittels Immunzytochemie und konfokale Mikroskopie analysiert. Analyse zeigte, daß Kontakte GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen gebildet nur sporadische Kontakte mit den Steuer HEK293-Zellen (2A, 2B). Die Zahl der Kontakte bei 4 h nachgewiesen betrug 7,3 ± 0,9 pro HEK293 Zell, und diese Zahl wurde auf 5,5 ± 0,5 Anschlüsse (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 Stunden nach Zugabe von HEK293-Zellen zu den kultivierten Neuronen reduziert. Im Gegensatz dazu gebildet GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen zahlreiche Synapsen-ähnliche Kontakte mit HEK293-Zellen, die GABA A Rs. Die Anzahl der Kontakte in 4 h nach der Zugabe von HEK293-Zellen erhalten wurde, betrug 28,3 ± 4,7 HEK293-Zelle, und diese Zahl wurde weitere Steigerungd auf 52,1 ± 6,3 (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 h in Co-Kultur (2A, 2B). Um festzustellen, ob diese Synapse artigen Kontakte waren "aktiv", dh unterstützt vesikulären Transmitterfreisetzung wurde ein Vesikel-luminale Domäne-spezifischen Anti-Synaptotagmin Cy5-konjugierten Antikörpers an die Co-Kulturmedium nach 23 Stunden Inkubation zugegeben. Dieser Antikörper wird nur in präsynaptischen Nervenenden eingearbeitet, wenn eine Pore bildet sich zwischen den synaptischen Vesikel Lumen und der extrazellulären Flüssigkeit in dem synaptischen Spalt in die Neurotransmitter-Freisetzung. Nach der Freigabe, schließt sich das Poren, so dass die Synaptotagmin Cy5-konjugierten fluoreszierenden Antikörper gegen Synaptotagmin angebracht innerhalb der Vesikel. Auf diese Weise werden nur die Vesikel aktiv an Neurotransmitterfreisetzung in Eingriff mit dem Antikörper markiert. In diesen Experimenten wenige oder gar keine Kontakte zwischen dem Steuer HEK293-Zellen und die mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals waren "aktiv &amp; #8217; wie durch das Fehlen der Co-Lokalisierung von präsynaptischen GAD65 / synaptotagmin Fluoreszenz und Fluoreszenz mCherry in HEK293-Zellen (3A) dargestellt. Im Gegensatz dazu wurden viele "aktive" Kontakte zwischen den mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals und α1 / β2 / γ2-exprimierenden HEK293-Zellen, wie durch einen hohen Grad an Co-Lokalisation zwischen GAD65 / Synaptotagmin und mCherry ergab, ausgedrückt speziell in HEK293-Zellen (gebildet 3B). Um zu testen, ob ein anderer Subtyp des GABAA-R kann auch Synapse artige Ausbildung in vitro zu fördern, haben wir co-kultiviert α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293 Zellen mit mittelgroßen Projektionsneuronen. Auch Steuer HEK293-Zellen nur selten empfangen Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden erreicht 10,8 ± 0,48 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A links, 4B). Jedoch HEK293-Zellen,α1 / β3 / γ2 GABA A Rs Form deutlich mehr Synapsen-ähnliche Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden von mittelgroßen Projektionsneuronen erreicht 25,3 ± 0,27 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A rechts, 4B). Dies zeigt, dass α1 / β3 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert sind ebenfalls in der Lage, synaptische Kontaktbildung zu fördern, wenn auch ihre Potenz niedriger als die Potenz α1 / β2 / γ2 enthaltenden GABA A Rs ist. Diese Experimente zeigen, dass die Co-Kultur-Modellsystem in unserem Labor entwickelt ermöglicht quantitative Analyse der synaptischen Kontaktbildung in vitro sowie die Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Subtypen von GABA A Rs in diesem Prozess. Diese Experimente zeigen weiter, dass die GABA A Rs, zusätzlich zu der kritischen Funktionskomponenten GABAergen Synapsen, kann eine wichtige Rolle spielenbei der Erkennung und der Bildung von synaptischen Kontakten zwischen inhibitorischen Neuronen und den entsprechenden neuronalen Zielzellen, die unabhängig von anderen Synapsen Adhäsionsproteine. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600"> Abbildung 1 Immuncytochemische Analyse der Expression von GABA A R α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 in stabiler HEK293-Zelllinien. Antikörper, die die extrazellulären Domänen von GABA A R-Untereinheiten wurden auf Label-Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgedrückt wird. ( A) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5) auf hohem Niveau. (B) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5)Untereinheiten auf einem hohen Niveau. Maßstab:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600"> Abbildung 2 GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β2 / γ2- exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Die Fluoreszenzmarkierung der präsynaptischen Enden mit Anti-GAD65-Antikörper (grün) und HEK293-Zellen mit mCherry (rot, links) oder die GABA A R γ2-Untereinheit (in blau, rechts), ergab Punkte Kolokalisation zwischen diesen Markierungen, die Synapsenbildung förmigen Kontakte nach 4 bzw. 24 h in Co-Kultur. Maßstab:. 10 um (B) Quantitative Analyse der Synapsenartigen Co ntacts. HEK293-Zellen wurden identifiziert auf der Basis ihrer Form, wie von der DIC-Bildgebung und / oder mCherry Expression, und die Anzahl der Kontakte zwischen den GAD 65-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen offenbart wurde, mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt eine gezählte Z-Stapelreihe (8 - 10) pro Zelle unter Verwendung der Bildbearbeitungssoftware und ausgedrückt als die Zahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β2 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 4 und 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8 in jedem Zustand aus zwei unabhängigen Experimenten). Diese Zahl wurde von Fuchs et al modifiziert. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Abbildung 3. GABA A Rs fördern Bildung aktiver synaptischer Kontakte. Immunmarkierung von Synapse artigen Kontakte nach 24 Stunden in Co-Kultur zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals positiv für GAD65 gebildet (Alexa Fluor 405 cyan) und (A) Steuer HEK293-Zellen oder (B) HEK293-α1 / β2 / γ2-Zellen, die transient mit beiden mCherry Konstrukt (rot). Aktive Kontakte werden durch Co-Lokalisation zwischen der Vesikel Lumendomänenspezifische Anti Synaptotagmin Antikörper (Cy5) und GAD65-spezifischen Antikörpers sowohl in präsynaptischen Enden identifiziert und mCherry in HEK293-Zellen exprimiert. Maßstab:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ild 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Abbildung 4. GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β3 / γ2- Einheit exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Fluoreszenzmarkierung von präsynaptischen Enden mit Anti-Synapsin I-Antikörper (in grün) und Steuer HEK293-Zellen (links), oder α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293-Zellen, sowohl transient mit mCherry transfiziert (in rot), offenbarte Punkte Co-Lokalisation zwischen diesen Markierungen, die die Bildung von Synapsen förmigen Kontakte nach 24 h in Co-Kultur. Maßstab: 10 &amp; mgr; m (B). Die quantitative Analyse der Synapsenartigen Kontakten. HEK293-Zellen wurden durch mCherry Expression identifiziert, und die Anzahl der Kontakte zwischen Synapsin I-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen wurde mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt einer Z-Stapelreihe gezählt (8 - 10) pro Zelle mit Imaging-Software, und als die Anzahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β3 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8-12 Zellen in jede Bedingung, aus zwei unabhängigen Experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt.

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA A Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, Co-Kulturen zwischen embryonalen, mittelstark spinnierenden Neuronen und HEC 2 9 3-Zellen, die GABA A-Rezeptoren stabil exprimieren, zu etablieren, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die GABAerge Synapsenbildung in vitro beeinflussen. Dazu wird zunächst das stri AUM von E 16 bis 17 Ratten- oder Mäuseembryonen präpariert. Im zweiten Schritt werden die stri AAL-Zellen auf Deckgläser plattiert.In einer 24-Well-Platte werden neben HEC 2 9 3 Zellen, die stabil GABA A-Rezeptoren exprimieren, mit einem M-Kirsch-Fluoreszenzindikator transfiziert. Im letzten Schritt werden die transfizierten Zellen mit den mittelstacheligen Neuronen nach 14 Tagen in vitro für 24 Stunden vor der Fixierung co-kultiviert. Letztendlich kann die Bildung der Synapsen zwischen den beiden Zelluntergruppen durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie vieler neurologischer Erkrankungen, da GABAerge Synapsen die Aktivität neuronaler Zellen koordinieren und für viele grundlegende strukturelle und funktionelle Elemente neuronaler Schaltkreise im Zentralnervensystem verantwortlich sind. Vor Beginn des Experiments werden über Nacht 13 Millimeter Polyollysin-beschichtete Deckgläser inkubiert. In einer 24-Well-Platte, einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit am nächsten Tag, aspirieren Sie das überschüssige Polyol-Lysin und waschen Sie die Deckgläser mit zwei zehnsekündigen und zwei fünfminütigen Wäschen in sterilem Wasser.Dann inkubieren Sie die Deckgläser über Nacht in Laminin unter den gleichen Bedingungen am Tag des Experiments. Legen Sie zunächst eine trächtige Maus in Rückenlage auf ein mit Ethanol desinfiziertes Sezierpad. Kneifen Sie dann die Haut mit einer Pinzette zusammen und schneiden Sie um den Bauch herum durch den Hautmuskel und das Bauchfell, um die inneren Organe und die Gebärmutter freizulegen.Als nächstes extrahieren Sie die embryonalen Embryonen vom 16. bis 17. Tag aus der Gebärmutter und legen Sie sie in eine Petrischale mit gekühltem PBS. Übertragen Sie die Embryonen in die Laminar-Flow-Haube, um die Köpfe in eine neue Petrischale mit gekühltem HBSS zu köpfen, und verwenden Sie dann eine gebogene und gerade Pinzette, um jedes der Gehirne zu präparieren. Sammle die Gehirne in einer neuen Petrischale, die gekühltes HBSS enthält.Trennen Sie dann für jedes Gehirn die beiden Gehirnhälften und entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute. Schneiden Sie dann entlang der Linie des Hippocampus und schälen Sie den Kortex zurück, um das Striatum freizulegen. Eine satte weiße Struktur am vorderen Ende der Hemisphäre präpariert die Schicht sehr vorsichtig, um Gewebe aus dem Korsett nicht einzubeziehen, und legt sie in eine neue Petrischale.Enthält gekühltes HBSS Schneiden Sie den Ator mit der gebogenen Pinzette in sehr kleine ein bis zwei Millimeter große Stücke. Verwenden Sie dann eine feuerpolierte Nudelpipette, um das Gewebe in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Reduzieren Sie das Volumen der Gewebesuspension auf insgesamt einen Milliliter und pipettieren Sie die Lösung weitere vier- bis sechsmal, polieren Sie die Spitze der Pipette auf etwa 30 % ihres ursprünglichen Durchmessers, um die Lösung weitere viermal zu verdreifachen, wenn die Lösung homogen erscheint, und die Zellaufschlämmung wird durch ein 100-Mikrometer-Nylonsieb in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geleitet.Dann, nachdem Sie die Platte sieben mal 10 hoch vier Zellen in 500 Mikroliter neuronale Kultur gezählt haben, geben Sie die mittlere Leistung gut in eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Rühren Sie die Vertiefung von links nach rechts und inkubieren Sie die Zellen dann 14 Tage lang, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie jede Vertiefung zweimal kurz mit PBS, um die Zellen von der Sechs-Well-Platte zu lösen.Geben Sie Tripsin EDTA-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie ein 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit Feuchtigkeit für fünf Minuten, um die Reaktion zu stoppen, und schrecken Sie das in ab. Geben Sie einen Milliliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung und geben Sie den Inhalt in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 440 mal G Bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Supinat und resuspendieren Sie das Pellet vollständig in 500 Mikrolitern neuronaler Kultur. Vergrößern Sie das Medium, indem Sie nach dem Zählen des Saatguts vorsichtig auf und ab pipettieren, dreimal 10 zu den vier Zellen pro Vertiefung in die 24-Well-Gewebekulturplatte, die die Neuronen enthält, und rühren Sie die Platte, um die Zellen zu dispergieren. Inkubieren Sie die Co-Kulturen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.In diesen Bildern wurde die Zelloberflächenexpression der GABA AR-Untereinheiten alpha eins, beta zwei und gamma zwei oder der GABA AR-Untereinheiten alpha eins, beta drei und gamma zwei mit einem hohen Grad an Kolokalisation auf den HC 2 93 Zellen beobachtet. Hier. Die Analyse der Zell-zu-Zell-Kontakte zwischen den HC 2 93-Zellen und den neuronalen Zellen nach 14 Tagen in vitro zeigt, dass GAD 65-positive GABAerge Axon-Terminals nur sporadische Kontakte mit den Kontrollzellen HEC 2 9 3 bilden, verglichen mit den zahlreichen synapsenartigen Kontakten, die zwischen HEC 2 93-Zellen gebildet werden, die das Alpha-Zellen exprimieren. Beta Zwei Gamma Zwei GABAA Rezeptoren. In diesen Experimenten wurden nur die Vesikel, die aktiv an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind, mit dem Antis-Synap-toin-Antikörper markiert.Wenn einer der Kontakte zwischen den Kontrollzellen HEC 2, 9, 3 und den mittelspinnierenden Neuronenterminals aktiv war. Dies wird durch die fehlende Kolokalisation zwischen der präsynaptischen GAD 65 synaptischen Tein Fluoreszenz und der mCherry Fluoreszenz innerhalb der HEC 2 93 Zellen verdeutlicht. Im Gegensatz dazu wurden viele aktive Kontakte zwischen den Medien, die die Neuronenendigungen binden, und dem alpha eins, beta zwei gamma zwei gabaa Rezeptor gebildet, der HEC 2 93 Zellen exprimiert, was durch einen hohen Grad an Kolokalisation zwischen der GAD 65 Synap Taman und der M Kirschfluoreszenz gezeigt wird, die spezifisch in den HEC 2 93 Zellen exprimiert wird.In diesen endgültigen Bildern wurden HEC 2 93-Zellen, die stabil einen anderen Subtyp von GABA AR exprimieren, mit mittelstacheligen Neuronen co-kultiviert. Die Analyse zeigt zahlreiche synapsenartige Kontakte, die zwischen Synapsen in einer positiven GABAergen Wirkung auf die Terminals und Alpha eins, B, zwei, drei Gamma, zwei gebildet werden, die HEC 2, 9, 3 Zellen nach 24 Stunden exprimieren. In der Co-Kultur hat diese Technik das Potenzial, Forschern auf dem Gebiet der molekularen Neurowissenschaften den Weg zu ebnen, die Rolle verschiedener synaptischer Adhäsionsmoleküle zu erforschen, die an der Bildung von GABAergen Synapsen beteiligt sind.

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Verbindungen zu GABA-A -Rezeptoren von der Bindung an die Physiologie und Pharmakologie aktiv zu entdecken.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine zellsortierbasierte Methode zur Reinigung und Kultur von fluoreszierenden GABAergischen oder glutamaterderen Neuronen aus dem Neocortex und Hippocampus von postnatalen Mäusen oder Ratten.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Ein gebrauchsfertiger gefrorener Vorrat an Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bewertung synaptischer Funktionen. Hier stellen wir eine einfache Primärkultur mit geringer Dichte aus gefrorenen Beständen unter Verwendung einer 96-Well-Platte vor.

Einfache und reproduzierbare Low-Density-Primärkultur mit gefrorenem Bestand embryonaler Hippocampus-Neuronen

Diese Studie stellt ein Multiskalen-Framework vor, das von der DNA über die Proteinfunktion bis hin zum neuronalen Verhalten reicht. Es stellt einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung vorhergesagter pathogener Mutationen in der GABA-A-Rezeptor-Untereinheit vor und stellt die Hypothese auf, dass epileptogene Mutationen und proximale Mutationen, die als pathogen vorhergesagt werden, ähnliche Effekte auf das CA1-Pyramidenneuronenmodell hervorrufen können.

Identifizierung und Klassifizierung von positionsspezifischen GABAA Rezeptor Subunit Missense Varianten für ihre Rolle in hippokampalen Pyramidenneuronen

Lernen Sie die Bildung hemmender GABAergener Synapsen in einem Co-Kultur-Modell mit embryonalen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA-A-Rezeptoren exprimieren. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung synaptischer Kontakte.

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA A Receptors (Video) | JoVE Journal

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA_A Receptors

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