Name: In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Lernen Sie zwei Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Messung der T-Zell-Antwort auf West-Nil-Virus-Infektionen kennen. Diese Methoden analysieren die Antigenpräsentation durch dendritische Zellen und die Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen.

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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse an T.W. (R01AI072060 und R01AI099123) unterstützt. G. Xie wurde durch ein Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) und Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) für die Bereitstellung der MyD88–/– Mäuse und Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) für die Bereitstellung von OTII transgenen Mäusen.

Alle Tierversuche wurden von der Animal Care und Verwenden Committee an der Universität Texas der medizinischen Niederlassung zugelassen. 1. Isolierung von DCs, die aus Nicht-Infizierte und WNV-infizierten Mäuse <ol><li> Alters- und geschlechts Spiel 6-10 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6 (B6) und MyD88 - / - Mäusen. Inokulieren intraperitoneal (ip) mit 500 plaquebildenden Einheit (PFU) von WNV NS4B- P38G Mutante. Am Tag 3 nach der Infektion einschläfern B6 und MyD88 - / - Mäuse mit CO 2. Verwendung von nicht-infizierten Mäusen beider Gruppen als Kontrollen. Verwenden Sie drei Mäuse aus jeder Gruppe. </li><li> Nasses Fell auf der linken Seite geopfert Maus mit 70% Ethanol und das Fell weggeschnitten an der linken Seite der Maus, etwa auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine. Schneiden Sie die Körperhöhle. Entfernen Sie die Milz mit Hilfe der Pinzette. Legen Sie die Milz in einer Petrischale mit RPMI. </li><li> Isolieren Milz DCs durch die Verwendung anti-CD11c magnetische Kügelchen nachAnweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Reinigung und Kennzeichnung von T-Zellen von OTII transgenen Mäusen <ol><li> Ernte eine Milz aus einer naiven OTII Maus, wie in Schritt 1.2 oben beschrieben und Homogenisierung der Milz zwischen den mattierten Enden von zwei Folien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, fügen RPMI-Medium bis zu 14 ml. Lassen die Suspension 5 min stehen und übertragen 13 ml in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Isolieren Milz CD4 + T-Zellen unter Verwendung eines CD4 + T-Zell-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers. </li><li> Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen zweimal mit PBS waschen. Zellen in PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 x 10 6 Zellen pro ml und mit 0,5 &amp; mgr; mol / ml CFSE. Bei 37 ° C für 10 min, vor Licht geschützt. </li><li> 5 ml kalter Vollmedium (RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1/100 VolAntibiotika / Antimykotika, 1/100 Vol L-Glutamin und 1 / 1.000 Vol 1000 · 2-Mercaptoethanol). </li><li> Inkubieren auf Eis für 5 min. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fix 0,2 x 10 6 beschriftet CD4 + T-Zellen in 2% PFA und erwerben mit einem Durchflusszytometer. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Grundniveau der CFSE bestimmen. Resuspendieren den Rest der markierten Zellen in Vollmedium. </li></ol> 3. Co-Kultur OTII T-Zellen mit DCs von WNV-infizierten Mäuse <ol><li> Kultur 2 x 10 5 gereinigten CD4 + T-Zellen von Mäusen OTII allein oder mit gereinigtem DCs von Wildtyp- oder MyD88 - / - Mäusen (2 x 10 4) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit oder ohne OVA 323-339 Rückstand (1 g / ml) in 1 ml Vollmedium pro Vertiefung. </li><li> Zellen bei 37 ° C für 5 Tage. Ernten Sie die Zellen, waschen zweimal in FACS-Puffer (PBS mit 1% FBS) und befestigen Sie in 0,25 ml 2% PFA. Vortex sofort. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Analyse der In-vitro-&lt;/ Em&gt; T-Zell-Priming <ol><li> Zur Erfassung, doppelklicken Sie auf die Durchflusszytometrie Software-Symbol. Bei einer Dichte von linearen Plot FSC-A vs. lineare SSC-A, wählen Sie die Kanäle 0 bis 200.000 auf FSC-A und 0 bis 200.000 auf SSC-A. Erstellen Sie dann ein Tor an lebenden Zellen (P2, siehe 1A). </li><li> Um die Fluoreszenzintensität von CFSE analysieren, öffnen Sie das Histogramm für die FL1-Kanal und erhalten 20.000 Events auf der gated Bevölkerung. Eine Markierung auf Samples für OTII Zellen alleine kultiviert (1A). </li><li> Erwerben Sie Proben für OTII Zellen co-kultiviert mit Wildtyp-DC (1B) oder MyD88 - / - DCs (1C) in ähnlicher Weise. </li></ol> 5. Isolierung und Stimulation von Splenozyten für Zytokin-Assays <ol><li> Infect B6 und MyD88 - / - Mäuse mit WNV NS4B-P38G Mutante mit dem gleichen Verfahren wie in ste beschriebenp 1,1. Am Tag 30 nach der Infektion erneut Herausforderung überlebenden Mäuse mit 2000 PFU des Wildtyp-Stamms WNV ip An den Tagen 8 und 21 nach der primären WNV-Infektion oder am Tag 4 nach Sekundärinfektion, einschläfern Mäuse mit CO 2 für die Sammlung von Milz . HINWEIS: Es wird verwendet, 2-3 Mäuse pro Gruppe für jeden Zeitpunkt. </li><li> Einen Einzelzellsuspension von Milzzellen wie oben in Schritt 1.2 &amp; Schritt 2.2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer und resuspendieren sie in 10 ml Vollmedium. </li><li> Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. 1 ml der Splenozyten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Um CD8 + -T-Zellen zu simulieren, verdünnter WNV spezifischen NS4B und E Peptide (SSVWNATTA und IALTFLAV) auf 1 mg / ml in DMSO. Zur Stimulation von CD4 + T-Zellen, verdünnter WNV spezifischen NS3 und E Peptide (RRWCFDGPRTNTILE und PVGRLVTVNPFVSVA) auf 1 mg / ml in DMSO. Zugabe von 10 ul der Peptide an die Zellen followed von 1 ul Brefeldin A-Lösung. Verwenden Zellen ohne Peptide Behandlung als Kontrolle. Mischen Sie die Zellen. </li><li> Stanzen zwei Löcher mit einem 18 G-Nadel in die Kappe der Röhre. Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden. </li></ol> 6. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung <ol><li> Übertragungszellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. 1 ml FACS-Puffer, Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen durch Pipettieren mit 120 ul FACS-Puffer. </li><li> Add 2 ul Fc-Blocker und inkubieren Zellen bei Raumtemperatur für 10 min. 1 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin 5 min bei 300 bis 400 x g. </li><li> Resuspendieren Zellen in 300 &amp; mgr; l FACS-Puffer und unterteilt sie in drei Rohre (etwa 0,8 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, behalten die erste Röhre jeder Kulturbedingung für Ratten-IgG-PE-Färbung. Der zweiten Röhre, werden 3 ul anti-CD4 APC an CD4-Peptiden behandelten Zellen, 3 μl anti-CD8-FITC an CD8 Peptiden behandelten Zellen oder beide Antikörper zu Zellen ohne Peptide Behandlung. Verwenden Sie die dritte Röhre auf Ersatz Färbung. Für jede Kulturbedingungen, verwenden Sie drei Röhren von Zellen mit APC-konjugiertem CD4 FITC-konjugiertem CD8 oder PE-markierten CD3-Antikörper allein (3 ul pro Röhrchen) als Entschädigung Steuerungen für FL1, FL2 und FL4 Kanäle gefärbt. </li><li> Wirbelzellen kurz. Lassen Sie auf Eis für 20 Minuten und vor Licht schützen. Fügen Sie 1,4 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. </li><li> Geschwenkt, um den Zellpellet (oder kurz Vortex) zu stören. Re-suspend Zellpellet in 250 ul Fixierung / Permeabilisierung solutionby Pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten und vor Licht schützen. </li><li> Fügen Sie 1,2 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 300 ul FACS-Puffer. HINWEIS: An diesem Punkt können die Zellen an einen BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung in einem Kühlschrank vor Licht u übertragen oder gespeichert und geschütztp bis drei Tage. </li><li> Fügen Sie 500 ul FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 500 ul 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 &amp; times; g. </li><li> Re-suspend Zellen in 100 ul 1x Perm / Wash, fügen 3,5 ul anti-IFN-PE auf das Rohr zuvor mit Antikörpern für CD4 und / oder CD8-T-Zellmarker in Schritt 6.3 und 3.5 ul Ratten-IgG-PE in der Röhre vorbehalten hinzugefügt IgG-Steuerung für 25 Minuten auf Eis und vor Licht schützen. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 &amp; times; g. Wiederholen Sie den Waschvorgang durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. </li><li> Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und dekantieren Stand. Wash-Zellen durch Zugabe von 1,4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 400 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die endgültige Übernahme. </li></ol> 7. Durchflusszytometrie Analyse der intrazellulären Zytokin-Färbung <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Erfassungseinstellungen wie in Schritt 4.1. Create ein Gatter an lebenden Zellen (P2, siehe 2A). Stellen Sie die Spannung über die Entschädigung Rohre für jede Gruppe. </li><li> Öffnen Sie zwei neue Dot-Plots, ein, um Daten für FL1 vs gesammelt anzuzeigen. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), und die andere ist, um Daten für FL4 vs gesammelt wurden. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erwerben 50.000 Veranstaltungen für die geschlossene Bevölkerung von jeder Probe. </li></ol>

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<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion 5 untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisierung...

West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch 1 zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm 2 induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für einen optimalen Impfstoffkandidaten. Die Mechanismen, mit denen die NS4B-P38G Mutante induziert hohe Schutz adaptiven Immunität noch nicht genau geklärt. Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular patterns erkennen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der angeborenen Immunität zu Virusinfektion. Der Kern TLR-Signalweges nutzt myeloische Differenzierung primäre Antwort gene 88 (MyD88) als primärer Adapter 3,4. In einer neueren Studie wurde MyD88 Signalisierungs gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von zellvermittelter Immunität während WNV NS4B- P38G Mutante Infektion bei Mäusen 5 zu spielen. Dendritische Zellen (DCs) sind eines der wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen die einzigartige Fähigkeit, primären T-Zell-Reaktionen während der viralen Infektion zu initiieren 6,7 aufweist. CD4 + und CD8 + T-Zellen sowohl für langanhaltende schützende Immunität bei und sind wichtig für die Host-Überlebensrate nach Wildtyp WNV Infektion 8,9. Zwei immunologischen Assays wurden in dieser Studie verwendet, um die Funktionen dieser Zellen in der NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen zu beurteilen. Zunächst wurde ein in vitro-T-Zell-Priming-Assay verwendet, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der DCs von WNV-infizierten Wildtyp-MyD88 und Vergleichen - / - Mäusen. Um die Empfindlichkeit des Assays, naive CD4 &lt;erhöhensup&gt; + T-Zellen wurden aus OTII transgenen Mäusen, die eine Vα2 / Vβ5 TCR spezifisch für das Hühner-Ovalbumin (OVA) Peptid exprimieren 323 isoliert - 339. DCs von WNV infizierten Mäusen wurden aufgereinigt und co-kultiviert mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ostern (CFSE ) -markierten CD4 + T-Zellen in Gegenwart von OVA-Peptid. Nach 5 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Proliferationsassays wurden traditionell durch Einbau von 5-Brom-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) oder tritiiertem Thymin desoxyribosid (3 HTdR) 10 durchgeführt. Dennoch sind diese Assays entweder radioaktive und / oder benötigen spezielle Ausrüstungen der Sicherheitsstufe (BL) 3 Anlagen, wo WNV Studien durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten-Proliferation durch serielle Halbierung der Fluoreszenzintensität des Vitalfarbstoffs CFSE geworden üblicherweise in immunologischen Assays verwendet werden, wie der Farbstoff stabilerund gleichmäßig in Zellen eingebaut, leicht durch Flusszytometrie nachgewiesen und ist nicht-radioaktiven 11. Der Test hat auch die Fähigkeit, die Anzahl der Zellteilungen zu beurteilen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser Assays in WNV Studien ist, dass die Fixierung der infizierten Zellen mit 1-2% PFA könnte WNV 12, die Probennahme mit einem Durchflußzytometer in einen BL2 Labor ermöglichen inaktivieren. Als nächstes wurde ein modifiziertes intrazellulärem Zytokinfärbung (ICS) Verfahren verwendet, um die Rolle von MyD88 Signalisierung in der Regulation der WNV spezifische T-Zellantworten in NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen untersucht. In diesem Test wurden Splenozyten aus infizierten Mäusen isoliert in vitro mit WNV spezifischen Peptiden behandelt. Brefeldin A wurde zugegeben, um die Cytokine in der Zelle zurückzuhalten. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, gewaschen und für die T-Zell-Subpopulationen gefärbt. Die Zellen wurden dann in PFA fixiert, permeabilisiert und für Interferon (IFN) -γ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Wie bei anderen auf Basis der Durchflusszytometrie-Assay, nachdem die Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Puffer mit PFA behandelten, infizierten Proben können auf eine BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung und Analyse übertragen. In mehreren veröffentlichten Studien haben wir ICS verwendet, um T-Zell-Effektorfunktionen in WNV-infizierten Mäusen 13,14 messen. Obwohl es gut etabliert ist, ist einen großen Nachteil dieses Tests, dass das Verfahren ist sehr langwierig und könnte mehr Zeit in Anspruch, wenn sie innerhalb BL3 Einrichtungen durchgeführt werden. Hier wurde ein Mikrozentrifugenröhrchen Basis ICS Verfahren gezeigt, dass mehr möglich ist, leichter zu gehen und weniger zeitaufwendig, wenn sie innerhalb einer BL3 Labor.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>warmes Aufwärmen bei 37 > C</td></tr><tr><td>Anti-CD11c Magnetkügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>folgen Sie dem Hersteller' </td></tr><tr><td>Anti-CD4-Magnetkügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>folgen Sie dem Hersteller' Anweisungen</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>OVA-Rückstand 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-Lösung</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Maus Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjugiertes CD4</td><td>e-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes CD8</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungslösung</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilisierungs-/Waschpuffer</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Accuri Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-analyse myd88-vermittelte zelluläre immunantwort gegen das west-nil-virus-infektion mutantenstamm

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren - eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) - wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 + T-Zellen von OTII transgenen Mäusen - im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.

In der T-Zell-Priming-Assay wurden CFSE markierten CD4 + T-Zellen mit gereinigtem DCs aus der NS4B-P38G Mutante infizierten Wildtyp-MyD88 und kultiviert - / - Mäusen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptide. Markierten T-Zellen alleine mit oder ohne OVA kultiviert für 5 Tage wurden als negative Kontrollen verwendet. Wie in 1A gezeigt ist, wurden die gesamten T-Zellen für die Analyse der Fluoreszenzintensität von der FL1-Kanal torge. Die Markierung wurde auf der Grundlage...

Zwei auf Durchflusszytometrie basierende Methoden – ein in vitro T-Zell-Priming-Assay und intrazelluläre Zytokinfärbung – wurden verwendet, um die Antigenpräsentationskapazität von dendritischen Zellen und antigenspezifische T-Zell-Antworten auf eine West-Nil-Virus-mutierte Infektion bei Mäusen zu messen.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist die Einführung von zwei auf Durchflusszytometrie basierenden immunologischen Assays zur Messung der zellvermittelten Immunantwort auf eine West-Nil-Virusinfektion im in vitro T-Zell-Priming-Assay für dendritische Zellen oder dcs, die von mit dem West-Nll-Virus infizierten Mäusen gereinigt wurden. Eine Co-Kultur mit naiven CFSE-markierten T-Zellen, die aus OT zwei transgenen Mäusen in Gegenwart von Eizellenpeptid gereinigt wurden. Die Proliferationsreaktion der T-Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie in einem Labor der Biosicherheitsstufe zwei in dem modifizierten intrazellulären Zytokin-Färbeassay PLE-Zyten von mit dem West-Nil-Virus infizierten Mäusen analysiert, A ex vivo mit West-Nil-spezifischen Peptiden in einem Mikrozentrifugenröhrchen stimuliert und dann die Zelle für die intrazelluläre Zytokinproduktion aufrechterhalten und im Röhrchen durch Durchflusszytometrie im Labor der Biosicherheitsstufe zwei analysiert.Letztendlich können diese Methoden verwendet werden, um die Rolle spezifischer Signalwege bei der Aktivierung von T-Zellen bei mit dem West-Nil-Virus infizierten Tieren zu untersuchen, und sie verkürzen die Leistungszeit in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe drei erheblich. Obwohl diese Methode einen Einblick in die zelluläre Immunität des westlichen N-Virus geben kann, kann sie auch auf andere Erreger der Biosicherheitsstufe drei für den In-vitro-T-Zell-Priming-Assay angewendet werden. Beginnen Sie mit der Isolierung von Milzzellen aus Wildtyp C 57 schwarz sechs A, meine D acht acht Knockout-Mäuse, die mit dem West-Nil-Virus geimpft wurden, und kontrollieren Sie nicht infizierte Tiere mit Anti-CD 11 C-Magnetkügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers.Um dann die T-Zellen zu isolieren, homogenisieren Sie die Milz, die von einer OT-2-Maus mit den mattierten Enden von zwei Objektträgern präpariert wurde, übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie dann RPMI-Medium zu einem endgültigen Volumen von 40 Millilitern hinzu. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen und überführen Sie dann 30 Milliliter des Suppenmaterials in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie anschließend ein CD-Vier-positives T-Zell-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die CD vier positiven T-Zellen zu sortieren, und übertragen Sie dann die gesammelten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von zwei Waschgängen in PBS. Nach dem zweiten Waschen inkubieren Sie die Zellen in PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin zu einem Cent der sechs Zellen pro Milliliter und 0,5 Mikromolaren pro Milliliter CFSE bei 37 Grad Celsius geschützt Nach 10 Minuten aus dem Licht inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang in fünf Millilitern kaltem, vollständigem Medium auf Eis.Dann, nach einer weiteren PBS-Wäsche, fixieren Sie 0,2 mal 10 an die sechs CFSE-markierten CD vier positive T-Zellen in 2%PFA und bestimmen Sie das basale Niveau der CFSE-Expression der T-Zellen durch Durchflusszytometrie. Den Rest der CFSE-markierten Zellen, unvollständig, Medium, resuspendieren und dann zweimal 10 auf die fünf gereinigten oder zwei CD vier positiven T-Zellen allein oder mit zwei mal 10 auf die vier gereinigten Wildtypen oder meine D acht acht Knockout-dcs in einer 24-Well-Platte mit oder ohne ein Mikrogramm pro Milliliter über dem Rest 3 23 3 39 in einem Milliliter vollständigem Medium pro Vertiefung bei 37 kultivieren Grad Celsius nach fünf Tagen, ernten Sie die Zellen und waschen Sie sie zweimal in Fakten, puffern und fixieren Sie die Pellets in 0,25 Millilitern 2%PFA und wirbeln Sie die Proben sofort für die Durchflusszytometrie-Datenerfassung vortexen. Doppelklicken Sie auf die Durchflusszytometrie-Software und wählen Sie die Kanäle Null bis 200.000 bei Vorwärtsstreuung und Null bis 200.000 bei Seitenstreuung, um ein Dichtediagramm zu erstellen.Erstellen Sie dann ein Gate an den Live Wells, um die Fluoreszenzintensität des CFSE zu analysieren. Öffnen Sie das Histogramm für den FL-Kanal mit einem Kanal, und erfassen Sie 20.000 Ereignisse für die abgegrenzte Population. Richten Sie dann einen Marker auf den Proben für die OT ein, zwei Zellen, die allein kultiviert wurden.Erfassen Sie Daten für die OT-Co-Kultur von zwei Zellen mit Wildtyp oder my D acht Knockout-dcs auf ähnliche Weise für den intrazellulären Zytokin-Färbeassay. Nach der Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus Milz, die aus dem West-Nil-Virus gewonnen wurde, zählen infizierte Mäuse zu den richtigen Zeitpunkten die Zellen und verdünnen sie dann mit vollständigem Medium auf das 2,5-fache der sechs Zellen pro Milliliter-Konzentration. Als nächstes wird ein Milliliter der Zyten in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentri-Röhrchen gegeben.Und dann, um die Zöliakie zu stimulieren, acht positive T-Zellen, fügen Sie 10 Mikroliter frisch verdünnte westliche spezifische Peptide hinzu, gefolgt von einem Mikroliter Feld. Mischen Sie die Zellsuspensionen in einer Lösung vorsichtig und stanzen Sie dann mit einer 18-Gauge-Nadel zwei Löcher in die Kappe des Röhrchens und inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nach dem Waschen um einen Milliliter Faxpuffer geschleudert haben, suspendieren Sie das zweite Pellet wieder in 120 Mikrolitern Faxpuffer.Blockieren Sie dann die unspezifischen Bindungsstellen mit dem FC-Block und markieren Sie die Röhrchen mit den entsprechenden experimentellen und Kontrollantikörpern, wie in der Tabelle dargestellt. Als nächstes werden die Zellen in Fixierungs- und Permeationspuffer inkubiert und dann die Zellen zur Markierung mit Kontroll- oder Anti-Interferon-Gamma-Antikörpern gemäß der Tabelle auf eine Biosicherheitsstufe ins Labor gebracht. Um die intrazelluläre Zytokinproduktion zu messen, richten Sie wie gerade gezeigt ein Forward-by-Side-Streudiagramm ein und gaten Sie dann die lebenden Zellen mit den Kompensationsröhren, um die Spannungen nach Bedarf anzupassen.Erstellen Sie ein Punktdiagramm, um die Daten anzuzeigen, die für die Zellen mit acht positiven CDs im Vergleich zu gamma-positiven Zellen mit Interferon erfasst wurden, gefolgt von einem weiteren Diagramm für die Zellen mit vier positiven CDs und gamma-positiven Zellen mit Interferon, und erfassen Sie 50.000 Ereignisse für die Gated Population jeder Probe. In diesem Experiment wurden die Gesamt-C-Zellen gegated, um die basale T-Zell-Proliferationsrate zu bestimmen. In Ermangelung einer Co-Kultur mit dcs.Als die T-Zellen in Co-Kultur mit DC aus mit dem West-Nil-Virus infizierten Tieren isoliert wurden, zeigten die CFSE-positiven T-Zellen eine 87%ige Proliferation CFSE-markierte T-Zellen Co-Kultur mit DCS von my D acht acht Knockout-Mäusen in Gegenwart von über wiesen eine Proliferationsrate von 74,5% auf, was darauf hindeutet, dass der Mangel im my D acht acht Signalweg zu einer beeinträchtigten Antigenpräsentationskapazität durch das DCS während einer mutierten West-Null führt Virusinfektion. Der prozentuale Anteil von Milz-, vier positiven Interferon-, Gamma-positiven und acht positiven Interferon-Gamma-T-Zellen, die aus mit dem West-Nil-Virus infizierten Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, betrug in dieser repräsentativen Zahl 0,4 % bzw. 1,7 %. Während der Prozentsatz der doppelt positiven Milz-T-Zellen, die aus dem West-Nil-Virus isoliert wurden, meine D-Acht-Knockout-Mäuse nur 0,2 % und 0,6 % betrugen. Ähnliche Analysen wurden mit Zyten durchgeführt, die von nicht infizierten Mäusen isoliert wurden, wobei kein Unterschied im Prozentsatz der doppelt positiven T-Zellen der Populationen zwischen den beiden Gruppen beobachtet wurde.Darüber hinaus machten die einzelnen positiven Populationen der CD-4-positiven und CD-8-positiven T-Zellen der infizierten Wildtyp-Mäuse 21 % bzw. 13,3 % der gesamten gated SP-Zyten aus, während sie im Vergleich zu den infizierten Gruppen nur 15,9 % und 11,2 % der my D acht Knockout-SP-Zyten ausmachten. Sowohl CD 4 positive als auch CD 8 positive T-Zell-Antworten waren bei my D acht acht Knockout-Mäusen im Vergleich zu den infizierten Mäusen reduziert. zur Wildtyp-Gruppe am achten Tag nach der Infektion mit dem mutierten Westschneckenvirus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine D acht acht Signaltransduktion an der anfänglichen T-Zell-Aktivierung beider Populationen beteiligt ist und zu CD 4 positiven T-Zell-Antworten in einem späteren Stadium der Infektion beiträgt. Die auf Grippezytometrie basierende in vitro T-Zell-Primase, bei der in der CFSE markierte OT-T-Zellen verwendet werden, ermöglicht eine genauere Bestimmung des Prozentsatzes proliferierender CD4-positiver T-Zellen mit einer deutlich verbesserten Gesamtsensitivität als die aktuellen Standardprotokolle.Die Mikrofeldröhre ICS Math third benötigt keine speziellen Instrumente, was für Forscher sowohl eine wirtschaftlichere als auch eine flexiblere Wahl bietet.

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Research

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