Name: Fluoreszenzbasierten Primer Extension-Technik, um Transkriptionsstartpunkte und Schnittstellen von RNasen Bestimmen In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die fluoreszenzbasierte Primer-Extension-Methode zur Kartierung von Transkriptionsstartpunkten und RNA-Spaltstellen in vivo bei Bakterien. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen mit automatisiertem Gel-Sequenzer.

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Wir danken Anne Wochele für ihre Unterstützung im Labor und Vera Augsburger für die Hilfe mit dem automatisierten Gelsequenzierer. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Förderung durch die Förderprogramme BE4038/2 und BE4038/5 im Rahmen der "Schwerpunktprogramme" SPP1316 und SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen, was einen Interessenkonflikt darstellen würde.

Fluoreszierende Primerverlängerung ist ein einfaches und schnelles Verfahren zur Bestimmung der 5&#39;-Enden der RNAs, entweder für TSP- oder sekundäre RNA-Prozessierung Identifikation. Durch die Verwendung von fluoreszierenden Primern können die Umsetzungen eingerichtet werden und ausgeführt werden, ohne zusätzliche Sicherheitseinrichtungen (anders als im Fall von radioaktiv markierten Primern). Da die Proben durch Fluoreszenz detektiert, können sie abgebildet werden, während der Elektrophorese durchgeführt wird, die s...

Primerverlängerungs 1 ist ein Molekular Methode, um die 5'-Enden der spezifischen RNA-Moleküle bis zu einer eine Basisauflösung bestimmen. Der Vorteil gegenüber anderen Verfahren, wie 5'-RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) ist die schnelle Durchlaufzeit und die Fähigkeit, leicht zu analysieren, die eine Mischung von verschiedenen Längen von RNA-Molekülen. Diese Methode funktioniert, indem RNA-Moleküle, die Transkription Reaktionen Reverse mit spezifischen fluoreszierenden Primer, Erzeugung cDNA-Fragmente bestimmter Längen. Diese cDNA-Moleküle werden neben der traditionellen Sanger-Sequenzierungsreaktionen 2 auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelen und durch ihre Fluoreszenz aufgrund der Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern nachgewiesen werden. Die Längen der cDNA-Fragmente werden dann durch Vergleich mit der Sequenzierungsleiter beurteilt, so dass die Zuordnung der 5'-RNA-Ende. Traditionell werden Primer-Verlängerungsreaktionen in Verbindung verwendet werdenmit radioaktiven Isotopen, um cDNA-Moleküle auf Röntgenfilmen zu erkennen. Wegen der Gesundheitsrisiken, Entsorgungsprobleme und der einfachen Handhabung, neuere Protokolle zu nutzen Fluoreszenz zum Nachweis der Primer-Extension mit automatisierten Sequenzer, wenn ihre Empfindlichkeit ist etwas niedriger. Mit fluoreszenzmarkierten Primern kann die wiederkehrende Radiomarkierungsverfahren verzichtet werden, als fluoreszierende Primer sind für eine lange Zeit (mehr als ein Jahr in unseren Händen) stabil. Die Methode, die wir hier beschreiben, nutzt ein automatisiertes Gel Sequenzer, aber mit leichten Modifikationen können Kapillare Sequenzern auch für die cDNA Trennung und Detektion 3 verwendet werden. Die Parallelität der Gel-Analyse ermöglicht es, auch eine kleine Menge der RNA-Spaltung oder Verarbeitung zu erfassen. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Auflösung dieses Verfahrens als terminale Spaltung oder Verarbeitung von nur einer Basis detektiert werden. In Bezug auf den Nachweis von RNA-Spaltung oder Verarbeitung, typically zwei verschiedene Arten von Primer-Extensions unterschieden. In einem Fall wird die enzymatische Behandlung in vitro durchgeführt unter Verwendung gereinigter RNA und gereinigtes Enzym, wohingegen in dem anderen Fall, wird die Verarbeitung in vivo durchgeführt und die resultierende RNA wird gereinigt. In beiden Fällen wird die RNA unterzogen, um eine Primer-Extension durchgeführt in vitro, jedoch in Abhängigkeit von der Quelle der RNA wird das Verfahren entweder bezeichnet eine in vitro oder in vivo Primerverlängerung. In dem Protokoll wir hier konzentrieren wir uns lediglich auf der in-vivo-Primerverlängerung, aufgrund der Einfachheit der Nutzung (keine gereinigten Proteine ​​notwendig) und die Möglichkeit zur Transkriptionsstartpunkte und die Verarbeitung in der gleichen Zeit zu bestimmen. Allerdings sind in vitro Primerverlängerungen im Prinzip die gleiche Weise eingestellt und dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt dienen. Das hier dargestellte Verfahren kann auf viele Bakterienarten, solange sie zugänglich sind hoch angewendetReinheit und High-Yield-Vorbereitung von Nukleinsäuren. Die Forschung in unserem Labor konzentriert sich auf den Regelungsbereich von Toxin-Antitoxin (TA) Systeme 4,5, einem Bereich, in dem die Primer-Extension-Methode wird intensiv genutzt. TA-Systeme sind kleiner in prokaryotischen Genom, das aus einem stabilen und endogen aktive toxische Protein und einer meist instabil Protein oder RNA-Antitoxin, die Toxizität entgegen 6,7 bestehen vorliegenden genetischen Elemente. Toxinaktivität wird manchmal durch Hemmung der Replikation, der Zellwandsynthese oder andere Mechanismen, die von RNase-Aktivität 8,9 ausgeübt wird, aber meistens. Typischerweise wird RNase Spezifität durch die Durchführung verschiedener Tests, von denen der eine der Primer-Extension-Methode bestimmt. Primer-Verlängerungsreaktionen sind für diese Anwendung gut geeignet, da eine Mischung aus gespaltenen und in voller Länge Fragmente können gleichzeitig analysiert werden, um festzustellen ihren 5'-Enden. Verwendung einer Mischung von in vitro und in vivo Primerverlängerungen, diespezifische Toxin RNase-Spaltung, zB Sequenzspezifität bestimmt 10-13 werden. <img alt="Primer-Verlängerung, RNA-Isolierung, cDNA-Synthese, Sanger-Sequenzierung, Gelelektrophorese-Diagramm." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figur 1"> Abbildung 1. Übersicht der Primerverlängerungsverfahren. Bakterielle Kulturen werden nach den experimentellen Anforderungen inkubiert und behandelt. Gesamt-RNA wird aus den Zellen mit DNase I behandelt, um DNA-Spuren zu entfernen, und einer Umkehrtranskriptionsreaktion unter Verwendung von Ziel-DNA spezifischen Fluoreszenz Primer wodurch cDNA unterworfen extrahiert. Genomische DNA oder Plasmide extrahiert und anschließend zur Fluoreszenz Sanger-Sequenzierungsreaktionen zum Größenvergleich mit den cDNA-Fragmenten verwendet. Primerverlängerungsprodukte sind neben Sanger-Sequenzierungsprodukte auf einem denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgel laufen und mit einem automatisierten Laser und Mikroskop analysiert. Die Sequenzierung Basis, die Linie mit dem cDNA-Band ist die last Basis des 5 'cDNA Ende (blauer Pfeil). Weitere Informationen im Fekete et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Eine Übersicht über den gesamten Primerverlängerungsverfahren kann in 1 gefunden werden. Kurz gesagt, kultiviert, geerntet sind bakterielle Zellen, das Zellpellet lysiert und die RNA extrahiert. Gereinigte RNA wird dann mit DNase I behandelt, um Spuren von DNA-Molekülen, die als Matrizen für die reverse Transkriptase wirken könnten, zu entfernen. Spezifische fluoreszierende Primer an die RNA gegeben, um die Region von Interesse hybridisiert und anschließend revers transkribiert, wodurch einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA). Ein Sequenzierleiter wird von traditionellen Sanger-Sequenzierung erstellt die Verwendung von Fluoreszenz Primer und auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel neben der Primerverlängerung cDNA-Fragmente getrennt. Das resultierendeGel wird durch den Vergleich der Fluoreszenzbanden, die eine Identifizierung des 5'-Enden von Interesse analysiert. Transkriptionsstartpunkte und Verarbeitungsstellen werden dann einzeln durch Sequenzvergleiche geprüft.

<table><tbody><tr><td>AMV Reverse Transkriptase (20-25 U/&micro; l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-frei)</td><td>Ambion (Lebenstechnologien)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierte Primer</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 Modifikation von " gewöhnlich" DNA-Oligonukleotide. Kompatible Farbstoffe wie der LICOR IRDye 700/800 sind auch von anderen Anbietern wie IDTdna erhältlich.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer inkl. ImagIR Datenerfassungssoftware</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Produkt abgekündigt</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuklease freies Wasser</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Preparation Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Konzentrat</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNA STORAGE</td><td>BUFFER Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternativ: " Säure-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)" von Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; In RNase Inhibitor</td><td>Ambion (Lebenstechnologien)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase fluoreszenzmarkiertes Primer-Zyklus-Sequenzierungskit mit 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenzien</td><td>Lebenszeittechnologien</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Zirkonoxid/Kieselsäure-Kügelchen 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzbasierten primer extension-technik, um transkriptionsstartpunkte und schnittstellen von rnasen bestimmen in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluoreszenzbasierten Primer-Extension (FPE) ist ein Molekular Methode, um Transkriptionsstartpunkte oder Verarbeitungsstätten von RNA-Molekülen zu bestimmen. Dies wird durch die reverse Transkription der RNA von Interesse mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Primern und anschließender Analyse der resultierenden cDNA-Fragmente durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese erreicht. Gleichzeitig wird eine traditionelle Sanger-Sequenzierungsreaktion auf dem Gel laufen gelassen, um die Enden der cDNA-Fragmente anzeigen, um deren genaue entsprechenden Basen. Im Gegensatz zu 5&#39;-RACE (Rapid Amplification von cDNA-Enden), wobei das Produkt muss kloniert und sequenziert mehreren Kandidaten kann die Masse der cDNA-Fragmente durch Primerverlängerung erzeugt werden gleichzeitig in einem Gel laufen detektiert werden. Zusätzlich kann das gesamte Verfahren (von der reversen Transkription der endgültigen Analyse der Ergebnisse) an einem Arbeitstag abgeschlossen sein. Durch die Verwendung fluoreszierend markierter Primer, die Verwendung von gefährlichen radioaktiven Isotop markierten Reagenzienvermieden werden und die Bearbeitungszeit verringert werden als Produkte können während der Durchführung der Elektrophorese nachgewiesen werden. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir ein in vivo Fluoreszenz Primer-Extension-Methode auf das 5&#39;-Ende der RNA schnell und zuverlässig zu erfassen, abzuleiten Transkriptionsstartpunkte und RNA-Verarbeitungsstellen (zB durch Toxin-Antitoxin-Systemkomponenten) in S. aureus, E. coli und anderen Bakterien.

Wie in 6 dargestellt, kann ein Primer-Verlängerungsreaktion verwendet werden, um die Transkriptionsstartpunkte von Transkripten von Interesse zu bestimmen, und kann helfen, Promotorregionen ableiten (typischerweise -10 bis -35 Elemente identifiziert). Die oberste (längste) cDNA Fragment stellt das 5'-Ende der mRNA und somit leicht zugeordnet werden, wenn im Vergleich zu der Sequenzierungsleiter werden. <img alt="Beginn der ompA-Transkription, mRNA-Spaltung; Gelelektrophorese,...

Wir beschreiben hier eine fluoreszenzbasierte Primer-Verlängerungsmethode, um transkriptionelle Startpunkte aus bakteriellen Transkripten und RNA-Prozessen in vivo mit einem automatisierten Gelsequenzierer zu bestimmen.

Fluoreszenzbasierten Primer Extension-Technik, um Transkriptionsstartpunkte und Schnittstellen von RNasen Bestimmen In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, transkriptionelle Ausgangspunkte und RNAs-Spaltstellen in vivo von Bakterien mit Hilfe einer fluoreszierenden Primer-Verlängerungsreaktion zu identifizieren. Dazu werden zunächst Bakterien wie E. coli oder S. aria gezüchtet und die RNA-Moleküle isoliert. Als nächstes wird die RNA unter Verwendung spezifischer fluoreszierender Primer und reverser Transkriptase reverse transkribiert, was zu CD-NA-Fragmenten führt.Dann werden DNA oder Plasmide aus den Bakterienzellen isoliert und mit einem Sequenzierungskit eine fluoreszierende Sanger-Sequenzierungsleiter aus dem DNA-Template erstellt. Schließlich werden die CDNA-Fragmente und Sequenzierungsleitern getrennt und gleichzeitig mit einem automatisierten Gelsequenzierer auf einem Polyacrylamid-Gel detektiert und miteinander verglichen. Letztendlich wird die Fluoreszenz-Primer-Verlängerung verwendet, um die fünf Primzahlen von RNA-Molekülen mit einer Auflösung von einer Base abzubilden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der rassen- oder radioaktivitätsbasierten Primärerweiterung, ist die schnelle Identifizierung der fünf Enden von RNA-Molekülen, da der Nachweis gleichzeitig während der Elektrophorese erfolgt. Die Sensitivität ist ähnlich wie bei primären Erweiterungen auf roter Aktivität, ermöglicht es dem Laborpersonal jedoch, diese Methode zu verwenden, ohne dass eine Schulung zum Strahlenschutz bei der Geschwindigkeitsaktivität erforderlich ist. Wir haben diese fluoreszierende primäre Verlängerungstechnik erfolgreich eingesetzt, um die RNAs-Komponenten von Toxin-Antitoxin-Systemen zu untersuchen.Staphylokokken, die das Verfahren demonstrieren, wird von Christopher Schuster, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie eine hohe RNA-Ausbeute vorbereitet und die Primer gemäß dem Textprotokoll entworfen haben, führen Sie die Primerverlängerungsreaktion durch, indem Sie zuerst den Thermocycler auf 95 Grad Celsius vorheizen. Mischen Sie für jede RNA-Probe die folgenden Verbindungen in ein PCR-Röhrchen, denaturieren Sie die Proben eine Minute lang bei 95 Grad Celsius.Legen Sie dann die Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, um die Primer und die RNA zu hybridisieren. Stellen Sie als Nächstes das PCR-Gerät auf 47 Grad Celsius ein. Bereiten Sie dann den reversen Transkriptions-Mastermix vor, wie hier beschrieben.Fügen Sie jeder hybridisierten RNA-Probe vier Mikroliter und einen reversen Transkriptions-Mastermix hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 47 Grad Celsius. Um die Reaktion zu stoppen, erhitzen Sie die Proben zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Dann sechs Mikroliter Formamid-Ladefarbstoff zugeben und über Nacht oder bis zu zwei Wochen im Dunkeln bei minus 20 Grad Celsius lagern.Nach der Herstellung der genomischen DNA oder Plasmide gemäß dem Textprotokoll wird die Sanger-Sequenzierungsreaktion zusammengesetzt, indem 12 Mikroliter von etwa 10 bis 15 Mikrogramm genomischer DNA oder 100 bis 500 Nanogramm Plasmid-DNA mit einem Mikroliter fluoreszenzmarkiertem Primer und einem Mikroliter DMSO-Pipette gemischt werden. Ein Mikroliter jeder Sequenzierung wird in separate, vormarkierte PCR-Röhrchen gemischt. Geben Sie dann drei Mikroliter der Grundierungsmischung D-N-A-D-M-S-O in jede Tube.Stellen Sie das PCR-Gerät auf das folgende Programm ein und führen Sie es aus, nachdem Sie die Proben in das Gerät eingelegt haben. Geben Sie nach dem Lauf sechs Mikroliter Ladefarbe zu den Proben und dann auf Eis. Bei sofortiger Verwendung oder bei minus 20 Grad Celsius über Dauer mit sauberen, staubfreien 25 Zentimeter Platten platzieren Sie 0,25 Millimeter Abstandshalter auf der hinteren Glasplatte und senken Sie die gekerbte Glasplatte oben ab, wobei das gekerbte Ende der Glasplatten und die Schieneneinführungspiloten beide nach oben zeigen.Befestigen Sie die Gelschienen an beiden Seiten der Glasplatten und ziehen Sie die Knöpfe leicht fest, um das Gel zu gießen. Die hier aufgeführten Verbindungen in einem Becherglas mit einem Rührstab vermischen und auf eine magnetische Rührplatte geben. Unmittelbar nach der Zugabe eines PS und dem Teamieren verwenden Sie eine 50-Milliliter-Spritze, um die Acrylamidlösung aufzunehmen, und platzieren Sie einen 0,45-Nanometer-Filter auf der Spitze.Legen Sie die Sandwichplatten in einem Winkel von 10 bis 20 Grad und geben Sie die Gellösung langsam zwischen den Glasplatten ab, während Sie die Spritzenspitze kontinuierlich von einer Seite zur anderen bewegen. Beenden Sie die Abgabe der Gellösung, sobald sie auf das untere Ende der Glasplatten trifft. Entferne mit einem Seifenblasenhaken eventuell gebildete Blasen.Schieben Sie dann den Abstandshalter der Geltasche zwischen die Glasplatten am gekerbten Ende, tauchen Sie ihn in die Gellösung ein und fixieren Sie ihn, indem Sie die Gießplatte anbringen, ziehen Sie die Schrauben der oberen Schiene leicht fest und lassen Sie das Gel ein bis zwei Stunden lang aushärten. Bevor Sie die Gießplatte und den Taschenabstandshalter entfernen, verwenden Sie destilliertes entionisiertes Wasser, um die Tasche von Salz- und Gelrückständen zu reinigen, um das Gel laufen zu lassen. Schieben Sie den Pufferbehälterhalter in die Gelschienen an den vorderen Glasplatten und ziehen Sie die Knöpfe fest.Legen Sie das Gel in den unteren Geltank des automatisierten Gel-Imagers gegen die Heizplatte und fixieren Sie es, indem Sie den Schieneneinführungspiloten in die Gerätehalterungen schieben. Verwenden Sie einen XTBE-Puffer, um die oberen und unteren Gelpufferkammern zu füllen. Schließen Sie dann die untere Pufferkammer und verwenden Sie das Netzkabel, um die obere Pufferkammer an die Stromversorgung anzuschließen.Wenn Salz in der Geltasche vorhanden ist, pipettieren Sie mit Puffer wiederholt in die Tasche, um sie zu reinigen. Verwenden Sie dann den oberen Pufferdeckel, um die obere Puffertankkammer zu schließen. Nachdem Sie den Imager und den Computer eingeschaltet und die IR-Datenerfassungssoftware für das Basisbild gemäß dem Textprotokoll gestartet haben, verwenden Sie die hier aufgeführten Einstellungen, um die Scannersteuerung einzurichten.Führen Sie anschließend das leere Gel 20 Minuten lang vor, indem Sie die Spannung ein wählen und die Eingabetaste drücken. In der Zwischenzeit erhitzen Sie die Sequenzierleiter und die Primerverlängerungsprodukte mit einem PCR-Gerät zwei Minuten lang auf 90 Grad Celsius. Bevor Sie auf Eis abkühlen, stoppen Sie die Elektrophorese, öffnen Sie den automatisierten Gelsequenzierer und entfernen Sie den oberen Deckel des Puffertanks. Führen Sie dann den Haifischzahnkamm zwischen die Glasplatten und mit den Haifischzähnen ein.Durchstechen Sie die Gelpipette leicht und stechen Sie ein bis zwei Mikroliter der Primer-Verlängerungsprodukte oder Sequenzierungsleiterreaktionen in jede Geltasche. Für leere Taschen. Verwenden Sie Ladefarbe, um ein inkonsistentes Laufverhalten zu vermeiden, schließen Sie den Puffertank und die Tür des Gelsequenzers.Starten Sie dann die Elektrophorese, indem Sie für den Laser die Spannung einwählen, den Scanstatus ein wählen und die Eingabetaste drücken. Sobald der interessierende Bereich den Laser passiert hat, stoppen Sie die Elektrophorese, wie hier gezeigt. Eine Primer-Verlängerungsreaktion kann verwendet werden, um die transkriptionellen Startpunkte oder TSP von Transkripten von Interesse zu bestimmen und kann helfen, Promotorregionen abzuleiten.In diesem Beispiel wurde der TSP der MPE-mRNA als G identifiziert, was mit früheren veröffentlichten Daten übereinstimmt. Die Promotorelemente minus 35 und minus 10 wurden als T-T-G-T-A-A und T-A-G-A-C-T abgeleitet, und diese Motive unterscheiden sich nur zu Basen aus jeder ihrer Konsensussequenzen, wobei eine Primerverlängerung zur Identifizierung von mRNA-Spaltprodukten verwendet wird. Die RNA-Kartierung der Spaltung in der Nähe des START-Codes durch die RNA Ybi SEC two ist hier dargestellt, wenn die RNAs nicht vorhanden oder inaktiv sind, es werden keine Primer-Verlängerungsprodukte in der Nähe des Start-Co-ons als Ergebnis der RNA-Aktivität gebildet.In dieser Abbildung sind jedoch zwei starke Banden direkt hinter der Startschicht zu sehen. Diese Abbildung zeigt ein fehlgeschlagenes Primer-Verlängerungsexperiment aufgrund von überschüssiger RNA in der reversen Transkriptionsreaktion, die die Identifizierung einzelner Banden verhindert. Dies zeigt, dass die Gesamtmenge der Template-RNA an die Häufigkeit der interessierenden RNA angepasst werden muss. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie transkriptionelle Ausgangspunkte und RNA-Spaltstellen in vivo mit fluoreszierenden Primern und einem automatisierten Gelsequenzierer mit etwas Übung aufklären können.Diese Methode ist schnell und einfach durchzuführen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.

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Wir beschreiben photobleaching Methoden einschließlich Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Loss In Photobleaching (FLIP) zu Chromatin Protein Dynamik in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu überwachen. Chromatin Protein Dynamik, die als eines der Mittel, um das Chromatin Plastizität zu studieren, ist in pluripotente Zellen verbessert.

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

In dieser Arbeit stellen wir einen experimentellen Workflow zur Verfügung, wie aktive Enhancer identifiziert und experimentell validiert werden können.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll misst quantitativ die Stabilität und Halbwertszeit intergener und intragenischer Enhancer-RNAs in embryonalen Mausstammzellen mittels Actinomycin-D-Behandlung, RT-qPCR und nichtlinearer Regressionsanalyse. Positionsspezifische Normalisierungsstrategien werden integriert, um die Zerfallsdynamik von eRNA kontextabhängig genau zu modellieren.

Optimierte quantitative Bewertung der Stabilität der Enhancer-RNA in embryonalen Mausstammzellen

Lernen Sie die fluoreszenzbasierte Primer-Extension-Methode zur Kartierung von Transkriptionsstartpunkten und RNA-Spaltstellen in vivo bei Bakterien. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen mit automatisiertem Gel-Sequenzer.

Fluoreszenzbasierten Primer Extension-Technik, um Transkriptionsstartpunkte und Schnittstellen von RNasen Bestimmen In Vivo

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