Fluoreszenzbasierten Primer Extension-Technik, um Transkriptionsstartpunkte und Schnittstellen von RNasen Bestimmen In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, transkriptionelle Ausgangspunkte und RNAs-Spaltstellen in vivo von Bakterien mit Hilfe einer fluoreszierenden Primer-Verlängerungsreaktion zu identifizieren. Dazu werden zunächst Bakterien wie E. coli oder S. aria gezüchtet und die RNA-Moleküle isoliert. Als nächstes wird die RNA unter Verwendung spezifischer fluoreszierender Primer und reverser Transkriptase reverse transkribiert, was zu CD-NA-Fragmenten führt.

Dann werden DNA oder Plasmide aus den Bakterienzellen isoliert und mit einem Sequenzierungskit eine fluoreszierende Sanger-Sequenzierungsleiter aus dem DNA-Template erstellt. Schließlich werden die CDNA-Fragmente und Sequenzierungsleitern getrennt und gleichzeitig mit einem automatisierten Gelsequenzierer auf einem Polyacrylamid-Gel detektiert und miteinander verglichen. Letztendlich wird die Fluoreszenz-Primer-Verlängerung verwendet, um die fünf Primzahlen von RNA-Molekülen mit einer Auflösung von einer Base abzubilden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der rassen- oder radioaktivitätsbasierten Primärerweiterung, ist die schnelle Identifizierung der fünf Enden von RNA-Molekülen, da der Nachweis gleichzeitig während der Elektrophorese erfolgt. Die Sensitivität ist ähnlich wie bei primären Erweiterungen auf roter Aktivität, ermöglicht es dem Laborpersonal jedoch, diese Methode zu verwenden, ohne dass eine Schulung zum Strahlenschutz bei der Geschwindigkeitsaktivität erforderlich ist. Wir haben diese fluoreszierende primäre Verlängerungstechnik erfolgreich eingesetzt, um die RNAs-Komponenten von Toxin-Antitoxin-Systemen zu untersuchen.

Staphylokokken, die das Verfahren demonstrieren, wird von Christopher Schuster, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie eine hohe RNA-Ausbeute vorbereitet und die Primer gemäß dem Textprotokoll entworfen haben, führen Sie die Primerverlängerungsreaktion durch, indem Sie zuerst den Thermocycler auf 95 Grad Celsius vorheizen. Mischen Sie für jede RNA-Probe die folgenden Verbindungen in ein PCR-Röhrchen, denaturieren Sie die Proben eine Minute lang bei 95 Grad Celsius.

Legen Sie dann die Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, um die Primer und die RNA zu hybridisieren. Stellen Sie als Nächstes das PCR-Gerät auf 47 Grad Celsius ein. Bereiten Sie dann den reversen Transkriptions-Mastermix vor, wie hier beschrieben.

Fügen Sie jeder hybridisierten RNA-Probe vier Mikroliter und einen reversen Transkriptions-Mastermix hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 47 Grad Celsius. Um die Reaktion zu stoppen, erhitzen Sie die Proben zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Dann sechs Mikroliter Formamid-Ladefarbstoff zugeben und über Nacht oder bis zu zwei Wochen im Dunkeln bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Nach der Herstellung der genomischen DNA oder Plasmide gemäß dem Textprotokoll wird die Sanger-Sequenzierungsreaktion zusammengesetzt, indem 12 Mikroliter von etwa 10 bis 15 Mikrogramm genomischer DNA oder 100 bis 500 Nanogramm Plasmid-DNA mit einem Mikroliter fluoreszenzmarkiertem Primer und einem Mikroliter DMSO-Pipette gemischt werden. Ein Mikroliter jeder Sequenzierung wird in separate, vormarkierte PCR-Röhrchen gemischt. Geben Sie dann drei Mikroliter der Grundierungsmischung D-N-A-D-M-S-O in jede Tube.

Stellen Sie das PCR-Gerät auf das folgende Programm ein und führen Sie es aus, nachdem Sie die Proben in das Gerät eingelegt haben. Geben Sie nach dem Lauf sechs Mikroliter Ladefarbe zu den Proben und dann auf Eis. Bei sofortiger Verwendung oder bei minus 20 Grad Celsius über Dauer mit sauberen, staubfreien 25 Zentimeter Platten platzieren Sie 0,25 Millimeter Abstandshalter auf der hinteren Glasplatte und senken Sie die gekerbte Glasplatte oben ab, wobei das gekerbte Ende der Glasplatten und die Schieneneinführungspiloten beide nach oben zeigen.

Befestigen Sie die Gelschienen an beiden Seiten der Glasplatten und ziehen Sie die Knöpfe leicht fest, um das Gel zu gießen. Die hier aufgeführten Verbindungen in einem Becherglas mit einem Rührstab vermischen und auf eine magnetische Rührplatte geben. Unmittelbar nach der Zugabe eines PS und dem Teamieren verwenden Sie eine 50-Milliliter-Spritze, um die Acrylamidlösung aufzunehmen, und platzieren Sie einen 0,45-Nanometer-Filter auf der Spitze.

Legen Sie die Sandwichplatten in einem Winkel von 10 bis 20 Grad und geben Sie die Gellösung langsam zwischen den Glasplatten ab, während Sie die Spritzenspitze kontinuierlich von einer Seite zur anderen bewegen. Beenden Sie die Abgabe der Gellösung, sobald sie auf das untere Ende der Glasplatten trifft. Entferne mit einem Seifenblasenhaken eventuell gebildete Blasen.

Schieben Sie dann den Abstandshalter der Geltasche zwischen die Glasplatten am gekerbten Ende, tauchen Sie ihn in die Gellösung ein und fixieren Sie ihn, indem Sie die Gießplatte anbringen, ziehen Sie die Schrauben der oberen Schiene leicht fest und lassen Sie das Gel ein bis zwei Stunden lang aushärten. Bevor Sie die Gießplatte und den Taschenabstandshalter entfernen, verwenden Sie destilliertes entionisiertes Wasser, um die Tasche von Salz- und Gelrückständen zu reinigen, um das Gel laufen zu lassen. Schieben Sie den Pufferbehälterhalter in die Gelschienen an den vorderen Glasplatten und ziehen Sie die Knöpfe fest.

Legen Sie das Gel in den unteren Geltank des automatisierten Gel-Imagers gegen die Heizplatte und fixieren Sie es, indem Sie den Schieneneinführungspiloten in die Gerätehalterungen schieben. Verwenden Sie einen XTBE-Puffer, um die oberen und unteren Gelpufferkammern zu füllen. Schließen Sie dann die untere Pufferkammer und verwenden Sie das Netzkabel, um die obere Pufferkammer an die Stromversorgung anzuschließen.

Wenn Salz in der Geltasche vorhanden ist, pipettieren Sie mit Puffer wiederholt in die Tasche, um sie zu reinigen. Verwenden Sie dann den oberen Pufferdeckel, um die obere Puffertankkammer zu schließen. Nachdem Sie den Imager und den Computer eingeschaltet und die IR-Datenerfassungssoftware für das Basisbild gemäß dem Textprotokoll gestartet haben, verwenden Sie die hier aufgeführten Einstellungen, um die Scannersteuerung einzurichten.

Führen Sie anschließend das leere Gel 20 Minuten lang vor, indem Sie die Spannung ein wählen und die Eingabetaste drücken. In der Zwischenzeit erhitzen Sie die Sequenzierleiter und die Primerverlängerungsprodukte mit einem PCR-Gerät zwei Minuten lang auf 90 Grad Celsius. Bevor Sie auf Eis abkühlen, stoppen Sie die Elektrophorese, öffnen Sie den automatisierten Gelsequenzierer und entfernen Sie den oberen Deckel des Puffertanks. Führen Sie dann den Haifischzahnkamm zwischen die Glasplatten und mit den Haifischzähnen ein.

Durchstechen Sie die Gelpipette leicht und stechen Sie ein bis zwei Mikroliter der Primer-Verlängerungsprodukte oder Sequenzierungsleiterreaktionen in jede Geltasche. Für leere Taschen. Verwenden Sie Ladefarbe, um ein inkonsistentes Laufverhalten zu vermeiden, schließen Sie den Puffertank und die Tür des Gelsequenzers.

Starten Sie dann die Elektrophorese, indem Sie für den Laser die Spannung einwählen, den Scanstatus ein wählen und die Eingabetaste drücken. Sobald der interessierende Bereich den Laser passiert hat, stoppen Sie die Elektrophorese, wie hier gezeigt. Eine Primer-Verlängerungsreaktion kann verwendet werden, um die transkriptionellen Startpunkte oder TSP von Transkripten von Interesse zu bestimmen und kann helfen, Promotorregionen abzuleiten.

In diesem Beispiel wurde der TSP der MPE-mRNA als G identifiziert, was mit früheren veröffentlichten Daten übereinstimmt. Die Promotorelemente minus 35 und minus 10 wurden als T-T-G-T-A-A und T-A-G-A-C-T abgeleitet, und diese Motive unterscheiden sich nur zu Basen aus jeder ihrer Konsensussequenzen, wobei eine Primerverlängerung zur Identifizierung von mRNA-Spaltprodukten verwendet wird. Die RNA-Kartierung der Spaltung in der Nähe des START-Codes durch die RNA Ybi SEC two ist hier dargestellt, wenn die RNAs nicht vorhanden oder inaktiv sind, es werden keine Primer-Verlängerungsprodukte in der Nähe des Start-Co-ons als Ergebnis der RNA-Aktivität gebildet.

In dieser Abbildung sind jedoch zwei starke Banden direkt hinter der Startschicht zu sehen. Diese Abbildung zeigt ein fehlgeschlagenes Primer-Verlängerungsexperiment aufgrund von überschüssiger RNA in der reversen Transkriptionsreaktion, die die Identifizierung einzelner Banden verhindert. Dies zeigt, dass die Gesamtmenge der Template-RNA an die Häufigkeit der interessierenden RNA angepasst werden muss. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie transkriptionelle Ausgangspunkte und RNA-Spaltstellen in vivo mit fluoreszierenden Primern und einem automatisierten Gelsequenzierer mit etwas Übung aufklären können.

Diese Methode ist schnell und einfach durchzuführen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.