Name: Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Lernen Sie die Proximity Ligation Assay zur Detektion von Protein-Protein-Komplexen an der neuromuskulären Junction von Drosophila-Larven. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung endogener Proteininteraktionen in situ.

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Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung von Flug Aktien. Wir danken auch den Entwicklungs Studies Hybridoma Bank und Dr. Lynn Cooley (Yale University) für die Bereitstellung von Antikörpern. Ein besonderer Dank geht an AhHyun Yoo für ihre Hilfe zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (Krieger), die William und Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) und der kanadischen Institutes of Health Research (Harden) unterstützt.

1. Körper Wand Vorbereitung HINWEIS: Herstellung der dritten Larvenlarvenkörperwände (zum Studium der NMJs die die Körperwand Muskeln innervieren) wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 10 oder Ramachandran und Budnik 11,12 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen.. <ol><li> Präparation <ol><li> Heben fly Aktien und Kreuzen bei 25 ° C für fünf bis sechs Tage nach Standardverfahren 13. </li><li> Wählen Sie kriechen dritten Larvenstadium von Fläschchen oder Flaschen mit feinen Pinzette. </li><li> Der Larven in eine kleine Petrischale gegeben, die Phosphatpuffer-Saline (PBS), um Essensreste zu entfernen waschen. </li><li> Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard Scheibe und tauchen Sie es in ein paar Tropfen eiskaltem PBS. Mit eiskaltem PBS wird dazu beitragen, zu betäuben die Larve dass es leichter zu manipulieren. Während der gesamten Präparation zu gewährleisten, dass das Präparat immer in PBS eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Positionieren Sie den larva mit seiner Rückenseite nach oben, so dass die beiden Luftröhrenwege unter einem Präpariermikroskop (2A) sichtbar sind. Mit der Pinzette eine minutien Stift zu greifen, Pin die Larve sich am hinteren Ende in der Nähe der Luftlöcher (2B). Mit einem anderen Stift, durchbohren durch die Kutikula am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken. Sanft dehnen die Larve der Länge nach, dann stecken Sie es nach unten (2B). </li><li> Mit Mikrodissektion Schere, klemmen Sie das hintere Ende in der Nähe des Stiftes, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Der Schnitt sollte oberflächlich genug, nur durch die Kutikula passieren. </li><li> Dass sich die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Einschnitt entlang der gesamten Länge der Rückenmittellinie zwischen den beiden Luftröhrenbahnen (2C) zu schneiden. Richten Sie die Scherenblätter leicht nach oben beim Schneiden um eine Beschädigung der ventralen Körperwand Muskeln. </li><li> Machen Sie eine kleine horizontaler Schnitt leicht anterioren zur Posteriorly platzierten Stift (2C). Stellen Sie einen anderen ähnlichen Schnitt etwas nach vorne platzierten Stift (2C) posterior. Die Schnitte sollten nur durch die Kutikula weiterzugeben. HINWEIS: Die drei Schnitte aus den Schritten 1.1.7 und 1.1.8 in Kombination sollte ein ähnlich " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> "Wenn sie abgeschlossen sind, das heißt, eine linke und rechte Klappe auf der dorsalen Seite der Larvenkörper hergestellt werden soll. </li><li> Sorgfältig reinigen, die inneren Organe mit der Zange. Hinzufügen von ein paar kräftigen Tropfen PBS helfen verdrängen die Organe aus dem Larvenkörper, wodurch es einfacher, sie zu entfernen. Vermeiden Sie stoßen die Larven Körper, wie es zu Schäden an der Körperwand Muskeln führen. </li><li> Rollen Sie das Larvenkörpers offen und stecken Sie die Ecken nach unten (2D). Wenn Pinning, strecken den Körper Wand horizontal und vertikal, um eine gleichmäßige spannte Rechteck bilden (see 2G für die Form), kümmert sich nicht um die Körperwand Muskeln in den Prozess zu reißen. </li><li> Beenden Sie entfernen alle verbleibenden inneren Organe (2E). </li></ol></li><li> Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Tauchen Sie die fixierten Körperwände in mehrere Tropfen Bouin-Lösung. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Alternativ können Sie auch 4% Paraformaldehyd (PFA) als Alternative Haarfestiger; Inkubation 30 Min. </li><li> Dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Triton (PBT) zu spülen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Stifte zu entfernen und die Körperwände durch ihre Ecken in eine silikonisierte 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bewahren Sie die Körperwände in PBT bei 4 ° C, bis sie für PLA. Für optimale Ergebnisse, starten Sie eine Immunfärbung der Körperwände innerhalb eines Tages oder zwei der Dissektion. ANMERKUNG: Um auf Reagenzien zu sparen und um sicherzustellen, daß alle Körperwände gleichmäßig während des Assays behandelt wird, kann unterschiedlichen Genotypen in einer einzigen gelegt werdenRohr. Genotypen können durch Abschneiden der Ecken der Körperwände unterschiedlich (siehe 2F für Beispiele) unterschieden werden. </li></ol></li></ol> 2. Immunhistochemie HINWEIS: Immunfärbung von dritten Larvenlarvenkörperwänden wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 14 und Ramachandran und Budnik 11 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen 11,14.. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Blockierung <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Die Körperwände mit Mäusen und Kaninchen primären Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (in 1% BSA verdünnt). In diesem Fall verwenden 1.10 Maus-Anti-Dlg und 1: 250 Kaninchen einnti-HtsM 15,16. Antikörper gegen Marker, die nicht in der Maus oder Kaninchen hergestellt werden, können ebenfalls enthalten sein - zB Verwenden von 1: 200 Ziege-Anti-HRP, um die neuronalen Membranen abzugrenzen. </li><li> Für jede 10 Minuten abwaschen mit PBT dreimal. </li><li> Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, die Markierungen (in 1% BSA verdünnt) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C zu erkennen. Als die PLA-Signal wird später mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht, muss ein anderer Fluorophore verwendet werden, um den Marker zu erfassen - zB verwenden 1: 200 FITC-konjugiertem Anti-Ziege, die Ziege-Anti-Hrp Antikörper nachzuweisen. Durch die Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien, halten die Rohre in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt. HINWEIS: Der Kit, der verwendet wird, ermöglicht die PLA zwischen primären Antikörpern in Mäusen und Kaninchen durchgeführt werden, erhöht, wobei das Signal auf dem roten Kanal unter konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Auf Wunsch sind weitere Kits zur Verfügung, die der Test mit prima durchgeführt werden könnenry Antikörper in anderen Spezies gezüchtet, und das Signal auf anderen Kanälen sichtbar gemacht. </li></ol></li></ol> 3. Proximity Ligation Assay HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> PLA Probes <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Inkubieren mit PLA-Sonden (1: 5-Verdünnung jeder in 1% BSA) für 2 Stunden bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 40 ul der PLA-Sonde-anti-Maus MINUS 40 ul PLA-Sonde-anti-Kaninchen PLUS und 120 ul 1% BSA, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. Bis zu einer 1:25 Verdünnung der PLA-Sonden können weiterhin in einer ausreichenden Signal-zu-Rausch-Verhältnis (dh bei diesem Experiment) führen. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 5 Minuten jeweils zweimal waschen. </li><li> Inkubation mit Ligation-Lösung (1.40 Verdünnung Ligase in Ligationspuffer) für 1 Stunde eint 37 ° C. In diesem Fall arbeitet man mit 5 ul Ligase, 40 ul 5 Ligationspuffer und 155 &amp; mgr; l von hochreinem Wasser, um das richtige Eintauchen und das Vermischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Verstärkung <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 2 min je zweimal waschen. </li><li> Inkubieren mit Verstärkungslösung (1:80 Verdünnung von Polymerase in Amplifikationspuffer) für 2 h bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 2,5 ul Polymerase, 40 ul 5 Verstärkung Puffer und 157,5 ul von hochreinem Wasser, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände gewährleisten. </li></ol></li><li> Vorbereitung für Imaging <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer B 10 min je zweimal waschen. </li><li> Mit 0,01x Waschpuffer B einmal für 1 min waschen. </li><li> Äquilibrieren in einigen Tropfen Befestigungslösung für mindestens 30 min vor der Montage, oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Körperwände übertragen auf eine Plattform Schiebe with ihre Nagelhaut nach unten. Positionieren der Körperwände in Reihen und in der gleichen Orientierung in ein oder zwei Tropfen mountant. Legen Sie eine 22 mm x 40 mm Deckglas über die Zubereitung dabei nicht um Luftblasen zu erzeugen, dann verschließen Sie die Folie mit klarem Nagellack. </li><li> Bewahren Sie die Folien im Dunkeln bei -20 ° C, bis sie zur konfokalen Abbildung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Bericht zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ angewendet werden. Der Test basiert auf Larvenkörper Wandmuskulatur, die zum Zwecke des Erfassens endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen an der NMJ vorliegenden geführt. Mit dieser Technik und dlg Hts sind gezeigt, um in enger Nähe zueinander sind, und somit in einem Komplex vorhanden sind, und zwar an der postsynaptischen Bereich 27. Zur Unterstützung dieses Ergebnis hat eine frühere Studie Beweise ihrer Verbindung mit den folgenden Da...

Drosophila Discs groß (DLG) ist ein konserviertes Mitglied der membranassoziierten Guanylatkinase Familie von Gerüsten Proteine ​​dirigieren die Montage von großen Proteinkomplexen an spezifischen Stellen der Plasmamembran beitragen. Ursprünglich identifiziert als ein Tumorsuppressor-Protein dient Dlg einer wichtigen Determinante der epithelialen apicobasal Polarität 1,2,3. Dlg dient auch als eine Hauptgerüstmoduls an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der glutamatergen Motoneuronen im Larvenentwicklung 4. Dlg spielt verschiedene Rollen bei der Larven NMJ und seine Polyphänie beruht auf seiner Fähigkeit, mit mehreren Proteinen 5,6 assoziieren. Ein solches Protein ist Hu-li tai Shao (HTS), ein Homolog zu den Säuger adducins, die hauptsächlich in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulation des Actin-Zytoskeletts Spektrin 7 beschrieben. Es wurde zuvor gezeigt, dass dlg Hts einen Komplex miteinander anhand von in vitro zu bilden </em&gt; Co-Immunopräzipitation Experimente, die gesamte erwachsene Fliege Lysate 8. Ein Nachteil dieser Ergebnisse ist jedoch, dass sie nicht anzeigen, wo diese komplexen Formen. Mit der Verwendung von Immunhistochemie, werden die Verteilungen und dlg Hts beobachtet, an der postsynaptischen Membran der Larven NMJs lappen, aber sie sind in einem Komplex in diesem Bereich 8? Wie kürzlich gezeigt und weiter hier beschrieben wird Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden, um für eine in situ-Verbindung zwischen Dlg und Hts speziell auf die Larven NMJ 27 aussehen. PLA ist eine relativ neue Technik, vor allem in der Zell- und Gewebekultur, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ 9 erkennen kann. In diesem Assay werden primäre Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse mit einem Paar von artspezifischen sekundären Antikörper nachgewiesen, genannt PLA-Sonden, die an Oligonucleotide konjugiert sind (1A, B). Wenn die zwei Proteins sind in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (dh innerhalb von wenigen zehn Nanometern), wobei der Abstand zwischen den angebrachten PLA Sonden können durch Hybridisierung von zwei zusätzlichen Anschluß Oligonukleotide (1C) überbrückt werden. In dieser Konformation sind die freien Enden der Stecker Oligonukleotide nahe genug, um einen Kontakt miteinander herzustellen, und einer geschlossenen, ringförmigen DNA-Molekül kann auf in situ-Ligation (1D) ausgebildet werden. Die kreisförmige DNA-Molekül als Matrize für die in situ Wälzkreis Verstärkung, die durch eines der Oligonukleotide an die PLA-Sonden (1E) konjugiert grundiert wird. Sequenzen innerhalb der resultierenden amplifizierten, konkatemeren DNA-Produkt kann dann mit fluoreszenzmarkierten, komplementär Oligonukleotidsonden (1F) visualisiert werden. Da die amplifizierte DNA bleibt an einer der PLA-Sonden, die subzelluläre Lokalisierung des Protein-Protein-Wechselwirkung withi befestigtna Gewebe kann leicht festgestellt werden. Mehrere Verfahren sind häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen, einschließlich In-vitro-Verfahren, wie Co-Immunopräzipitation, Pulldown-Assays und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, und in-vivo-Techniken, wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) und Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ( BIFC). Ein Problem der in-vitro-Techniken ist, dass sie nicht erkennen, wo die Wechselwirkung endogen vorkommenden, während die zuvor erwähnten in vivo Techniken beinhalten die künstliche Expression von Fusionsproteinen, die das native Verhalten ihrer endogenen Gegen nicht reflektieren kann. Ein wesentlicher Vorteil der PLA ist, dass es in der Lage die Bestimmung innerhalb eines Gewebes die subzelluläre Lokalisation des endogenen Protein-Interaktoren, die in unmittelbarer Nähe zueinander sind, und wahrscheinlich ein Komplex gebildet ist, mit dem Näherungsgrad erforderlich, um ein Signal, das vergleichbar FR erzeugenET und BIFC. PLA kann Wechselwirkungen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit aufgrund der Kopplung der Antikörpererkennung und die DNA-Amplifikation nachzuweisen. So kann der Assay diskreten strahlend Signale in Form Pünktchen, die die exakte Position der Wechselwirkung offenbaren erzeugen. Außerdem kann kaum sichtbar Antigene nachgewiesen werden. Schließlich ist PLA eine relativ einfache Technik, um durchzuführen, und es nimmt nicht mehr als eine Standard-immunhistochemischen Verfahren abzuschließen. Daher stellt PLA einen technischen Vorteil gegenüber anderen Protein-Protein-Interaktionsassays, die oft mit langen Vorbereitungszeiten und umfangreiche Fehlersuche ein Problem dar. Dieses Protokoll zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ zwecks Erfassen endogenes Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ aufgebracht werden. Hier wird PLA auf Larvenkörperwand Muskel Zubereitungen, für Dlg und Hts erweisen sich in der Tat in einer Anlage sind im postsynaptischen Region NMJs geführt. PLA wurde zuvor nicht verwendet werden, um die Larven NMJ untersuchen, und es gibt derzeit nur eine Handvoll von publizierten Arbeiten, das diesen Assay in Drosophila Gewebe verwendet wurden. Es ist zu hoffen, daß eine weitere Belichtung der PLA zu dem Drosophila-Gemeinschaft wird der erhöhten Verwendung als zusätzliches Werkzeug führen zu anderen, üblicherweise verwendeten Protein-Protein Interaktionsassays ergänzen.

<table><tbody><tr><td>Pinzette (fein #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Mischen Sie Elastomerbasis und Härter im Verhältnis 10:1. Auf 30 Min. einstellen. In eine Form gießen (z.B. eine 12-Well-Zellkulturplatte verwenden). Mindestens 24 Stunden aushärten lassen. Kleben Sie beim Präparieren auf den Deckel eines 60 x 15 mm großen Petrischalendeckels.</td></tr><tr><td>Minutien Pins (0.0125&nbsp; mm Spitzendurchmesser)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere (ultrafein)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Platform Slides</td><td></td><td></td><td>Kleben Sie zwei Deckgläser 22 x 22 mm2 mit klarem Nagellack auf einen Objektträger, wobei Sie ein < 20 mm Abstand dazwischen für die Probenmontage.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>Der Bestand wurde über einen GFP-Balancer neu ausbalanciert, so dass homozygote Mutanten basierend auf dem Fehlen eines GFP-Signals ausgewählt werden können.</td></tr><tr><td>1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7,0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldehyd): 4% PFA in 1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (Anachemia Science - 66194-300). Siehe doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 für Anweisungen zur Herstellung der Lösung.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Triton): 1x PBS mit 0,01% Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (Rinderserumalbumin): 1% BSA in 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Dlg (Scheiben groß)</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>4F3</td><td>Anwendung in einer Verdünnung von 1:10 in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Lynn Cooley (Yale University). In einer Verdünnung von 1:250 in 1% BSA verwenden.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Pak (p21-aktivierte Kinase)</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). In einer Verdünnung von 1:500 in 1% BSA verwenden.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Wg (Wingless)</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>4D4</td><td>Anwendung in einer Verdünnung von 1:5 in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Anti-Hrp (Meerrettichperoxidase) für Ziegen.Jackson</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>In einer Verdünnung von 1:200 in 1 % BSA verwenden.</td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Esel Anti-Ziege</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>In einer Verdünnung von 1:200 in 1% BSA verwenden.</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Maus MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Detektionsreagenzien Rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Waschpuffer A: 0,01&nbsp; M Tris, 0,15&nbsp; M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Waschpuffer B: 0,2&nbsp; M Tris, 0,1&nbsp; M NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0,01x Waschpuffer B: 2&nbsp; mM Tris, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Duolink In-situ-Einbettmedium mit DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

detektion in-situ- protein-protein-komplexe bei der drosophila larven neuromuskuläre junction mit proximity ligation assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) ist ein konserviertes Mitglied der membranassoziierten Guanylatkinase-Familie und dient als Hauptgerüstprotein an der larvalen neuromuskulären Verbindung (NMJ) in Drosophila. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich die postsynaptische Verteilung von Dlg an der Larve NMJ mit der von Hu-li tai shao (Hts), einem Homolog zu den Säugetieradducinen, überschneidet. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Dlg und Hts einen Komplex miteinander bilden, basierend auf Co-Immunpräzipitationsexperimenten mit ganzen adulten Fliegenlysaten. Aufgrund der Art dieser Experimente war jedoch nicht bekannt, ob dieser Komplex spezifisch am NMJ während der Larvenentwicklung existiert.
Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine kürzlich entwickelte Technik, die hauptsächlich in Zell- und Gewebekulturen eingesetzt wird und Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ nachweisen kann. In diesem Assay werden Proben mit primären Antikörpern gegen die beiden interessierenden Proteine unter Verwendung immunhistochemischer Standardverfahren inkubiert. Die primären Antikörper werden dann mit einem speziell entwickelten Paar von Oligonukleotid-konjugierten Sekundärantikörpern, den sogenannten PLA-Sonden, nachgewiesen, die nur dann zur Signalerzeugung verwendet werden können, wenn die beiden Sonden in unmittelbarer Nähe zueinander gebunden haben. So können Proteine, die sich in einem Komplex befinden, sichtbar gemacht werden. Hier wird gezeigt, wie PLA verwendet werden kann, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila-Larve NMJ zu detektieren. Die Technik wird an Muskelpräparaten der Larven durchgeführt, um zu zeigen, dass ein Komplex zwischen Dlg und Hts tatsächlich in der postsynaptischen Region von NMJs existiert.

In Wildtyp dritten Larvenlarven NMJs wird Dlg überwiegend an der postsynaptischen Membran des Typs I glutamatergen Boutons gefunden, mit Dlg Immunreaktivität Ebenen sein ausgeprägter Typ Ib boutons als Typ Ist boutons (3A) 4. Hts ist im gesamten Muskel vorhanden, aber konzentriert sich an der postsynaptischen Region Hts Immunreaktivität Ebenen sowohl Typ I boutons gleich erscheinen und wird auch präsynaptisch gefunden (3A ') 8,17. Beachten Sie, dass die Verteilunge...

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die subzelluläre Lokalisation endogener Proteinprotein-Wechselwirkungen am Drosophila-Larven-NMJ zu detektieren. Dies wird durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Paares von Oligonukleotid-konjugierten Sekundärantikörpern, den sogenannten PLA-Sonden, erreicht, die an die primären Antikörper gegen die beiden interessierenden Proteine binden. Als nächstes wird die Lücke zwischen den PLA-Sonden durch Hybridisierung der beiden Konnektor-Oligonukleotide überbrückt.Erst wenn sich die beiden Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander befinden und bei der in situ Ligation ein geschlossenes zirkuläres DNA-Molekül gebildet wird, wird eine in situ Rollkreisamplifikation durchgeführt, um Sequenzen innerhalb des geschlossenen zirkulären DNA-Moleküls zu amplifizieren, die anschließend mit komplementären fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden nachgewiesen werden. Das resultierende Fluoreszenzsignal, das von jedem Amplifikationsprodukt erzeugt wird, ist daher bei der Betrachtung mit konfokaler Mikroskopie leicht als deutlicher heller Fleck sichtbar. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z.B. E two Hybrid-Ausfällung und Bedrohung, besteht also darin, dass PLA in der Lage ist, innerhalb des Gewebes die subzelluläre Lokalisation von endogenen Proteinen zu detektieren, die in unmittelbarer Nähe zueinander lokalisiert sind und wahrscheinlich einen Komplex bilden.Diese Methode gibt jedoch Einblick in die Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke, die spezifisch an de larva und mj auftreten. Es kann auch auf andere jolo-Systeme angewendet werden. Schlagen Sie das Epithelgewebe in Embryonen und Imaginalscheiben vor.Das Verfahren wird von hel yu und Ha king, zwei Technikern aus unserem Labor, vorgeführt. Nachdem Sie Drosophila-Kulturen fünf bis sechs Tage lang bei 25 Grad Celsius inkubiert haben, nehmen Sie mit einer feinen Pinzette kriechende Larven des dritten Stadiums aus den Fläschchen oder Flaschen, um die Larven zu waschen. Übertragen Sie sie in eine kleine Petrischale, die PBS enthält.Legen Sie dann eine der gewaschenen Larven in eine S-Zigarrenscheibe und tauchen Sie sie in mehrere Tropfen eiskaltes PBS, um sie zu verkümmern und so die Handhabung zu erleichtern. Positionieren Sie die Larven mit der Rückenseite nach oben, so dass die beiden Trachealspuren unter einem Präpariermikroskop sichtbar sind. Fassen Sie dann mit der Pinzette eine Mnuchin-Nadel, stecken Sie die Larven am hinteren Ende in der Nähe der Spiralen fest, mit einer weiteren Nadel stechen Sie durch die Nagelhaut am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken und dehnen Sie die Larven vorsichtig in Längsrichtung, bevor Sie sie feststecken.Als nächstes kneifen Sie mit einer Mikrodissektion das hintere Ende in der Nähe der Nadel ein, um eine kleine Öffnung zu schaffen, der Schnitt sollte oberflächlich genug sein, um gerade durch die Nagelhaut zu gehen. Platzieren Sie dann die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Schnitt und schneiden Sie entlang der gesamten Länge der dorsalen Mittellinie zwischen den beiden Trachealbahnen, während Sie die Scherenklingen leicht nach oben richten, um eine Beschädigung der darunter liegenden Muskeln zu vermeiden. Machen Sie nun einen kleinen horizontalen Schnitt direkt durch die Nagelhaut, etwas vor dem posterior platzierten Stift.Machen Sie dann einen weiteren ähnlichen Schnitt etwas hinter dem anterior platzierten Stift. Nachdem Sie dem Larvenkörper ein paar kräftige Tropfen PBS gegeben haben, verwenden Sie die Pinzette, um die inneren Organe vorsichtig zu reinigen. Vermeiden Sie es, in den Larvenkörper zu stechen, da dies den Körper schädigen kann.Die Wandmuskulatur entfaltet den Larvenkörper und um die Ecken festzustecken, dehnen Sie die Körperwand sowohl horizontal als auch vertikal, um ein gleichmäßig gespanntes Rechteck zu bilden. Darauf achten, dass die Muskeln der Körperwand dabei nicht reißen, um das Gewebe zu fixieren. Tauchen Sie die festgesteckten Körperwände in mehrere Tropfen Boan-Lösung und inkubieren Sie sie nach der Fixierung 15 Minuten lang auf Eis.Verwenden Sie PBT, um das Tuch dreimal zu spülen. Dann, um Reagenzien zu sparen und sicherzustellen, dass alle Körperwände während des Assays gleich behandelt werden. Schneiden Sie die Ecken jedes Genotyps unterschiedlich ab, um sie zu unterscheiden.Und nachdem Sie die Stifte mit einer feinen Pinzette entfernt haben, legen Sie sie alle in dasselbe silikonisierte 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um das Gewebe zu durchdringen, verwenden Sie PBT, um die Körperwände dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche 1 % BSA hinzufügen, um die Proben zu blockieren, und eine Stunde lang inkubieren.Neben der Immunfärbung fügen die Körperwände Maus- und Kaninchen-Primärantikörper gegen die beiden interessierenden Proteine hinzu und inkubieren zwei Stunden lang. In diesem Fall wird ein bis 10 Maus Anti DLG und ein bis 250 Kaninchen Anti HTS in 1% BSA verwendet. Antikörper gegen Marker können auch nach der Inkubation hinzugefügt werden.Waschen Sie die Körperwände mit PBT dreimal für jeweils 10 Minuten. Fügen Sie dann mit Fluor vier markierte Sekundärantikörper gegen beliebige Marker in 1 %BSA hinzu und inkubieren Sie am nächsten Morgen über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Körperwände mit PBT dreimal für jeweils 10 Minuten.Der Assay beginnt mit einer Verdünnung von ein bis fünf in mindestens 200 Mikrolitern. Das Gesamtvolumen der PLA-Sonde, der Anti-Maus-Minus- und der PLA-Sonde Anti-Kaninchen-Plus in 1 % BSA zu den Körperwänden inkubiert zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, nachdem der Waschpuffer A verwendet wurde, um die Körperwände zweimal für jeweils fünf Minuten bei einer Verdünnung von Ligase in Ligase-Lösung von eins bis 40 zu waschen, Nach der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie Waschpuffer A, um die Körperwände zweimal für jeweils zwei Minuten zu waschen, bevor Sie eine Verdünnung von Polymerase von eins bis 80 in die Amplifikationslösung hinzufügen.Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Proben für die Bildgebung vorzubereiten. Waschen Sie die Körperwände mit Waschpuffer B zweimal für jeweils 10 Minuten. Verwenden Sie dann eine 100-fache Verdünnung des Waschpuffers B, um eine Minute lang eine letzte Wäsche durchzuführen.Äquilibrieren Sie die Körperwände in einigen Tropfen Einbettlösung für mindestens 30 Minuten mit einer feinen Pinzette. Übertragen Sie die Körperwände vorsichtig mit dem Nagelhautabstand nach unten auf eine Plattformrutsche. Positionieren Sie sie in Reihen in der gleichen Ausrichtung innerhalb von ein oder zwei Tropfen Montagelösung.Legen Sie einen 22 Millimeter x 40 Millimeter großen Deckglas über das Präparat und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen. Verwenden Sie dann Klarlack, um die Folie zu versiegeln. Lagern Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die konfokale Bildgebung bereit sind.Wie hier in Wildtyp-Larven njs gezeigt, findet sich DLG überwiegend an der postsynaptischen Membran von glutamatergen Bhuton vom Typ eins, wobei die Spiegel bei Typ 1 B stärker ausgeprägt sind als bei Typ 1 S bs HTS ist im gesamten Muskel zu finden, konzentriert sich jedoch an der postsynaptischen Membran, wobei die Spiegel sowohl bei Typ 1 Bhuton gleich sind, DLG und HTS überlappen sich weitgehend in der postsynaptischen Region, um festzustellen, ob DLG und HTS in einem Komplex existieren. An der N-M-J-P-L-A wurde eine A-Injektion mit Anti-DLG- und Anti-HTS-Antikörpern durchgeführt, wie hier zu sehen. Das PLA-Signal zwischen den beiden Proteinen wird spezifisch am Wildtyp-NMJ beobachtet, das Signal lokalisiert meist zirkumferentiell an der präsynaptischen Membran, die durch HRP markiert ist.DLG und HTS befinden sich also in unmittelbarer Nähe und bilden wahrscheinlich einen Komplex in der postsynaptischen Region. Das Ergebnis ist spezifisch als Negativkontrolle mit HTS-Mutanten, die fehlen. Die HTS-Immunreaktivität zeigt kein beobachtbares PLA-Signal, Ansichten mit hoher Vergrößerung des bns zeigen, dass sich DLG und HTS-Immunreaktivität an der postsynaptischen Membran stark überlappen.Im Gegensatz dazu führt PLA zwischen den beiden Proteinen zu diskreten PUNCTA, was darauf hinweist, dass nur eine Teilmenge der gesamten DLG- und HTS-Proteine nach der Beherrschung komplex ist. Diese Technik dauert nicht länger als ein immunhistochemisches Standardverfahren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie PLA verwendet wird, um die subzelluläre Lokalisation endogener Proteinproteininteraktionen zu erkennen, die am NMJ der Larve auftreten.

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

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Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

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Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

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Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

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In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

DetectSyn: Eine schnelle, unvoreingenommene fluoreszierende Methode zur Erkennung von Änderungen der Synapsendichte

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Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

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Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

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