Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Das Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Veränderungen der Zellmorphologie und die subzelluläre Lokalisierung spezifischer Proteine von Interesse in einer großen Anzahl von Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus schnell und automatisch zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die T-Zellen mit den für sie interessanten Chemo-Arten stimuliert werden. Im zweiten Schritt werden die Zellen fluoreszenzmarkiert und anschließend mittels bildgebender Durchflusszytometrie analysiert.

Im letzten Schritt können die Anzahl der morphologisch polarisierten Lymphozyten und der Grad der Segregation der Fluoreszenzmarker anhand der Lage und der Intensität der Pixel für jede Färbung in Abhängigkeit von der gewählten Maske bewertet werden. Letztendlich kann diese bildgebende Durchflusszytometrie-Technologie verwendet werden, um die morphologischen Veränderungen von Lymphozyten nach der Chemokinstimulation sowie die Position spezifischer Proteine von Interesse innerhalb der polarisierten Zellen schnell und robust zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass eine große Anzahl von Zellen wiederholt verarbeitet und automatisch analysiert werden kann, was eine statistisch starke Analyse der morphologischen Veränderungen und der Proteinverteilung gewährleistet.

Bei Chemokin-stimulierten T-Lymphozyten beginnt die Boche-artige Stimulation der T-Zellen mit dem fünfmaligen Waschen der fünf Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS, ergänzt mit 10 Millimolaren HEPs, zentrifugiert für fünf Minuten bei 340-G.At facher Raumtemperatur, entfernt das Supinat und suspendiert die Pellets erneut in 0,3 Millilitern warmem HBSS he Stück pro Röhrchen. Anschließend werden die Zellsuspensionen in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie 10 bis 500 Nanogramm pro Milliliter Chemokin in jedes Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen dann mehrmals um, um sie zu mischen.

Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Stoppen Sie nach acht bis 10 Minuten die Polarisation mit 0,3 Millilitern warmem, 2%igem Paraldehyd, ergänzt mit 10 Millimolar. Er Erbsen.

Mischen Sie dann die Röhrchen mit mehr Flipping und inkubieren Sie sie weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse zu färben. Als nächstes werden die stimulierten T-Zellen in entsprechende Durchflusszytometrie-Röhrchen überführt. Füllen Sie die Röhrchen vollständig mit Färbepuffer.

Schleudern Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern 5%igem fötalem Kälberserum in PBS. Geben Sie nun fünf Mikroliter ZI N-T-H-L-A-A-B-C in jedes Röhrchen. Wirbeln Sie sie und inkubieren Sie die Zellen am Ende der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Waschen Sie die Zellen zweimal und inkubieren Sie sie dann in 500 Mikrolitern 1%para Formaldehyd. Waschen Sie die Zellen nach 10 Minuten in mehr Färbepuffer und füllen Sie die Röhrchen dann vollständig mit Permeationspuffer. Nach zweimaligem Waschen der Zellen verließ der Puffer die Röhren, um das Supinat zu entfernen und sie dann zu wirbeln, um die Zellpellets zu dissoziieren.

Färben Sie nun die Proben mit null Punkt 25 Mikrogramm pro Milliliter, trixi für die Lende, wirbeln Sie sie und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubationszeit in Permeationspuffer. Nochmals, Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS und übertragen Sie die Zellen dann in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen, um den Prozentsatz der polarisierten T-Zellen nach der Chemokinstimulation zu bestimmen. Schalten Sie zunächst das bildgebende Durchflusszytometer ein und lassen Sie es sich gemäß den Herstellerangaben kalibrieren. Zeichnen Sie Histogramme, die die RMS-Gradientenwerte aus der fokussierten Population quantifizieren, die auf dem RMS-Gradienten ausgewählt wurde.

Histogramm: Beschreiben Sie die Einzelzellpopulation auf einem Histogramm des Bereichs, sobald das Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingeführt wurde, passen Sie den Laserleistungsgang an einzelnen Zellen an und erfassen Sie 5.000 T-Lymphozyten. In der Ideenanalyse-Software. Öffnen Sie die erfassten Dateien und erstellen Sie dann ein Histogramm, das den Gradienten-RMS-Wert für die Hellfeldbilder für jede einzelne Zelle anzeigt, indem Sie ein Gate auf die Zellen zeichnen, das einen RMS-Gradientenwert über 57 aufweist.

Erstellen Sie im Analysemenü eine neue Maske mit dem Namen "M1 zwei erodieren" aus der Morphologiemaske auf den Hellfeldbildern M null eins erodiert von zwei Pixeln. Erstellen Sie dann im Menü "Analyse-Features" ein neues Feature der Fläche, die auf der Maske "M1 zwei erodieren" berechnet wurde, aus den Zellen, die im vorherigen Gate erstellt wurden. Öffnen Sie ein Histogramm, das die Fläche der Zellen zeigt Zeichnen Sie mit dieser neu erstellten Maske ein Tor auf die einzelnen T-Zellen, wobei die Kalibrierkügelchen und Ablagerungen im kleinen Bereich sowie die Dubletten im großen Bereich ausgeschlossen sind.

Öffnen Sie dann einen Bot, der aus dem Rohmaximum auf der H-L-A-A-B-C-Färbung als Funktion des Rohmaximums auf der Phin Färbung im Menü der Analysemasken besteht, zurück zu einer neuen Maske namens Erode M zwei zwei von der Morphologiemaske der H-L-A-A-B-C Färbezellen erodiert von zwei Pixeln. Erstellen Sie dann im Menü "Analyse-Features" ein neues Feature, das aus dem Zirkularitätsparameter besteht, der auf der Erosion M zwei zwei berechnet wurde.

Erstellen Sie anschließend ein weiteres Histogramm, um die Werte des Zirkularitätsmerkmals aus den zuvor abgegrenzten Zellen zu melden. Betrachtet man dann die Form des Histogramms für die nicht stimulierten Zellen, so wird der RO-Achat für die polarisierten Zellen berechnet, beginnend mit dem niedrigsten Zirkularitätswert bis zum Zirkularitätsgrenzwert, bei dem die meisten nicht stimulierten Zellen aufgetragen werden, um die Polarisation der Aktinfärbung innerhalb der Zellen zu beurteilen. Plus ein Histogramm für die helle Detailähnlichkeit, R drei Wert zum Vergleich von H-L-A-A-B-C und Foid in der Färbung.

Dann unter Verwendung der gleichen Gating-Strategie wie gerade gezeigt, plus einem GA auf den nicht stimulierten Zellen für die nicht-co-lokalisierte segregierte Färbung. Das Statistikpanel zeigt hier den Prozentsatz der T-Zellen mit polarisierter Aktinfärbung. Es werden Beispiele für CCL 19-stimulierte T-Lymphozyten gezeigt, die in das Gate der unpolarisierten oder polarisierten Zellen fallen.

Unterschiede in der Morphologie zwischen beiden Subpopulationen sind deutlich zu erkennen. Die gerade gezeigte Gating-Strategie kann auch verwendet werden, um den Prozentsatz der Zellen zu plotten, die in Abwesenheit von CCL 19 in das polarisierte Gate fallen. Wie erwartet ist es klar, dass die Chemokinstimulation den Prozentsatz der polarisierten T-Zellen erhöht.

Der unter beiden Bedingungen erhaltene mittlere Zirkularitätsindex der gesamten Zellpopulation kann ebenfalls aufgetragen werden. In der Tat führt die CCL 19-Stimulation zu einem Abfall dieses Index. Da jedoch nur die Hälfte der Zellen polarisiert ist, ist die Änderung des mittleren Zirkularitätsindexes, die bei der Stimulation von CCL 19 beobachtet wird, gering.

In diesem Experiment wurden die T-Zellen mit GFP zusammen mit Plasmiden, die für die dominanten negativen Mutanten des Polaritätskomplexes par six kodieren, durchtrennt. PKC zeta. Das Histogramm für die nicht t-transfizierten Zellen ermöglichte ein spezifisches Gating für die relevanten GFP-positiven T-Zellen, was darauf hindeutet, dass ein zu kleiner Teil der gesamten Zellpopulation transfiziert wurde.

Der Grad der morphologischen Polarisation dieser transfizierten Zellen wurde dann quantifiziert, indem nur der Zirkularitätsindex der GFP-positiven Zellen und ein zusätzlicher Gang für die T-Zellen gemessen wurden. Es wurden niedrige Zirkularitätswerte erstellt, um den Prozentsatz polarisierter Zellen unter jeder eingenommenen Bedingung zu schätzen. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Störung der Funktion des par six PK CZ zum Signalweg die T-Zell-Polarisation hemmt, die sowohl durch CCL 19 als auch durch c Xcl 12 Chemokine induziert wird.

In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, während des gesamten Schritts der Stimulation der Insolution-Kin und der anschließenden Fixation immer bei 37 Grad Celsius zu arbeiten, um eine starke und zuverlässige morphologische Polarisation der Lymphozyten zu gewährleisten.