Name: Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie morphologische Veränderungen und Proteinlokalisierung in T-Zellen nach Chemokin-Stimulation mittels Imaging-Flow-Zytometrie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und statistisch robuste Analyse großer Zellpopulationen.

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Die Autoren Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert und Louise Rimbault des Cochin Imaging Facility deutlich erkennen. Diese Arbeit wurde von Inserm, CNRS und Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe einem Gütezeichen) unterstützt.

1. Herstellung von T-Lymphozyten <ol><li> Bereiten primären Maus oder humanen T-Zellen wie beschrieben 10,11. </li><li> Kultivieren humaner T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% Humanserum AB in einer Dichte von 2 - 3 x 10 6 Zellen / ml. HINWEIS: Die Verwendung von fötalem Kälberserum (FCS) anstelle von Humanserum kann spontane Polarisation von einem großen Teil der menschlichen T-Zellen in der Kultur hervorruft. Bewahren Sie diese Zellen in Kultur für 4-5 Tage und weiter zu verarbeiten, diese jederzeit während dieser Periode. </li><li> Pflegen Maus-T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% FCS ergänzt war, bei einer ähnlichen Zelldichte. Sofort verwenden oder am nächsten Tag, nach einer O / N-Kultur bei 37 ° C in Gegenwart von 10 ng / ml IL7. </li><li> Kultivieren der CEM menschlichen T-Zelllinie in komplettem RPMI, ergänzt mit 10% FCS. </li></ol> 2. Chemokine Stimulation <ol><li> Waschen 5 x 10 5 Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS Medium mit 10 mM Hepe ergänzts. Für einige Experimente, Co-Transfektion von primären humanen T-Zellen am Tag zuvor mit 2 pg pmaxGFP und 8 ug pcDNA3.1 + (Leervektor, Kontrolle), PKCζ Kinase tot, oder N-terminalen Par6 Plasmide. </li><li> Zellpellet in warmem HBSS-HEPES-Medium (0,3 ml verwenden x Anzahl der Versuchsbedingungen). </li><li> Verteilen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Daher wird ein Rohr entsprechend einer einzelnen experimentellen Bedingung 5 x 10 5 Zellen in 0,3 ml HBSS-HEPES Medium enthalten. Für einige Experimente, 500 nM Latrunculin A oder Vehikel (DMSO) und inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten vor dem Chemokin-Stimulation. </li><li> Hinzufügen 10 bis 500 ng / ml CCL19 oder CXCL12 Chemokin in jedes Röhrchen. HINWEIS: Wir verwenden normalerweise 10 bis 200 ng / ml Chemokin für den menschlichen T-Zellen. CEM-Zellen exprimieren keine CCR7 Rezeptor, CCL19 bindet. Daher wird CEM-Zellen nur dann in einem CXCL12 Stimulation reagieren. Darüber hinaus verwenden höheren Chemokin-Konzentrationen (300-500 ng / ml) zu polarisieren, Maus-T-Zellen. </li><li> Mehrmals drehen Sie die Rohre und inkubieren sie in einem 37 ° C Wasserbad für 8 oder 10 Minuten für die primäre T-Zellen oder CEM auf. </li><li> Stoppen des Polarisationsprozesses durch Zugabe zu jedem Röhrchen 0,3 ml einer warmen Lösung, die 2% Paraformaldehyd (PFA) und 10 mM Hepes in PBS. Drehen Sie die Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C für 5 min. </li></ol> 3. Färbungen <ol><li> Übertragen Sie die Zellen aus den Mikrozentrifugenröhrchen auf Zytometrie Rohre fließen. </li><li> Vollständig zu füllen die Rohre mit einer RT-Lösung, die 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes in PBS. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 460 × g für 4 min. </li><li> Den Überstand verwerfen und die Zellen werden in 100 ul einer RT-Lösung, enthaltend 5% FCS in PBS. </li><li> Mit 5 &amp; mgr; l FITC-anti-HLA-ABC in jeder Röhre, Wirbel ihnen und inkubieren für 30 min bei RT, entfernt von Licht. </li><li> Wash-Zellen einmal mit PBS, enthaltend 5% FCS, einnd einmal mit nur PBS. </li><li> Bei RT: add 500 ul 1% PFA, Inkubation für 10 min, dann waschen Sie die Zellen mit einer Lösung, die 1% BSA, 0,5 mM EDTA und 10 mM HEPES in PBS. </li><li> Überstand verwerfen, vollständig zu füllen die Röhrchen mit einer Lösung von PBS, die 0,2% BSA, 0,1% Saponin, 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes (Permeabilisierung Puffer). </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in diesem Medium. </li><li> Drehen Sie die Rohre, um das Medium zu entfernen und vortexen sie das Zellpellet zu distanzieren. </li><li> Zugabe von 0,25 &amp; mgr; g / ml TRITC-Phalloidin und / oder eine 1: 100-Verdünnung von Anti-P-ERM-Antikörper zu jedem Röhrchen, Wirbel zu und inkubiere für 30 min bei RT. </li><li> Wash-Zellen mit der Permeabilisierung Puffer. Inkubieren mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, falls erforderlich. </li><li> Die Zellen in 200 ul PBS und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Zellen sind bereit für die Übernahme. Alternativ, während eine maximale Gesamtmenge von 200 ul pro Röhrchen, konzentriertes PFA auf einen endgültigen 1%Konzentration, um die Färbungen zu erhalten, wenn die Zellen nicht am selben Tag für die weitere Verarbeitung verwendet werden. </li></ol> 4. Bilder Erfassung und -analyse <ol><li> Schalten Sie das Gerät (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Equipment) und lassen Sie es sich selbst zu kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die INSPIRE-Software wurde mit einem 40X-Objektiv (0,75 NA) verwendet. Der IDEAS 3.0-Software wurde für alle berichteten Quantifizierungen verwendet. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Akquisitionsfenster, die in einer Vorlage für zukünftige Experimente gespeichert werden können. Zeichne Histogramme, die die RMS Gradientenwerte zu quantifizieren. Von der &quot;In Focus&quot; Bevölkerung, auf die RMS Gradientenhistogramm ausgewählt, die Abgrenzung der &quot;Einzelzelle&quot; Bevölkerung in einem Histogramm der Umgebung. Sobald der Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingelegt worden ist, stellen Sie die Laserleistung, Tor auf einzelne Zellen und erwerben 5.000 T-Lymphozyten. </li><li> In der Idee Weichware, öffnen Sie den Erwerb Datei und erstellen Sie ein Histogramm, das den Wert des Gradienten RMS-Wert für Hellfeld-Bilder zeigen wird (Kanal 1) für jede einzelne Zelle erhalten. Zeichnen Sie ein Tor auf der RMS Gradientenhistogramm, die Zellen, die RMS Gradientenwert oberhalb 57 hält. HINWEIS: Der RMS-Gradienten ermöglicht unter Berücksichtigung der Analyse nur die T-Lymphozyten, die in der Brennebene sind. Wir haben empirisch festgestellt, dass die einzelnen Zellen eine RMS Gradientenwert überlegen 57 zeigen, sind in der Brennebene, und kann genau berücksichtigt werden. </li><li> In der Analyse / Masken-Menü erstellen Sie eine neue Maske, genannt Erodieren (M01,2) von der Morphologie Maske auf den Hell Bilder M01, von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü ein neues Merkmal der Umgebung, auf dem Erodieren (M01,2) Maske errechnet. Aus den im vorigen Tor ausgewählten Zellen, öffnen Sie ein Histogramm, das die Umgebung der Zellen mit dieser neu geschaffenen Maske. HINWEIS: Die Morphologie Masken, die von verfügbarenStandard sind viel größer als die tatsächliche Größe der Zelle. Somit ist es genauer, sie zu erodieren bis zu 2 Pixel. </li><li> Zeichnen Sie ein Tor zu den einzelnen T-Zellen, ohne den Kalibrierungsperlen und Schmutz (kleine Fläche) und die Dubletten (Großraum). Passen Sie dieses Tor bei jedem Erwerb. HINWEIS: Variationen in der Zellgröße wird die Position des Tors beeinflussen. Als Maus-T-Zellen sind kleiner als menschliche T-Zellen, die ihrerseits kleiner als CEM-Zellen sind, wird die Fläche eines jeden Zelltyps proportional zu seiner Größe sein. </li><li> Unter Berücksichtigung der einzelnen, fokussierten Zellen, die bei den vorherigen Schritten gated wurden Öffnen ein Punkt-Diagramm, bestehend aus der Rohmaterial Max Pixel auf dem HLA-ABC-Färbung (Kanal 2, x-Achse) als Funktion des Raw Max Pixel auf Phalloidin Färbung (Kanal 4, y-Achse). Erstellen Sie ein Tor, um die ungefärbten oder gesättigten fluoreszierende Veranstaltungen auszuschließen. Öffnen Sie zwei Histogramme, die die Raw Max Pixel für HLA-ABC (Kanal 2) und Phalloidin (Channel 4) Färbungen. </li><li> In der Analyse / Masken-Menü createa neue Maske, genannt Erodieren (M02,2) von der Morphologie Maske der HLA-ABC gefärbten Zellen (Kanal 2), von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü, erstellen Sie eine neue Funktion, die aus dem Kreisformparameter, auf dem Erodieren (M02,2) berechnet. Hinweis: Dieser Parameter misst die Abweichung der Zellform von einem Kreis. Daher wird eine perfekt runde T-Zellen eine hohe Rund Wert während verlängert polarisierten Zellen eine niedrige Kreis Index aufweisen müssen. </li><li> Anschließend erstellen Sie ein anderes Histogramm, das die Werte der Kreisformmerkmal von den zuvor geschlossenen Zellen berichten. Verwenden dieses Histogramm unmittelbar plotten die Verteilung eines einzelnen, fokussierten Zellpopulation gemäß dem Wert der Kreisförmigkeit für jede einzelne Zelle. </li><li> Mit Blick auf die Form des Histogramms für Nicht-stimulierte Zellen, zeichnen ein Gate zum polarisierten Zellen, beginnend mit der untersten Kreis Wert bis zum Rund Grenzwert, wo die meisten der nicht-stimulierten Zellenaufgetragen. Sehen Sie in der Statistikanzeige für den Prozentsatz der polarisierten Zellen unter den Wohnbevölkerung (% Gated). HINWEIS: Wir haben dieses Tor für Kreisformindexwerte unter 13 eingestellt. </li><li> Um bei der Polarisation des Actin-Färbung in den Zellen aus, zeichnet eine Histogramm für die Hell-Detail Ähnlichkeit R3 Wert, Vergleichen des HLA-ABC-Färbung (Kanal 2) und der Phalloidin-Färbung (Kanal 4). HINWEIS: Je größer der Wert dieser Funktion ist, desto mehr überlagert die beiden Färbungen sind. </li><li> Unter Verwendung der gleichen Strategie wie zuvor Gating plotten ein Gate an den nicht-stimulierten Zellen für die gesonderte Färbung, die den Prozentsatz an Zellen mit polarisiertem Aktinfärbung zeigt. </li><li> Nach Beendigung werden der Prozentsatz von Zellen, die eine Entmischung in der Verteilung der MHC-Klasse-I und Phalloidin-Färbungen wurde die prozentuale polarisierter Zellen zusammen mit den Mittelwerten der Kreisförmigkeit und Ähnlichkeit Indizes aller Zellen ± SD im entspr gezeigtenonding Statistiken Panels. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Mit einem letzten Technologie der Bildgebung Durchflusszytometrie, eine schnelle und informative Gating-Strategie zur zellulären und molekularen Ereignisse, die von Chemokin-Stimulation induziert Analyse wird vorgestellt. Die Veränderungen der Zellmorphologie von Chemokin-Stimulation und die subzelluläre Verteilung von verschiedenen Proteinen während des Polarisationsvorganges hervorgerufen: Von einem einzigen Experiment kann man zwei Arten von Informationen zu erhalten. Interessanterweise wird die Beweis auch die Mögli...

Chemokine sind kleine lösliche Proteine, die Zellen zu spezialisierten Standorten 1 gewinnen. Daher nehmen sie an der korrekten Positionierung von Zellen in Geweben, eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung und Physiologie. Das Immunsystem ist keine Ausnahme von dieser Regel, wie es auf die Einwirkung von vielen verschiedenen Zelltypen, die in einem Strang, um eine wirksame Immunantwort beruht. Durch die Steuerung der spezifischen Position eines Immunzelltyps in einem bestimmten Zustand sind Chemokine vorge erforderlich, bevor Fremdantigene erkannt und neutralisiert werden. In T-Lymphozyten, insbesondere Chemokine binden an spezifische Oberflächenrezeptoren, die bei Eingriff, entlocken viele intrazelluläre Signale (Calcium-Anstieg, ERK Phosphorylierung, Rho-GTPasen Aktivierung Anstieg der Integrine Affinität und Zytoskelett-Änderungen), die T-Zell-Motilität 2,3 begünstigen. Auf zellulärer Ebene kann eine morphologische Veränderungen bei Chemokin Stimulation ausgelöst beobachten.Diese Veränderungen in der Zellformen sind besonders dramatisch in T-Zellen: ruhende T-Zellen bei Reisen in den Blutstrom über eine wulstartige runde Morphologie. Jedoch ist die Erfassung der Gegenwart von Chemokinen an Entzündungsstellen oder zumin Nähe Lymphorganen gehen, um die Form von T-Zellen, die nun eine typische &quot;hand-Spiegel&quot; Morphologie, bestehend aus einer bipolaren Form annehmen ändern: eine führende Kante an der Vorderseite und eine Hinterkante oder Uropod, an der Rückseite 4. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Komponenten in diesen zwei gegenüberliegenden Bereichen eines polarisierten T-Zelle zu trennen, um die Migration zu erhalten. Beispielsweise Aktinfilamente Polymerisation steigt auf Chemokin Stimulation 5 und polymerisierten Actin reichert sich an der Vorderseite eines polarisierten T-Zelle 2. Auf der anderen Seite, mehrere Proteine, wie phosphorylierte Proteine ​​der Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) -Familie, die Plasmamembran zu der kortikalen F-Aktin zu verbinden, erneut lokalisiert am Uropod polarisierterT-Zellen 6. Interessanterweise haben wir und andere zeigen, dass diese Polarisierung Prozess wird für T-Zell-Migration erforderlich. Tatsächlich wird jede Behandlung, die mit Polarisations stört zellulären Motilität zu hemmen. Zum Beispiel die Hemmung der Aktivität der Mitglieder der atypischer Proteinkinasen C (PKC) Familie PKCζ und PKCι Blöcke T Zellpolarisation und deren Migrationsscanprozess der dendritischen Zellen 7. T-Zell-Polarisation auch von Rho-GTPasen geregelt. Wir haben gezeigt, dass die Modulation des RhoL Aktivität durch den kürzlich beschriebenen Fam65b Protein interferiert mit T-Zell-Veränderungen in der Morphologie und ihrer Fähigkeit, in einem Transwell-Assay 6 migrieren. Als Polarisations Voraussetzung Schritt zelluläre Motilität ist es daher von entscheidender Bedeutung, um es als eine Haupt Auslesen Chemokin Reaktionen zu quantifizieren. Zellform Veränderungen wurden bisher manuell 8 gemessen. Allerdings ist diese Art der Quantifizierung sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur wenigeZehn Zellen berücksichtigt. Hier wird ein neues Verfahren vorgestellt, um schnell quantifiziert den Grad der Formänderungen von T-Lymphozyten auf die Stimulation Chemokin ausgesetzt. Eine Abbildungs ​​Durchflusszytometrie-Technologie (siehe Tabelle Spezifische Reagenzien / Equipment) verwendet wird, der die Vorteile eines Durchflusszytometers und ein Mikroskop 9 kombiniert, um die Menge des polarisierten Zellen unter verschiedenen Bedingungen von Chemokin Stimulation effizient zu quantifizieren. Zusätzlich zur Quantifizierung der morphologischen Veränderungen, die eine robuste Konstruktion mit dieser Technik gemessen werden kann, ist es auch möglich, Veränderungen der subzellulären Lokalisation von einigen Proteinen bei Chemokinsignalisierung bewerten.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Humanserum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Vorheizen, um das Komplement zu inaktivieren.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Vorheizen, um das Komplement zu inaktivieren.</td></tr><tr><td>Humanes T-Zell-Nukleofaktor-Kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots werden auf Eis aufgetaut, bevor das Chemokin in die Zellen gegeben wird.</td></tr><tr><td>Humane CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots werden auf Eis aufgetaut, bevor das Chemokin den Zellen zugesetzt wird.</td></tr><tr><td>Humane CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots werden auf Eis aufgetaut, bevor das Chemokin den Zellen zugesetzt wird. Dieses Chemokin kann auch bei T-Zellen der Maus angewendet werden.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>Dies ist eine 8%ige PFA-Lösung in Wasser. Mischen Sie Volumen zu Volumen mit 2x PBS, um eine 4%ige PFA-Lösung in PBS zu erhalten.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC Antikörper</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>Klon B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle und robuste analyse zelluläre und molekulare polarisation durch chemokine signaling induced

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Zellen reagieren auf die Stimulation durch in einem Prozess namens Polarisation verlieren ihre runde Form, und durch Änderung der subzelluläre Lokalisierung vieler Proteine ​​Chemokin. Klassischen Bildgebungstechniken sind verwendet worden, um diese Phänomene zu untersuchen. Jedoch benötigt sie die manuelle Erfassung vieler Zellen gefolgt von zeitaufwendig Quantifizierung der Morphologie und die Co-Lokalisation der Färbung von zig Zellen. Hier wird ein schnelles und leistungsfähiges Verfahren beschrieben, um diese Phänomene zu Proben aus mehreren Tausenden von Zellen unter Verwendung eines Abbildungs ​​Durchflusszytometrie Technologie, die die Vorteile eines Mikroskops mit denen eines Zytometers kombiniert studieren. Verwendung von T-Lymphozyten mit CCL19 und Färbung für MHC Klasse I-Molekülen und filamentöses Aktin stimuliert wird eine Gating-Strategie dargestellt, um gleichzeitig die den Grad der Gestalt Änderungen und das Ausmaß der Co-Lokalisierung von Markern, die von CCL19 Signalisierung betroffen sind. Darüber hinaus konnten wir diese Gating-Strategie Observe die Trennung von filamentösen Aktin (vorne) und phosphoryliert Ezrin-Radixin-Moesin (Phospho-ERM) Proteine ​​(auf der Rückseite) im polarisierten T-Zellen nach CXCL12 Stimulation. Diese Technik war auch nützlich, um die blockierende Wirkung der Polarisation von zwei verschiedenen Elementen zu beachten: Hemmung der Aktin-Polymerisation von einem pharmakologischen Inhibitors und Expression von Mutanten des Par6 / atypische PKC Signalweg. Somit wird Beweise gezeigt, dass diese Technik ist nützlich, um sowohl morphologische Veränderungen und Protein Umverteilungen analysieren.

Die erste hier gewählten Beispiel betrifft die Verwendung von humanen primären T-Lymphozyten mit CCL19 stimuliert. Jedoch kann die gleiche Strategie mit primären Maus-T-Zellen, T-Zelllinien oder andere Zelltypen, die auf Chemokin Stimulation verwendet werden. Die Gating-Strategie hier vorgestellten eine Reihe von Fenstern, die die fokussierten Veranstaltungen, dann die einzelnen Zellen auszuwählen. MHC-Klasse-I-HLA-ABC und polymerem Aktin zur Anlage (Figur 1) oder CCL19-stimulierte (Abbildung 2)...

Die Chemokin-Signalübertragung führt zu deutlichen Veränderungen der zellulären Morphologie und einigen wichtigen Umverteilungen intrazellulärer Proteine. Hier wird ein schnelles und detailliertes Protokoll zur Untersuchung dieser Ereignisse bereitgestellt.

Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Das Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Veränderungen der Zellmorphologie und die subzelluläre Lokalisierung spezifischer Proteine von Interesse in einer großen Anzahl von Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus schnell und automatisch zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die T-Zellen mit den für sie interessanten Chemo-Arten stimuliert werden. Im zweiten Schritt werden die Zellen fluoreszenzmarkiert und anschließend mittels bildgebender Durchflusszytometrie analysiert.Im letzten Schritt können die Anzahl der morphologisch polarisierten Lymphozyten und der Grad der Segregation der Fluoreszenzmarker anhand der Lage und der Intensität der Pixel für jede Färbung in Abhängigkeit von der gewählten Maske bewertet werden. Letztendlich kann diese bildgebende Durchflusszytometrie-Technologie verwendet werden, um die morphologischen Veränderungen von Lymphozyten nach der Chemokinstimulation sowie die Position spezifischer Proteine von Interesse innerhalb der polarisierten Zellen schnell und robust zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass eine große Anzahl von Zellen wiederholt verarbeitet und automatisch analysiert werden kann, was eine statistisch starke Analyse der morphologischen Veränderungen und der Proteinverteilung gewährleistet.Bei Chemokin-stimulierten T-Lymphozyten beginnt die Boche-artige Stimulation der T-Zellen mit dem fünfmaligen Waschen der fünf Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS, ergänzt mit 10 Millimolaren HEPs, zentrifugiert für fünf Minuten bei 340-G.At facher Raumtemperatur, entfernt das Supinat und suspendiert die Pellets erneut in 0,3 Millilitern warmem HBSS he Stück pro Röhrchen. Anschließend werden die Zellsuspensionen in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie 10 bis 500 Nanogramm pro Milliliter Chemokin in jedes Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen dann mehrmals um, um sie zu mischen.Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Stoppen Sie nach acht bis 10 Minuten die Polarisation mit 0,3 Millilitern warmem, 2%igem Paraldehyd, ergänzt mit 10 Millimolar. Er Erbsen.Mischen Sie dann die Röhrchen mit mehr Flipping und inkubieren Sie sie weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse zu färben. Als nächstes werden die stimulierten T-Zellen in entsprechende Durchflusszytometrie-Röhrchen überführt. Füllen Sie die Röhrchen vollständig mit Färbepuffer.Schleudern Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern 5%igem fötalem Kälberserum in PBS. Geben Sie nun fünf Mikroliter ZI N-T-H-L-A-A-B-C in jedes Röhrchen. Wirbeln Sie sie und inkubieren Sie die Zellen am Ende der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Waschen Sie die Zellen zweimal und inkubieren Sie sie dann in 500 Mikrolitern 1%para Formaldehyd. Waschen Sie die Zellen nach 10 Minuten in mehr Färbepuffer und füllen Sie die Röhrchen dann vollständig mit Permeationspuffer. Nach zweimaligem Waschen der Zellen verließ der Puffer die Röhren, um das Supinat zu entfernen und sie dann zu wirbeln, um die Zellpellets zu dissoziieren.Färben Sie nun die Proben mit null Punkt 25 Mikrogramm pro Milliliter, trixi für die Lende, wirbeln Sie sie und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubationszeit in Permeationspuffer. Nochmals, Wiederbelebung.Suspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS und übertragen Sie die Zellen dann in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen, um den Prozentsatz der polarisierten T-Zellen nach der Chemokinstimulation zu bestimmen. Schalten Sie zunächst das bildgebende Durchflusszytometer ein und lassen Sie es sich gemäß den Herstellerangaben kalibrieren. Zeichnen Sie Histogramme, die die RMS-Gradientenwerte aus der fokussierten Population quantifizieren, die auf dem RMS-Gradienten ausgewählt wurde.Histogramm: Beschreiben Sie die Einzelzellpopulation auf einem Histogramm des Bereichs, sobald das Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingeführt wurde, passen Sie den Laserleistungsgang an einzelnen Zellen an und erfassen Sie 5.000 T-Lymphozyten. In der Ideenanalyse-Software. Öffnen Sie die erfassten Dateien und erstellen Sie dann ein Histogramm, das den Gradienten-RMS-Wert für die Hellfeldbilder für jede einzelne Zelle anzeigt, indem Sie ein Gate auf die Zellen zeichnen, das einen RMS-Gradientenwert über 57 aufweist.Erstellen Sie im Analysemenü eine neue Maske mit dem Namen "M1 zwei erodieren" aus der Morphologiemaske auf den Hellfeldbildern M null eins erodiert von zwei Pixeln. Erstellen Sie dann im Menü "Analyse-Features" ein neues Feature der Fläche, die auf der Maske "M1 zwei erodieren" berechnet wurde, aus den Zellen, die im vorherigen Gate erstellt wurden. Öffnen Sie ein Histogramm, das die Fläche der Zellen zeigt Zeichnen Sie mit dieser neu erstellten Maske ein Tor auf die einzelnen T-Zellen, wobei die Kalibrierkügelchen und Ablagerungen im kleinen Bereich sowie die Dubletten im großen Bereich ausgeschlossen sind.Öffnen Sie dann einen Bot, der aus dem Rohmaximum auf der H-L-A-A-B-C-Färbung als Funktion des Rohmaximums auf der Phin Färbung im Menü der Analysemasken besteht, zurück zu einer neuen Maske namens Erode M zwei zwei von der Morphologiemaske der H-L-A-A-B-C Färbezellen erodiert von zwei Pixeln. Erstellen Sie dann im Menü "Analyse-Features" ein neues Feature, das aus dem Zirkularitätsparameter besteht, der auf der Erosion M zwei zwei berechnet wurde.Erstellen Sie anschließend ein weiteres Histogramm, um die Werte des Zirkularitätsmerkmals aus den zuvor abgegrenzten Zellen zu melden. Betrachtet man dann die Form des Histogramms für die nicht stimulierten Zellen, so wird der RO-Achat für die polarisierten Zellen berechnet, beginnend mit dem niedrigsten Zirkularitätswert bis zum Zirkularitätsgrenzwert, bei dem die meisten nicht stimulierten Zellen aufgetragen werden, um die Polarisation der Aktinfärbung innerhalb der Zellen zu beurteilen. Plus ein Histogramm für die helle Detailähnlichkeit, R drei Wert zum Vergleich von H-L-A-A-B-C und Foid in der Färbung.Dann unter Verwendung der gleichen Gating-Strategie wie gerade gezeigt, plus einem GA auf den nicht stimulierten Zellen für die nicht-co-lokalisierte segregierte Färbung. Das Statistikpanel zeigt hier den Prozentsatz der T-Zellen mit polarisierter Aktinfärbung. Es werden Beispiele für CCL 19-stimulierte T-Lymphozyten gezeigt, die in das Gate der unpolarisierten oder polarisierten Zellen fallen.Unterschiede in der Morphologie zwischen beiden Subpopulationen sind deutlich zu erkennen. Die gerade gezeigte Gating-Strategie kann auch verwendet werden, um den Prozentsatz der Zellen zu plotten, die in Abwesenheit von CCL 19 in das polarisierte Gate fallen. Wie erwartet ist es klar, dass die Chemokinstimulation den Prozentsatz der polarisierten T-Zellen erhöht.Der unter beiden Bedingungen erhaltene mittlere Zirkularitätsindex der gesamten Zellpopulation kann ebenfalls aufgetragen werden. In der Tat führt die CCL 19-Stimulation zu einem Abfall dieses Index. Da jedoch nur die Hälfte der Zellen polarisiert ist, ist die Änderung des mittleren Zirkularitätsindexes, die bei der Stimulation von CCL 19 beobachtet wird, gering.In diesem Experiment wurden die T-Zellen mit GFP zusammen mit Plasmiden, die für die dominanten negativen Mutanten des Polaritätskomplexes par six kodieren, durchtrennt. PKC zeta. Das Histogramm für die nicht t-transfizierten Zellen ermöglichte ein spezifisches Gating für die relevanten GFP-positiven T-Zellen, was darauf hindeutet, dass ein zu kleiner Teil der gesamten Zellpopulation transfiziert wurde.Der Grad der morphologischen Polarisation dieser transfizierten Zellen wurde dann quantifiziert, indem nur der Zirkularitätsindex der GFP-positiven Zellen und ein zusätzlicher Gang für die T-Zellen gemessen wurden. Es wurden niedrige Zirkularitätswerte erstellt, um den Prozentsatz polarisierter Zellen unter jeder eingenommenen Bedingung zu schätzen. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Störung der Funktion des par six PK CZ zum Signalweg die T-Zell-Polarisation hemmt, die sowohl durch CCL 19 als auch durch c Xcl 12 Chemokine induziert wird.In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, während des gesamten Schritts der Stimulation der Insolution-Kin und der anschließenden Fixation immer bei 37 Grad Celsius zu arbeiten, um eine starke und zuverlässige morphologische Polarisation der Lymphozyten zu gewährleisten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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