Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Kontusionsmodell der Rückenmarksverletzung bei Mäusen detailliert zu beschreiben, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst postmortale, neuronale Vorläuferzellen oder PM-NPCs mit dem vitalen Tracer PKH 26 markiert werden. Als nächstes wird ein dorsaler Schnitt an der Maus gemacht und das Rückenmark freigelegt.

Dann wird ein Impaktorgerät mit unendlichem Horizont oder IH verwendet, um eine Läsion am Rückenmark zu erzeugen. Schließlich werden die PKH 26 mit der Bezeichnung PM und PCs in die Schwanzvene der Maus injiziert. Letztendlich wird das Schicksal des transplantierten PKH 20 6:00 PM und der PCs an der Läsionsstelle verfolgt.

Das Verletzungsmodell repliziert den Mann mit Rückenmarksverletzung. Auf die primäre mechanische Schädigung folgt eine fortschreitende sekundäre Degeneration, bei der eine zelluläre und pharmakologische Behandlung untersucht wird. Die beschriebenen Anwendungen können eine methodische Grundlage bieten, um weitere Erkenntnisse über den Glauben zu gewinnen.

Induktion von Stammzellen, die in ein Rückenmark transplantiert werden, während Degeneration und Entzündungsereignisse stattfinden. Die Läsion wird von Dr. Tony Laja Longo, Doktorand im Labor, demonstriert. Während die Schwanzinjektion von Dr. Ache, einem Postdoktoranden im Labor, durchgeführt wird, beginnt dies mit neuralen Stammzellen, die die im Textprotokoll beschriebenen Kriterien erfüllen.

Die Reanimation suspendiert die Zellen bis zu einer Konzentration von eins mal 10 auf die sechs Zellen pro 150 Mikroliter. Bereiten Sie mindestens 1,2 mal 10 bis sechs Zellen pro Maus vor, um genügend Zellen zum Laden der Pipette zu haben. Waschen Sie die Zellen mit neuralem Stammzellmedium dreimal in einem konischen 10-Milliliter-Fläschchen und drehen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500-facher G-Menge, um die Zellen zu pelletieren.

Nach jedem Waschen, vor der endgültigen Schleuderzählung, saugen die Zellen nach dem Schleudern den Überstand an, wobei etwa 25 Mikroliter Flüssigkeit übrig bleiben, um ein Ansaugen von Zellen zu verhindern. Bereiten Sie als Nächstes eine Zwei-X-Suspension vor, indem Sie einen Milliliter Verdünnungsmittel C in den Zellgaumen geben und verwenden Sie sanftes Pipettieren, um es sofort wieder zu resuspendieren. Bereiten Sie vor dem Färben eine Zwei-fach-Farbstofflösung in Verdünnungsmittel C vor, indem Sie vier Mikroliter der PKH 26 Ethanol D-Lösung zu einem Milliliter Verdünnungsmittel C in einem Röhrchen hinzufügen und gut mischen.

Um schnell zu dispergieren, geben Sie den einen Milliliter von zwei x Zellen Suspension zu einem Milliliter zwei XD Lösung und mischen Sie die Probe sofort durch Pipettieren. Nachdem Sie die Zellmatrizensuspension ein bis fünf Minuten lang inkubiert haben, stoppen Sie die Färbung, indem Sie ein gleiches Volumen von 1%iger BSA-Lösung in HBSS hinzufügen und eine Minute lang inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G für 10 Minuten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Verwenden Sie 10 Milliliter des vollständigen Mediums, um das Zellpellet zur Beurteilung der Zellrückgewinnung, der Zellviabilität und der Fluoreszenzintensität zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 10 Milliliter HBSS hinzu. Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS und resuspendieren Sie die Zellen in einer sterilen physiologischen Lösung.

Nach der Vorbereitung des Operationsfeldes und einer Maus gemäß dem Textprotokoll wird die Rückenseite des Tieres mit dem Skalpell auf einen Objektträgerwärmer gelegt, um eine Unterkühlung während der Operation zu vermeiden, und mit einer Pinzette einen vertikalen Schnitt über den interessierenden Bereich von T 7 bis T 12 vorgenommen. Halten Sie die Haut und das oberflächliche Fettpolster, das sich zwischen dem fünften und sechsten Thoraxfortsatz befindet, unter ein Stereomikroskop. Zählen Sie den Prozess unter dem Blutgefäß als T sechs und gehen Sie dann zu T sieben über.

Platzieren Sie dann ein kleines Lager unter der ventralen Seite der Maus, um die Krümmung der Wirbelsäule zu erhöhen, und verwenden Sie eine Grof-Pinzette, um die Wirbelsäule zu blockieren und sie ruhig zu stellen. Anschließend wird mit einem Skalpell der Para der Wirbelmuskulatur bilateral von T 7 bis T 10 auf Wirbelhöhe durchtrennt, bis die dorsale Oberfläche der Lamina die Skalpellspitze berührt. Markieren Sie dann mit einem Skalpell die Verbindung von T 7 bis T 10 auf Wirbelhöhe, bis die dorsale Oberfläche der Lamina den Skalpellspitzenstopp im Raum zwischen den winzigen Vorsprüngen von T 8 und T neun berührt.

Schneiden Sie dann mit einer Mikroschere das Gewebe zwischen T acht und T neun und T neun und T 10 auf. Verwenden Sie nun den Rongeur, um den T neun Prozess zu entfernen. Legen Sie die Verbindungsstelle frei, indem Sie die Muskelschicht mit einer Mikroschere vorsichtig abkratzen.

Fahren Sie fort, bis der Knochen freigelegt ist. Entferne mit einer Pinzette die Muskeln aus der Lamina und öffne einen kleinen Raum zwischen den Wirbeln. Führen Sie dann die Mikroschere vorsichtig unter den Knochen ein.

Schneide die Lamina auf beiden Seiten ab und entferne sie mit der Pinzette, wodurch die Nabelschnur freigelegt wird. Verwenden Sie den Ron Jour, um freie oder gezackte Knochenfragmente zu entfernen, die zurückbleiben. Entfernen Sie dann die obere Hälfte des dorsalen Fortsatzes T neun.

Nachdem Sie das Protokoll des IH-Impaktorgeräts gemäß den Richtlinien im Text befolgt haben, verwenden Sie vier resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu schließen, indem Sie zuerst das freiliegende Rückenmark an der Stelle der entfernten Lamina abdecken. Achten Sie darauf, dass die darunter liegenden Muskeln nicht eingeklemmt werden. Verwenden Sie zwei oder drei Reflexclips, um die Haut zu schließen.

Injizieren Sie zwei Milliliter Kochsalzlösung subkutan in den unteren Rücken und legen Sie die Maus in einen vorwarmen Käfig auf ein Heizkissen, um sich zu erholen. Zur Durchführung einer Schwanzveneninjektion von Zellen. Suspendieren Sie die Zellen im Reagenzglas und füllen Sie 75 Mikroliter in eine 0,3-Milliliter-Spritze, wobei Sie sicherstellen, dass keine Blasen in der Zellsuspension vorhanden sind.

Um Zellsedimentation zu vermeiden, halten Sie die Spritze in einer horizontalen Position. Platzieren Sie die Maus unter der Wärmelampe, um die Schwanzvenen zu erweitern. Ziehen Sie dann die Maus vorsichtig in den Rückhaltebehälter, um die seitliche Schwanzvene sichtbar zu machen, die als schmale blaue Linie erscheint.

Verwende einen Alkoholtupfer, um den Schwanz zu reinigen, und sobald die Vene sichtbar ist, greife die Schwanzvene zwischen dem Mittelfinger und dem Daumen der linken Hand. Die in diesem Video gezeigte T-neun-Prellung verursachte einen vorübergehenden Verlust der Funktion der hinteren Gliedmaßen dreimal 10 mal 10 bis zu den fünften Zellen oder PBS wurden in drei Injektionen in die Schwanzvene injiziert, die 30 Minuten, sechs Stunden und 18 Stunden nach der Verletzung durchgeführt wurden. Wie hier gezeigt, erreichten die PBS-behandelten Verletzten innerhalb von zwei bis drei Wochen die Mäuse und die Funktion der hinteren Gliedmaßen erreichte drei Punkte der basalen Mausskala oder BMS-Mäuse, die mit PM behandelt wurden.NPCs zeigten jedoch eine höhere Erholung und erreichten 4,5 BMS-Punkte, wie hier zu sehen ist, die meisten transplantierten PM-NPCs, die mit PKH 26 markiert waren, akkumulierten sich an den Rändern der Läsionscluster an.

Kurz nach der Verabreichung wanderten die transplantierten Zellen entlang der Läsionsränder und auf eine diffusere Weise, wo sie sich zu Neuronen differenzierten. 30 Tage nach der Läsion und Transplantation nahm der Zellkörper von pm-NPCs an Größe zu und in den meisten Zellen waren dendritische ähnliche Prozesse offensichtlich und vollständig immungefärbt durch die spezifischen Antikörper, auf die abgebildet werden sollte. Bei der Durchführung dieses Pro-Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass höhere Kräfte die Sterblichkeit beim Tier aufgrund schwererer Verletzungen erhöhen können. Daher schlagen wir vor, unser Paradigma der Läsionierung zu verwenden, auf das ein reproduzierbarerer Erholungsprozess folgt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit dem Impaktor mit unendlichem Horizont ein reproduzierbares experimentelles Modell einer traumatischen Rückenmarksverletzung bei der Maus erhalten.