Verwendung von Stopped-Flow-Fluoreszenz und markierte Nukleotide ATP, um die Umsatz-Zyklus von Kinesine Analysieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kinetik der Nukleotidbindung und -dissoziation während des A-TP-Umsatzzyklus eines Kinesins zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Kinesin-Protein präpariert wird, das entweder frei von Nukleotid oder mit fluoreszenzmarkiertem Nukleotid beladen ist. Als nächstes wird das vorbereitete Kinesin mit Nukleotid unter Verwendung eines Fluorimeters mit gestopptem Durchfluss gemischt und die Änderung der Fluoreszenz, die mit der Bindung oder Dissoziation von fluoreszenzmarkiertem Nukleotid verbunden ist, wird beobachtet.

Dann wird die Änderung der Fluoreszenz an eine Exponentialfunktion angepasst, um eine Geschwindigkeitskonstante zu erhalten. Schließlich werden die gemessenen Kurskonstanten dezentralisiert und die Kurskonstanten bestimmten Übergängen des A-TP-Umsatzzyklus zugeordnet. Letztendlich wird die Kombination aus fluoreszenzmarkiertem Nukleotid und gestoppter Flussfluoreszenz verwendet, um die Kinetik der Nukleotidbindung und -dissoziation zu messen.

CIN Das Verfahren wird von Jennifer Patel, Postdoc, und Hannah Belch, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Nach Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Kinesin bei Bindung von menschenmarkiertem Nukleotid, wie im Textprotokoll beschrieben, an eine Lösung von bis zu 20 mikromolaren Kinesin in magnesiumfreiem Puffer bei einem Millimolar EDTA und einem Millimolar DTT inkubieren Sie die Lösung für 15 Minuten bei 25 Grad Celsius, richten Sie eine Schwerkraftfluss-G 25 SX Gelfiltrationssäule ein und äquilibrieren Sie mit mindestens drei Säulenvolumina eines magnesiumfreien Puffer. Laden Sie dann die Essinlösung in die Säule, um freie Nukleotide und EDTA vom Kinesin zu trennen.

Reparieren Sie ein Sammelröhrchen, indem Sie ein Volumen von 100 Millimolar Magnesiumchloridlösung in das leere Röhrchen geben, so dass die Endkonzentration von Magnesiumchlorid ein Millimolar beträgt. Nach der Entnahme der Kinesinlösung wird das Kinesin mit einem geeigneten magnesiumfreien Puffer schnell eluiert. Das Vorhandensein von Magnesiumchlorid im Sammelröhrchen hilft, das Kinesin unmittelbar nach der Einnahme von Ian aus der Säule zu stabilisieren, das Kinesin auf Eis zu lagern und innerhalb von ein bis zwei Stunden zu verwenden.

In der Zwischenzeit bereiten Sie einem Mann eine TP-Konzentrationsreihe vor. Wählen Sie den Konzentrationsbereich entsprechend der verfügbaren Kinesinkonzentration. Für jede Konzentration von mant und TP wird eine geeignete Konzentration von Kinesin hergestellt, so dass das vom Mann markierte Nukleotid einen fünf- bis zehnfachen molaren Überschuss über den Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen aufweist.

Stellen Sie die Anregungswellenlänge am Stopp-Flow-Fluorimeter auf 365 Nanometer und die Emissionswellenlänge mit einem Langpassfilter auf über 400 Nanometer ein. Beginnen Sie als Nächstes mit der niedrigsten Konzentration von Manta TP und verwenden Sie das Fluorimeter mit gestopptem Durchfluss, um das Manta TP und das nukleotidfreie Kinesin in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von eins zu eins zu mischen. Unter Verwendung der folgenden Formel passen Sie das Maß für die Änderung der Fluoreszenzintensität an, um die Konzentration von mant A TP auf eine Exponentialfunktion zu übertragen, plus eine Linie konstanter negativer Steigung, um das Photobleichen der mant-Gruppe zu berücksichtigen.

Aus diesen Passungen wird eine Geschwindigkeitskonstante bei jeder Mantkonzentration bestimmt. Ein TP dezentralisiert dann die Assoziations- und Dissoziationsraten, indem er Kops mit Zahnseide gegen die Konzentration von Mant verwendet. Ein TP Passen Sie diese Daten dann an eine lineare Funktion an, um den Gradienten und den Schnittpunkt der Y-Achse zu erhalten.

Der Gradient stellt die Geschwindigkeitskonstante für den Menschen dar, eine TP-Assoziation mit Einheiten pro Molar pro Sekunde. Der Schnittpunkt stellt die Dissoziationsrate dar, die konstant zu den Einheiten pro Sekunde ist. Um die konstante Dissoziationsrate zu messen, fermentieren Sie ein DP zu einer Lösung von zwei mikromolaren Kinesin in einem geeigneten Puffer bei 50.

Mikromolar bedeutete einen DP-Inkubator bei 25 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Verwendung einer G 25 Sedex-Säule zur Entfernung von fre mant, A DP aus dem Kinesin, beladen mit mant A DP, und dem Einstellen der Stop-Flow-Fluter, wie weiter oben in diesem Video beschrieben, verwenden Sie den gestoppten Flow, um den mant A DP Kinin-Komplex mit einem 50-fachen oder mehr molaren Überschuss an unmarkiertem A TP in einem Eins-zu-Eins-Volumenverhältnis zu mischen. Die im Laufe der Zeit beobachtete Abnahme der Fluoreszenzintensität auf eine einzige Exponentialfunktion plus eine Linie konstanter negativer Steigung, um das Photobleichen der Gruppe zu ermöglichen.

Der aus dieser Anpassung ermittelte Kops ist die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von mant A DP mit Einheiten von pro Sekunde. Das Ausmaß der Signaländerung bei Bindung oder Dissoziation von mantelartigem Holznukleotid hängt vom jeweiligen Kinesin ab. Daher ist es sinnvoll, zunächst Gleichgewichtsmessungen durchzuführen, um sowohl das Vorhandensein als auch das Ausmaß einer Fluoreszenzintensitätsänderung zu bestätigen.

Fluoreszierende Spektren, die ein TP und ein DP sowohl in Lösung als auch im Komplex des Kinesins M CAC fermentieren, sind hier dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Reaktion, die beim Mischen eines TP mit nukleotidfreiem Kinesin auftritt. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität, die bei der Bindung von man A TP an M CAC auftritt, ist hier dargestellt, passend zur Geschwindigkeitskonstante gegenüber dem man.

Eine TP-Konzentration auf eine lineare Funktion, wie hier zu sehen, ermöglicht die Entfaltung der Geschwindigkeitskonstante, die zu Kops beiträgt, und liefert die Assoziations- und Dissoziationsrate Stance Ferment A TP. Diese Abbildung zeigt die beobachtete Abnahme der Fluoreszenzintensität von Ferment A DP bei der Dissoziation von M CEC, wie hier dargestellt. Die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von mant A DP von Kinesin wird bestimmt, indem diese Daten an eine Exponentialfunktion angepasst werden. Einmal gemeistert, können diese Protokolle jeweils in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in Kinesin geben kann, kann sie auch auf andere Nukleotidbindungsproteine wie Myosin und G-Proteine angewendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie fluoreszenzmarkierte Nukleotide und ein Stopp-Durchflussmessgerät verwenden, um die Kinetik der Nukleotidbindung und -dissoziation für ein Kinesin zu messen.