Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, olfaktorische sensorische Neuronen in vivo zu markieren, um die axonale Morphologie und Entwicklung sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Fluor-Vier-gekoppeltes Dextran in einzelne olfaktorische sensorische Neuronen poriert wird. Der zweite Schritt besteht darin, 24 Stunden zu warten, damit sich der Farbstoff in den axonalen Fortsätzen der sensorischen Neuronen ausbreiten kann.

Als nächstes wird eine Kaulquappe anästhesiert und ein dreidimensionaler Bildstapel des Riechkolbens mittels Multiphotonenmikroskopie aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, das markierte Neuron im selben Tier nach bestimmten Zeitintervallen wiederholt zu untersuchen. Letztendlich ermöglicht die Rekonstruktion der zellulären Morphologie die Visualisierung von Veränderungen in der axonalen Morphologie.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Axone in Richtung der Zielregionen im Vorderhirn wachsen und wie Synapsen gebildet werden. Vor dem Experiment. Stellen Sie sicher, dass der Elektroporationsaufbau aus einem Stereomikroskop mit großem Arbeitsabstand besteht und mit einer Fluoreszenzbeleuchtung und Filtersets für den Farbstoff ausgestattet ist.

Für die Elektroporation wird entweder eine dedizierte Einzelzellen-Elektroporation oder ein generischer Rechteckimpulsgenerator verwendet, der an ein Oszilloskop angeschlossen ist. Verbinden Sie die Elektroporationsausgänge mit einem Pipettenhalter und einer Badelektrode. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Pipettenhalter als auch die Badelektrode Silberdrähte enthalten, die mit einer dünnen Schicht Silberchlorid beschichtet sind.

Montieren Sie anschließend den Pipettenhalter auf einen Mikromanipulator, um eine präzise Positionierung zu ermöglichen. Stellen Sie danach die Mikropipetten für die Elektroporation mit Bo-Silikatglaskapillaren mit einem internen Filament her. Stellen Sie die Parameter der polaren Mikropipette ein, um eine Mikropipette mit längerem Schaft und kleinerer Spitzenöffnung mit hohem Pipettenwiderstand für die Einzelzell-Elektroporation herzustellen.

Messen Sie dann den Pipettenwiderstand direkt mit der speziellen elektroporierten Einzelzelle. Bei diesem Verfahren löst man vierfach gekoppeltes Fluordextran im Froschring in einer Konzentration von drei Millimolaren. Teilen Sie diese Stammlösung in kleine Aliquote und bewahren Sie das Aliquote für die zukünftige Verwendung im Gefrierschrank auf.

Füllen Sie anschließend die Mikropipette mit ein bis fünf Mikrolitern Dextranlösung auf. Schnippen Sie vorsichtig mit der Mikropipette, um Restluftblasen von der Pipettenspitze zu entfernen. Montieren Sie dann die Mikropipette in den Pipettenhalter.

Stellen Sie sicher, dass der Silberdraht in der Pipette mit der Farbstofflösung in Kontakt kommt. Legen Sie nun ein kleines Stück Taschentuch in eine Petrischale und bedecken Sie es mit einer kleinen Menge Wasser mit 0,02% Trica. Als nächstes betäuben Sie eine prämetamorphe Kaulquappe in dem Wasser, das 0,02% trica enthält.

Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie es berühren und sicherstellen, dass es nicht ansprechbar ist. Übertragen Sie dann die Kaulquappe vorsichtig in die mit Gewebe bedeckte Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode mit dem feuchten Gewebe in Kontakt kommt, und positionieren Sie die Mikropipettenspitze mit einem Mikromanipulator nahe am Riechorgan der Kaulquappe.

Dringen Sie danach in die Haut ein, die das Riechorgan bedeckt. Schieben Sie die Spitze mit der Pipettenspitze vorsichtig in die zentral gelegene sensorische Neuronenschicht des Hauptriechepithels oder MRO-Nasenepithels vor. Lösen Sie nun die positiven Rechteckspannungsimpulse aus, um den Farbstoff in die sensorischen Neuronen zu übertragen, indem Sie einen einzelnen Spannungspol oder mehrere Impulsfolgen anlegen.

Visualisieren Sie dann die erfolgreiche Farbstoffextrusion und Elektroporation mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Der Farbstoff verteilt sich nach einer erfolgreichen Elektroporation schnell im Zellkörper und in den Dendriten. Nachdem Sie die Verfahren für das zweite Riechorgan der Kaulquappe wiederholt haben, geben Sie die Kaulquappe zur Erholung in ein mit frischem Wasser gefülltes Becherglas und lassen Sie den elektroporierten Farbstoff sich auf die sensorischen Neuronen und den Riechkolben ausbreiten.

Mindestens 24 Stunden nach der Elektroporation die Kaulquappe in dem Wasser betäuben, das 0,02 % Trica enthält. Bringen Sie dann die Kaulquappe vorsichtig in eine Bildgebungskammer. Schneide ein kleines Rechteck aus einem Streifen Param aus.

Bedecken Sie dann die Kaulquappe mit dem Param, wobei Sie das vordere Schwanz-Cephalon durch das ausgeschnittene Fenster lassen. Befestigen Sie den Param mit Nadeln an der Schale, ohne die Kaulquappe zu verletzen, und stellen Sie sicher, dass die Kaulquappe in ausreichend Wasser mit 0,02 % Trica getaucht ist. Montieren Sie die Bildgebungskammer anschließend auf dem Tisch eines aufrechten Multiphotonenmikroskops oder eines konfokalen Mikroskops.

Nehmen Sie einen dreidimensionalen Stapel von Bildern des Riechkolbens auf und stellen Sie sicher, dass das Bildgebungsverfahren 10 bis 15 Minuten nicht überschreitet. Stellen Sie die Kaulquappe danach in einem separaten Tank wieder in normales Wasser und verhindern Sie, dass sie Lichteinwirkung erhält. In diesem Bild wurden vier Deckstränge, die an verschiedene Fluoro-Vierer gekoppelt waren, an vier entfernten Stellen des Riechorgans elektroporiert, lateral durch grün, intermediär durch gelb medial mit rot und das Nasenorgan des Vomers mit orange gekennzeichnet.

Dies ermöglicht die Visualisierung des akzessorischen Riechkolbens und der drei Hauptprojektionsfelder des Haupt-Riechkolbens. Dieses Bild zeigt dreidimensionale Rekonstruktionen verschiedener axonaler Wachstumsmuster einzelner olfaktorischer sensorischer Neuronen, die die Struktur des Riechkolbens überlagern, und hier ist ein Beispiel für ein einzelnes olfaktorisches sensorisches Neuron-Axon, das in den Riechkolben projiziert und eine büschelförmige Arborisation im sphärischen Glomerular bildet. Wie hier in Opus Levu zu sehen, gabeln sich diese Axone regelmäßig, bevor sie sich mit einem, zwei oder mehreren GMER verbinden.

Dies ist ein repräsentatives Beispiel für ein einzelnes olfaktorisches sensorisches Neuron, das wiederholt durch in vivo Zeitraffer-Bildgebung untersucht wurde und kontinuierliche Veränderungen in der axonalen Morphologie zeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man olfaktorische sensorische Neuronen durch Elektroporation markiert und wie man ihre Entwicklung mit Hilfe der In-vivo-Zeitrafferbildgebung überwacht.