Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Ziel dieses Verfahrens ist es, schnell und effizient unterschiedliche Regionen von organotypischen Schnitten mit Hilfe einer Genkanone zu transfizieren oder zu markieren. Dies wird erreicht, indem zunächst lebensfähige organotypische Schnitte des Gehirns oder anderer Gewebe präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, DNA oder entschlüsselte Goldpartikel für die biotische Verabreichung herzustellen.

Als nächstes wird der organotypische Schnitt unter eine stabilisierte Genpistolenhalterung gelegt und die beschichteten Partikel in das Gewebe geschossen oder episomale Transformation oder Markierung vorgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Wirkung heterologer Gene, die an die isolierten Regionen abgegeben werden, zu beobachten oder zu analysieren. Letztlich ermöglicht dieser Ansatz dem Anwender, unterschiedliche Regionen der Organschnitte mit verschiedenen heterologen Genen präzise zu transfizieren.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Biologistik die Transfektion terminaler differenzierter Zellen ermöglicht und den Aktionsradius auf einen kleinen Durchmesser begrenzt. Diese Methode kann helfen, wichtige neurobiologische Fragen zu verstehen, wie z. B. das Verständnis des regionalen Beitrags eines einzelnen Gens. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie ein frisches Gehirn in eine kleine Empfängerform geben.

Bedecken Sie es mit der ARO-Lösung, die auf etwas über Raumtemperatur gebracht wurde. Kühlen Sie die Form dann schnell auf vier Grad Celsius ab, indem Sie sie auf Eis legen. Wenn der Aros untergegangen ist.

Entfernen Sie nach fünf bis 10 Minuten das in aros eingebettete Gehirn aus der Form. Kleben Sie es danach auf die Fibro-Slicer-Plattform. Übertragen Sie anschließend die Plattform in die Vibra-Slicer-Kammer, in der sich steriles, eiskaltes PBS befindet.

Legen Sie die Scheiben nach dem Schneiden vorsichtig auf die Zellkultureinsätze in einem Sechs-Multi-Well-Tablett mit Nährmedien an der Außenseite des Einsatzes. Inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Brutkasten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Bei diesem Verfahren bereiten Sie die Nanoprojektile mit Goldpartikeln mit einem Durchmesser von 40 Nanometern vor, indem Sie zuerst 50 Mikroliter 0,05 molare Spermien und 10 Mikroliter DNA mit einem Milligramm pro Milliliter zu 10 Milligramm Goldpartikeln hinzufügen.

Fügen Sie dann Calciumchlorid in die Lösungsmischung hinzu, um die Bindung von DNA-Molekülen an die Goldnanopartikel zu unterstützen. Anschließend ziehst du die Lösung mit einer Spritze in den Schlauch. Legen Sie den Schlauch in die Schlauchvorbereitungsstation.

Lassen Sie die Goldpartikel absetzen. Anschließend das Supinat durch Aspiration mit einer Spritze entfernen. Drehen Sie den Schlauch, um die Goldpartikel gleichmäßig zu verteilen.

Anschließend trocknen Sie die Partikel unter einem konstanten Stickstofffluss bei fünf Litern pro Minute. Um DNA-Kugeln herzustellen, schneiden Sie den Schlauch mit einem Schlauchschneider in ein Zentimeter große Stücke. Setzen Sie sie dann entweder sofort in die gengezüchtete Kartusche ein oder lassen Sie sie bis zur Verwendung in einer sterilen Lamina-Flow-Haube bei vier Grad Celsius trocknen, laden Sie die Kartusche mit dem DNA-beschichteten Gold in den Kartuschenhalter.

Laden Sie dann den Halter in die Genkanone. Befestigen Sie den modifizierten Genpistolenlauf mit einer sterilen Pinzette daran. Legen Sie einen Filtereinsatz, der eine organotypische Scheibe enthält, in eine sterile Kunststoffschale.

Entfernen Sie das Medium aus der organotypischen Scheibe. Stellen Sie anschließend den Gasdruck mit der Halterung auf 50 PSI ein. Platzieren Sie die Genkanone in einem Abstand von 10 Millimetern über der gewünschten Region der Scheibe für die genetische Verabreichung.

Zielen Sie dann vorsichtig auf die Mitte des Zylinders und schießen Sie die beschichteten Partikel in das Gewebe. Nach der biotischen Transfektion waschen Sie die Scheibe vorsichtig zweimal vorsichtig mit PBS. Fixieren Sie dann die Scheibe, indem Sie sie 20 Minuten lang in 4%igem eiskaltem PFA in PBS inkubieren.

Danach die Scheibe zweimal in PBS waschen. Schneiden Sie die Membran wieder vorsichtig mit einem Skalpell von der Einlage ab, ohne die Scheibe zu stören. Legen Sie dann die Membranhalterung mit einer Pinzette auf einen Objektträger und lassen Sie die organotypische Scheibe darauf ruhen.

Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Einhängemedium auf die Scheibe. Legen Sie einen Deckglas vorsichtig und ohne jegliche Kraft direkt in Kontakt mit dem Gewebe. Befestigen Sie anschließend das Deckglas mit einer dünnen Schicht Nagellack.

Diese Abbildung zeigt die biotische Abgabe von fluoreszierender proteinkodierter DNA in den organotypischen Schnitt einer sechs Wochen alten Maus. Wie hier zu sehen ist, zeigt ein Bikini-Neuron mit einer bemerkenswerten dendritischen Öffnung, das sich an der Schnittstelle zwischen der Bikini-Schicht und der molekularen Schicht des Kleinhirns befindet, eine ausgeprägte Markierung nach transienter biotischer Transfektion mit P-E-G-F-P-N one. Hier ist eine stärkere Vergrößerung der Dendriten mit den Stacheln, und hier ist eine Parametallzelle, die in etwa einer Region des Hippocampus gefunden wurde.

Nach der biotischen Verabreichung von PDS Red FP beschichteten Goldnanopartikeln Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur wenigen Stunden über einen Zeitraum von drei bis vier Tagen nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Mit anderen Methoden wie der konfokalen Mikroskopie lassen sich zusätzliche Fragen beantworten, etwa wie bestimmte Neuronen mit benachbarten Regionen verbunden sind.