Name: Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von Wnt5a Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Zebrafisch-Modell der polyzystischen Nierenerkrankung durch Knockdown von wnt5a mittels Morpholino-Injektion in Tg(wt1b:GFP)-Embryonen erstellt wird. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Nierenzysten.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH (DK093625 an LH und DK069909 und DK047757 zu JHL) und die VA (Merit Award I01BX000820 zu JHL). Wir möchten Dr. Michael Pack und Dr. Jie er für die Bereitstellung wesentlicher Unterstützung danken an der Universität von Pennsylvania Zebrafisch-Core.

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Zebrafisch-Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Eastern Virginia Medical School zugelassen. 1. Morpholino Vorbereitung <ol><li> Design und Synthese Übersetzung blockier (Aug-) und Spleiß-Hemmung (Spleiß-) Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotide für das Gen von Interesse nach Herstellerangaben (1A). Bitte lesen Sie Informationen des Herstellers, die in Tabelle 1. HINWEIS: MOs werden als lyophilisierte Aktien in Glasflaschen geliefert. </li><li> Hinzufügen hochwertigen sterilem Wasser auf die Glasflasche zu resuspendieren MOs zu einer Endkonzentration von 25 ug / ul. Stellen Sie sicher, dass das Oligonukleotid vollständig gelöst ist. Wenn einige solide bleibt, heizen das Fläschchen mit dem Lager Oligonukleotid-Lösung bei 65 ° C für 5 bis 10 Minuten und kurz vortexen. </li><li> Bewahren Sie die MO-Stammlösung bei RT. Lagern Sie diese nicht bei 4 ° C oder -20 °; C, weil geringere Temperaturen können dazu führen, die MO-Oligonukleotids an der Behälterwand zu binden. Messen Sie die Konzentration der Stammlösung mit einem Spektralphotometer jedes Mal eine neue MO-Stammlösung hergestellt wird (siehe Tabelle 1 beziehen). </li><li> Bereiten Sie die MO-Arbeitslösung am Tag der Injektion durch Verdünnung der Stammlösung mit hochgradigen sterilem Wasser auf die gewünschte Dosis. Mit 0,5% Phenol-Rot zu einer Konzentration von 0,05% zu erreichen. Wenn Sie beispielsweise 5 ul Arbeitslösung mit einer Konzentration von 15 ng / nL, fügen 3 ul MO Stammlösung und 0,5 ul 0,5% Phenol-rot bis 1,5 ul Wasser. HINWEIS: Mit dieser Arbeitskonzentration, jeder Tropfen (500 pl) der Injektion enthält 7,5 ng MO und zwei Tropfen enthalten 15 ng von MO. </li></ol> 2. Herstellung der Einspritzvorrichtung <ol><li> Kauf Glas vorgezogen Nadeln (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Alternativ ziehen Sie das Glas Injektionsnadel with eine Nadel Magnet. </li><li> Schalten Sie den Kompressor und stellen Sie die Druckeinstellung auf 50 psi. Schalten Sie den Binokular-Lichtquelle und Pico Mikroeinspritzpumpe und passen Sie die Einstellungen wie folgt: Halten Druck 20 psi, werfen Druck 10 psi, Zeit-Wert von 2,5 und 100 &amp; mgr; s Palette von Gating. </li><li> Legen Sie das Glas vor, zog Nadel mit 5 ul der Injektionslösung und setzen Sie die Nadel in vertikaler Position mit der Spitze nach unten. Warten Sie, bis die gesamte Lösung der Nadelspitze ohne sichtbare Luftblasen erreicht. Setzen Sie den Nadelhalter in einer passenden Position neben dem Mikroskop und legen Sie die Glasnadel in die Halterung. Ist der Einspritzwinkel um 45 Grad. </li><li> Bringen Sie die Nadelspitze in Sicht unter dem Mikroskop, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnsten Bereich der Spitze. Brechen Sie die Nadelspitze mit feinen Spitze Pinzette. </li><li> Legen Sie ein Lineal und ein Rohr oder Schlauch mit Innendurchmesser von 0,15 mm nebeneinander unter dem Mikroskop;Injizieren der Lösung in ein Ende des Kapillarröhrchens einen Flüssigkeitssäule bilden. Stellen Sie die Auswurfzeit alle 17 Tropfen je 1 mm Länge Flüssigkeitssäule zu erreichen, wird das Volumen jeder Tropfen ist 1 nl (Tropfenvolumen = π x Radius 2 x Länge (der Flüssigkeitssäule) / count (Tropfen). HINWEIS: Ein Tropfen mit einem Durchmesser von 0,1 mm ergibt einen Injektionsvolumen von etwa 500 pl (Tropfenvolumen = 4/3 x π x Radius 3). </li></ol> 3. Herstellung der befruchteten Zebrafischembryonen und Injektion mit Morpholinos <ol><li> Transgenen Zebrafisch Zuchtpaare nach den veröffentlichten Protokollen für Standard Zebrafischhaltung und Wartung: bis Tg (GFP wt1b) ein. Sammeln Embryonen nach Naturbrut, und halten sie in einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser gefüllt (5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Starten MO Injektion sofort 13. Überwachen Embryo Morphologie unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, MO Injektion ist im Ein-Zell-Stadium, oder spätestens am Vierzellstadium. <ol><li> Transfer der Embryonen in einen 10-cm-Petrischale mit Agar Tröge keilförmig. Saugen Sie das zusätzliche E3 Wasser und drücken Sie vorsichtig die Embryonen in die Tröge. </li><li> Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette 1-Zell-Stadium Embryos unter dem Binokular visualisieren. Durchdringen die Chorion und dann das Eigelb, ein oder zwei Tropfen MO in den Dotter (1 Tropfen = 500 pl) zu injizieren. Übertragen Sie die injizierten Embryonen zu einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser und Inkubation bei 28,5 ° C. </li></ol></li><li> Nach den Injektionen, entfernen Sie die toten Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie die E3 Wasser in der Schale alle 24 bis 48 Stunden. </li></ol> 4. Phänotyp Rettungsversuche <ol><li> Auszuwählen, die ein Ortholog von einer anderen Spezies, die eine andere primäre Basispaarstruktur (üblicherweise 3-7 Basenpaar Mismatches) aufweist und daher beständig gegen das MO, zur Rettung. Beispielsweise wird in diesem Experiment haben wir unsMaus weil die Maus Wnt5a mRNA-Sequenz unterscheidet sich von der Zebrafisch-Sequenz. </li><li> Entwerfen eines Primers mit der Vorwärtsprimer beginnend beim Translationsstelle und der Reverse-Primer in der Nähe des Endes der mRNA codierende Region eingestellt. Hinzufügen eines T7-Promotorsequenz am 5&#39;-Ende des Vorwärtsprimer-Sequenz. In diesem Experiment verwendeten wir die folgenden Primersequenzen; vorwärts: 5&#39;-taa tac gac tca cta Tag GGA cta tga tgc tgc tga agc tga a- 3 &#39;und umgekehrt: 5&#39;-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3&#39;. </li><li> Durchführen einer 50 ul Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Primersatz (0,5 &amp; mgr; M von jedem Primer) vorstehend ausgebildet und 0,1 &amp; mgr; g Matrizen-DNA, die das Maus Wnt5a cDNA-Sequenz mit der folgenden PCR-Programm: 1 Zyklus bei 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen von 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); und abschließende Extension bei 72 ° C für 7 min. </li><li> Nach Abschluss ter Zyklus ausführen 2 ul des PCR-Produkts auf 1% Agarosegel, um sicherzustellen, dass die Band die richtige Größe. Man reinige das PCR-Produkt mit einem PCR-Purification-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Überprüfen DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Speicherung des gereinigten PCR-Produkts bei -20 ° C oder direkt in verkappter RNA Transkription Verwendung im nächsten Schritt. </li><li> Synthetisieren in vitro mRNA mit Cap mit einem verkappten RNA-Synthese-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie die mRNA in 20 ul RNase freies Wasser und Bestimmung der Konzentration. Aliquot der RNA und bei -80 ° C. </li><li> Am Tag der Injektion, bereiten eine Arbeitslösung der mRNA mit RNase frei sterilem Wasser. Man beachte, daß 40 pg ist im allgemeinen die höchste RNA Dosis, bei der unspezifische oder toxische Wirkung des RNA treten nicht auf. Halten Sie die Arbeitslösung auf Eis. Spritzen Sie die Embryos mit MO und dann die Rettung mRNA, oder Co-spritzen beide zusammen. Wenn beispielsweise die Konzentration der mRNA prepared in Schritt 4.5 ist 0,6 ug / ul, fügen 0,67 ul mRNA (0,4 ug) bis 4,33 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 0,08 ug / ul zu ergeben, und ein Tropfen (500 pl) jeder Injektion enthält 40 pg mRNA. Bereiten MO, wie in Schritt 3 beschrieben. </li></ol> 5. Vorbereitung der injizierten Embryonen für Fluorescent Imaging <ol><li> Nach der Inkubation bei 28,5 ° CO / N, fügen Sie 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem E3 Wasser Melanisierung, die Beobachtung der Vorniere Struktur mittels Fluoreszenzmikroskopie wirkt verhindern. Allerdings PTU nicht vor Gastrulation abgeben, weil es die frühe embryonale Entwicklung betrifft. </li><li> Bei 48 HPF, manuell dechorionate die Embryonen mit feinen Pinzette. Nehmen Sie Bilder von 48 und 72 HPF Embryonen unter einem Licht Dissektionsmikroskop. Hinweis: Diese Bilder sind ohne Narkose entnommen werden. </li><li> Etwa 10 Minuten vor der unter dem Fluoreszenzmikroskop Bildgebung, betäuben die Embryonen, indem Sie sie in10 cm Petrischale mit 160 ug / ml gepufferte Tricaine. Warten Sie 5-10 Minuten, und dann locker am Zebrafisch zu bestätigen, dass sie sich nicht bewegen und damit die Narkose wirkt. </li><li> Nachdem die Embryos betäubt werden, montieren sie in 3% Methylcellulose und orientieren sie in Bauchlage unter einem Binokular (siehe Tabelle 1). </li><li> Beachten Sie die Vorniere Struktur unter einem Fluoreszenzmikroskop (siehe auch Tabelle 1) und nehmen Sie Bilder mit unterschiedlicher Vergrößerung (10X und 20X). </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
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<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der führenden Ursachen für end-stage renal Krankheit beim Menschen und wird durch fortschreitende Zysten, Nieren Erweiterung und abnorme Entwicklung Röhrchen 14 aus. Autosomal dominante PKD (ADPKD) ist eine Erbkrankheit, bei der die Mutation von entweder PKD1 kodiert Polycystin-1 (PC1) oder PKD2, Polycystin-2 (PC2) kodiert, führt zu Zystennieren. Viele andere Gene, vor allem Proteine, die in der primären Zilien gefunden codiert, wird angenommen, dass bei der Entwi...

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen wurden allgemein als Modell für die Untersuchung der Nierenentwicklung und polyzystische Nierenerkrankung verwendet. Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell: Die Durchführbarkeit Studium genetischen Wechselwirkungen, die Fähigkeit, Antisense-Morpholino (MO) für die Proteinzuschlags verwenden, die Möglichkeit, schnell zu testen große Anzahl von Embryos und die Betrachtung Organ Phänotypen lebenden Larven 1. Die Vorniere ist die erste Niere bei Wirbeltieren entwickeln und ist funktional in Zebrafisch-Larven 2. Die Struktur der Zebrafisch pronephros ist relativ einfach im Vergleich zu den Säuger Metanephros, um die dritte und letzte Niere in Säugetieren zu entwickeln. Nephronanalog ist die Arbeitseinheit der Niere, wobei jede humane Nieren enthaltend zwischen 500.000-1.000.000 Nephronen 3,4 und jeder Maus Niere mit ungefähr 13.000 Nephronen 5, was es schwierig macht, einzelne Nephron Struktur beobachten in Mensch oder Maus Nieren. Der Zebrafisch besitzt nur zwei Nephronen und jedes Zebrabärbling Nephron enthält alle Hauptkomponenten im Glomerulus und Tubuli von Mäusen und Menschen und 6 ähnlich speziellen Nierenzelltypen gefunden. Im Vergleich zu anderen Wirbeltiermodellen wie Xenopus, Zebrafisch Nephron mehr ähnelt die Säuger Nephron weil es ein geschlossenes System 7 hat. In den letzten Jahren hat sich die Zebrafisch wurde sequenziert, was die breite Einführung von genetischen Werkzeugen umfangreichen Mutanten Ressourcen und Sammlungen von transgenen Reporterlinien in Zebrafisch-Modelle. Die Zebrafisch Vorniere bildet sich zwischen 12 bis 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und kann leicht in den durchsichtigen Embryos visualisiert werden. Die Wilms-Tumor Protein WT1 ist ein wesentlicher Faktor für die Nierenentwicklung. Transgenic Zebrafischlinien grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Promotors wt1b Tg Ausdruck (wt1b: GFP) zeigen GFP expression speziell in pronephric Regionen in Zebrafischembryonen, ab 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), eine autosomal-rezessive zystischen Nierenerkrankungen, wird durch Mutationen der Gene NPHP 9 verursacht. NPHP4 durch Morpholino Knockdown verursacht Zystenbildung in der Tg (wt1b: GFP). Fisch 10 Daher ist dieser transgene Fische ein geeignetes Modell zur Beobachtung Nieren Strukturen und Zystenbildung während der Nierenentwicklung. Wichtig ist, dass der Einfluss von Modulatoren der Nierenentwicklung Verwendung dieses Stammes in einer Zeit und Arbeit effizient untersucht werden. Unser Papier beschreibt die Verwendung von Tg (wt1b: GFP) Fisch als Vorbild zu Nierenzystenbildung nach Genmodulation visualisieren. Wir benutzten Start- und Spleißstellen Antisense-MOs um knock down der Wnt5a Gen in Zebrafisch. Wnt5a ist eine nicht-kanonische sekretierte Glykoprotein des Wnt-Familie, die in der Entwicklung von verschiedenen Organen und postnatalen zellulären eine wichtige Rolle spielt,Funktion 11. Wnt5a wirkt durch nicht-kanonischen Wnt-Signalwege, einschließlich der planaren Zellpolarität (PCP) Weg, die gefunden wurde, um eine Rolle in orientierte Zellteilung während der Nierentubuli Dehnung zu spielen. Wnt5a regelt die Wnt / PCP-Weg, indem ein Komplex mit dem Rezeptor ähnliche Tyrosinkinase (Ryk), die weiter transduziert Wnt5a Signalisierung durch Bildung eines Komplexes mit dem VANGL planaren Zellpolarität protein 2 (Vangl2), wodurch Vangl2 Stabilität 12 fördern. Defekte in der PCP-Weg kann in zufälliger Zellteilung verursachen und eine Nierenzystenbildung. Wir nutzten die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch Linie zu Nierenzystenbildung folgenden Wnt5a Zuschlags beobachten. Die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch-Modell ermöglicht die Live-Darstellung und zeitnahe Beobachtung der Nierenstruktur. Nach Wnt5a Zuschlags wurde Nierenzystenbildung gefunden, beginnend bei 24 HPF; bei 72 HPF, könnte Zysten in den Glomeruli und den proximalen Tubuli gefunden werden. Diese Methode könnte auch zu s verwendet werdencreen andere Gene, die Nierenzystenbildung verursachen könnten.

<table><tbody><tr><td>0,5% Phenol-Rot</td><td></td><td>Sigma P0290</td><td>Farbindikator für die Injektion</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(kundenspezifisch)</td><td>Kundenspezifisch entwickelt für das Gen von Interesse</td></tr><tr><td>Vorgezogene Nadel</td><td>Tritech Research MINJ-PP</td><td></td><td>Wenn eine große Menge an Nadel benötigt wird, können Sie auch einen Nadelabzieher erwerben und die Nadel im Labor</td></tr><tr><td>vorbereiten T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Für die In-vitro-Transkription zur Herstellung von gekapselter mRNA für das Rettungsexperiment</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Zur Vorbeugung der Melanisierung</td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Auch Ethyl-3-aminobenzoat genannt, für die Anästhesie von Zebrafischen</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Für die Position des Zebrafisches&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Zur Aufreinigung von PCR-Produkten für die Kappen-RNA-Synthese.</td></tr><tr><td>dNTP-Mischung</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>Für PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>Für PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Zur Messung der Morpholino- und RNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Luftkompressor</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Luftquelle für die Injektion</td></tr><tr><td>Pico Mikroinjektionspumpe</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Andere Arten von Mikroinjektionssystemen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Mikrohersteller</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Rechtshänder (MMJL für Linkshänder)</td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Zum Halten der Nadel für die Mikromanipulation</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>Feine chirurgische Werkzeuge</td><td>11253-20</td><td>Zum Abbrechen der Nadelspitze</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>Zur Beobachtung und Bildgebung von Zebrafischembryonen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>Für die Bildgebung von Zebrafisch-Pronephros</td></tr><tr><td>Kapillarrohr (I.D. 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Zur Messung des Volumens jedes injizierten Tropfens</td></tr></tbody></table>

eine mögliche zebrafisch-modell der kidney disease: knockdown von wnt5a ursachen zysten in zebrafisch-nieren

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der häufigsten Ursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium, eine verheerende Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Die molekularen Mechanismen, die zur Zystenbildung bei PKD führen, sind noch etwas unklar, aber es wird angenommen, dass viele Gene beteiligt sind. Wnt5a ist ein nicht-kanonisches Glykoprotein, das eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen reguliert. Wnt5a wirkt über den planaren Zellpolaritätsweg (PCP), der die orientierte Zellteilung während der renalen tubulären Zellverlängerung reguliert. Es wurde festgestellt, dass Defekte des PCP-Signalwegs die Bildung von Nierenzysten verursachen. Unsere Arbeit beschreibt eine Methode zur Entwicklung eines Modells für zystische Nierenerkrankungen im Zebrafisch durch Knockdown des wnt5a-Gens mit wnt5a-Antisense-Morpholino (MO)-Oligonukleotiden. Tg(wt1b:GFP) transgene Zebrafische wurden verwendet, um die Nierenstruktur und Nierenzysten nach dem wnt5a-Knockdown sichtbar zu machen. Es wurden zwei unterschiedliche Antisense-MOs (AUG - und Spleißstelle) verwendet, die beide zu einem Curly Tail Down-Phänotyp und zur Zystenbildung nach wnt5a-Knockdown führten. Die Injektion von Maus-Wnt5a-mRNA, die aufgrund eines Unterschieds in der primären Basenpaarstruktur resistent gegen die MOs ist, rettete den abnormalen Phänotyp und zeigte, dass der Phänotyp nicht auf "Off-Target"-Effekte des Morpholino zurückzuführen war. Diese Arbeit unterstützt die Validität der Verwendung eines Zebrafischmodells zur Untersuchung der wnt5a-Funktion in der Niere.

Wnt5a niederschlagen wurde durch die Einführung Übersetzung blockieren MO erreicht (August-MO) oder Exon / Intron-Grenze Splice-MO (Splice-MO) auf Zebrafischembryonen an dem einen Zellstadium. Die August-MO zielt auf das Start-Codon und daher hemmt sowohl von Müttern und zygotischen Wnt5a Nachricht. Der Spleiß-MO zielt die dritte Spleißdonorstelle und hemmt nur die zygotischen Transkript Wnt5a (1A). Die Aug- und Spleiß- morphants phenocopied seitig mit mehreren Mängeln, darunter Ringel...

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung eines möglichen Zebrafischmodells der polyzystischen Nierenerkrankung. Wir verwendeten Tg(wt1b:GFP)-Fische, um die Nierenstruktur sichtbar zu machen. Der Knockdown von wnt5a erfolgte durch Morpholino-Injektion. Die Bildung pronephrischer Zysten nach wnt5a-Knockdown wurde bei diesem GFP-transgenen Zebrafisch beobachtet.

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von Wnt5a Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein mögliches Zebrafischmodell für die polyzystische Nierenerkrankung zu generieren. Dies wird durch die Injektion von Morph gegen Wind five A in transgene WT one BGFP-Zebrafischembryonen im Einzellstadium erreicht. Als nächstes wird ein Rettungsexperiment durch Mikroinjektion von Maus Wint fünf A Mr.Nna mit der Wint fünf a Morpho durchgeführt.Dann werden die injizierten Embryonen betäubt und 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung eingebettet, um die Nierenstruktur und die Zystenbildung zu überwachen. Nach dem Knockdown von Wind fünf A zeigen die Ergebnisse, dass der Knockdown von Wind fünf A bei transgenen WT one BG FP Zebrafischen eine Bildung von Nierenzysten in Bauchlage verursacht, basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie von nierenanfälligen Strukturen. Die Implikationen dieser technischen Entwicklung erstrecken sich auf die Erstellung eines Modells für Nierenerkrankungen, da die Transparenz des Fischembols, die durch die Verwendung von nierenspezifischem transgenem Fluorprotein abgedeckt wird, einen direkten Blick auf die Nierenstrukturen in einem AL-Organismus ermöglicht.Diese Methode kann einen Einblick in Gewinn fünf geben, einen Knockdown, der die Bildung von Nierenzysten bei Zebrafischen verursacht. Es kann auch angewendet werden, um viele andere Gene zu testen, die im Verdacht stehen, die Bildung von Nierenzysten zu verursachen. Dieses Protokoll ist einfach und weniger zeitaufwändig.Nachdem Sie die Morphos gemäß den Anweisungen des Herstellers entworfen und synthetisiert haben, fügen Sie den Glasflaschen hochwertiges steriles Wasser hinzu, um sie gründlich auf eine Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Mikroliter zu resuspendieren. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration zu messen, und lagern Sie die Stammlösung am Tag der Injektion bei Raumtemperatur, verwenden Sie hochwertiges steriles Wasser, um die Morphos auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen, und bei 0,5 % Phenolrot auf eine Endkonzentration von 0,05 %Als nächstes schalten Sie den Luftkompressor ein und stellen Sie den Druck auf 50 si ein. Schalten Sie dann die Lichtquelle des Präpariermikroskops und die Pico-Mikroinjektionspumpe ein und passen Sie die Einstellungen wie folgt an.Verwenden Sie fünf Mikroliter Injektionslösung, um eine vorgezogene Glasnadel zu laden, und platzieren Sie die Nadel in einer vertikalen Position mit einer Spitze nach unten, wenn keine sichtbaren Luftblasen vorhanden sind, und führen Sie die Nadel in den Halter ein. Stellen Sie den Einspritzwinkel auf 45 Grad ein. Bringen Sie die Nadelspitze unter dem Mikroskop hoch vom Tisch entfernt in den Blick und fokussieren Sie sich auf den dünnsten Bereich der Spitze.Brechen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Nadel ab. Tipp: Legen Sie ein Kapillarrohr mit einem Innendurchmesser von 0,15 Millimetern unter das Mikroskop. Injiziere die Lösung in ein Ende.Einstellen der Ausstoßzeit an der pico Mikroinjektionspumpe, bis 17 Tropfen eine einen Millimeter lange Flüssigkeitssäule bilden. Damit entspricht das Volumen eines jeden Tropfens einem Nanoliter. Aufbau von transgenen WT one BG FP Zebrafischzuchtpaaren nach veröffentlichten Protokollen für die Standardhaltung und -haltung von Zebrafischen.Nach einem natürlichen Laichen werden die Embryonen entnommen und in eine Petrischale mit E drei Wasser umgefüllt. Übertragen Sie die Embryonen zwischen dem Ein- und Vierzellstadium in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit keilförmigen Schneckentrögen. Nach dem Aspirieren des Mediums drücken Sie die Embryonen vorsichtig in die Tröge. Richten Sie die Embryonen unter dem Präpariermikroskop aus, um die Zelle sichtbar zu machen.Stechen Sie dann mit der Injektionsnadel in das Corian und dann in das Eigelb ein, um ein oder zwei Tropfen Morpho in das Eigelb zu injizieren. Die injizierten Embryonen werden in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit E drei Wasser gegeben und bei 28,5 Grad Celsius inkubiert. Notieren Sie die Anzahl der lebensfähigen injizierten Embryonen, um ein Phänotyp-Rettungsexperiment durchzuführen.Wählen Sie einen Ortholog aus einem Gen einer anderen Spezies, das eine andere primäre Basenpaarstruktur aufweist, die daher resistent gegen das Morpho ist. In diesem Beispiel wurde die Maus fünf A gewählt. Entwerfen Sie ein Primer-Set, wobei der Forward-Primer an der Translationsstartstelle und der Reverse-Primer nahe dem Ende der MR-NA-Coderegion beginnt.Fügen Sie eine T-Sieben-Promotorsequenz am fünfprimalen Ende der vorderen Primersequenz mit den Primern und einem Mikrogramm Template-DNA hinzu, die den Mauswind enthält. Fünf A-C-D-N-A-Sequenzen. Richten Sie eine 50-Mikroliter-PCR-Reaktion ein und führen Sie sie mit dem hier gezeigten Programm aus.Nachdem Sie die Größe des PCR-Produkts überprüft, es gereinigt und die Konzentration überprüft haben, verwenden Sie ein gedeckeltes RNA-Synthesekit, um in vitro gedeckelte mRNA zu synthetisieren. Verwenden Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers 20 Mikroliter RNAs freies Wasser, um die MR NA zu verdünnen und die Konzentration aliquot zu bestimmen und die RNA am Tag der Injektion bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Bereiten Sie eine Arbeitslösung des MR NA vor, die eine Dosis von 40 Pikogramm oder weniger liefert, um unspezifische oder toxische Wirkungen auf den Embryo zu vermeiden.Halten Sie die MNA-Lösung auf Eis, injizieren Sie Morphosen und dann mRNA in die Embryonen oder injizieren Sie die Lösungen co. Entnehmen Sie am nächsten Tag tote Embryonen und überprüfen Sie, ob die Embryonen Blähungen unterzogen wurden. Fügen Sie dann 0,003% Endphenyl THREA oder PTU zu den drei Wasser E hinzu, um eine Melone 48 Stunden nach der Befruchtung zu verhindern.Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen manuell zu beschichten, bevor Sie ein Präpariermikroskop verwenden, um sofort Bilder aufzunehmen, und betäuben Sie die Embryonen 72 Stunden nach der Befruchtung, etwa 10 Minuten vor der Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie sie in eine 10 Zentimeter große Petrischale legen, die 160 Mikrogramm pro Mikroliter gepufferte Trica enthält. Verwenden Sie 3%ige Methylcellulose, um die Embryonen zu montieren, und richten Sie sie unter einem Präpariermikroskop in Bauchlage aus. Verwenden Sie dann ein Bild mit 10-facher und 20-facher Vergrößerung.Die Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop wickeln fünf A-A-Knockdown wurde durch Einführung von Translationsblocking-Morpho, auch UG-Morpho oder Exon-Intro-Grenz-Spleiß-Morpho genannt, auch Spleiß-Morpho genannt, bei Zebrafisch-Embryonen erreicht. Im Ein-Zell-Stadium zielt das A-UG-Morpho auf das Startcodon ab und hemmt daher sowohl die mütterliche als auch die zygotische Win-Five-a-Expression. Der Spleißmorph zielt auf die dritte Spleißdonorstelle ab und hemmt nur das zygotische Transkript von win fünf A. Wie hier gezeigt, kopierten sich das A-UG- und das Spleißmorphin-Phänotyp gegenseitig mit mehreren Defekten, einschließlich Curly Tail, Down Body Axis und Perikardödem.Diese Abbildung zeigt, dass die Maus fünf Mal eine mRNA den Morph-Phänotyp teilweise rettet, was zeigt, dass dies nicht auf hier gezeigte Off-Target-Effekte zurückzuführen ist. Der transgene WT one BGFP-Fisch exprimiert GFP, das durch den WT one B-Promotor angetrieben wird, und skizziert die Profic-Struktur. Die Fische zeigten eine glomeruläre Zystenbildung nach Wind fünf, einem Knockdown 48 Stunden nach der Befruchtung.Die Kontrollfische, denen nur Phenolrot injiziert wurde, zeigten eine normale Entwicklung in Bauchlage und bildeten ein verschmolzenes glomeruläres Glomerular in U-Form mit Tubuli, die sich 72 Stunden nach der Befruchtung seitlich erstrecken. Die glomerulären Strukturen entwickelten sich mit Gefäßschlingen weiter und sowohl die A-UG- als auch die Spleißmorph-injizierten Embryonen entwickelten Zysten in den Glomeruli und proximalen Tuben, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. HNE-Färbung der transversalen histologischen Schnitte 72 Stunden nach der Befruchtung zeigten morante Embryonen Zystenbildung, gestörte glomeruläre Strukturen und erweiterte Nierenröhren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein mögliches gery-Phasenmodell der zystischen Nierenerkrankung durch Knockdown der Windalterung entwickeln und die Systembildung mit der Grippeberichtsgesichtslinie beobachten können.Sobald nachgewiesen ist, dass eine Genmutation zur Bildung von Nierenzysten beim Zebrafisch führt, können weitere Experimente durchgeführt werden, um die detaillierten Mechanismen der Nierenzystenbildung zu untersuchen.

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