Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von Wnt5a Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein mögliches Zebrafischmodell für die polyzystische Nierenerkrankung zu generieren. Dies wird durch die Injektion von Morph gegen Wind five A in transgene WT one BGFP-Zebrafischembryonen im Einzellstadium erreicht. Als nächstes wird ein Rettungsexperiment durch Mikroinjektion von Maus Wint fünf A Mr.Nna mit der Wint fünf a Morpho durchgeführt.

Dann werden die injizierten Embryonen betäubt und 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung eingebettet, um die Nierenstruktur und die Zystenbildung zu überwachen. Nach dem Knockdown von Wind fünf A zeigen die Ergebnisse, dass der Knockdown von Wind fünf A bei transgenen WT one BG FP Zebrafischen eine Bildung von Nierenzysten in Bauchlage verursacht, basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie von nierenanfälligen Strukturen. Die Implikationen dieser technischen Entwicklung erstrecken sich auf die Erstellung eines Modells für Nierenerkrankungen, da die Transparenz des Fischembols, die durch die Verwendung von nierenspezifischem transgenem Fluorprotein abgedeckt wird, einen direkten Blick auf die Nierenstrukturen in einem AL-Organismus ermöglicht.

Diese Methode kann einen Einblick in Gewinn fünf geben, einen Knockdown, der die Bildung von Nierenzysten bei Zebrafischen verursacht. Es kann auch angewendet werden, um viele andere Gene zu testen, die im Verdacht stehen, die Bildung von Nierenzysten zu verursachen. Dieses Protokoll ist einfach und weniger zeitaufwändig.

Nachdem Sie die Morphos gemäß den Anweisungen des Herstellers entworfen und synthetisiert haben, fügen Sie den Glasflaschen hochwertiges steriles Wasser hinzu, um sie gründlich auf eine Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Mikroliter zu resuspendieren. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration zu messen, und lagern Sie die Stammlösung am Tag der Injektion bei Raumtemperatur, verwenden Sie hochwertiges steriles Wasser, um die Morphos auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen, und bei 0,5 % Phenolrot auf eine Endkonzentration von 0,05 %Als nächstes schalten Sie den Luftkompressor ein und stellen Sie den Druck auf 50 si ein. Schalten Sie dann die Lichtquelle des Präpariermikroskops und die Pico-Mikroinjektionspumpe ein und passen Sie die Einstellungen wie folgt an.

Verwenden Sie fünf Mikroliter Injektionslösung, um eine vorgezogene Glasnadel zu laden, und platzieren Sie die Nadel in einer vertikalen Position mit einer Spitze nach unten, wenn keine sichtbaren Luftblasen vorhanden sind, und führen Sie die Nadel in den Halter ein. Stellen Sie den Einspritzwinkel auf 45 Grad ein. Bringen Sie die Nadelspitze unter dem Mikroskop hoch vom Tisch entfernt in den Blick und fokussieren Sie sich auf den dünnsten Bereich der Spitze.

Brechen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Nadel ab. Tipp: Legen Sie ein Kapillarrohr mit einem Innendurchmesser von 0,15 Millimetern unter das Mikroskop. Injiziere die Lösung in ein Ende.

Einstellen der Ausstoßzeit an der pico Mikroinjektionspumpe, bis 17 Tropfen eine einen Millimeter lange Flüssigkeitssäule bilden. Damit entspricht das Volumen eines jeden Tropfens einem Nanoliter. Aufbau von transgenen WT one BG FP Zebrafischzuchtpaaren nach veröffentlichten Protokollen für die Standardhaltung und -haltung von Zebrafischen.

Nach einem natürlichen Laichen werden die Embryonen entnommen und in eine Petrischale mit E drei Wasser umgefüllt. Übertragen Sie die Embryonen zwischen dem Ein- und Vierzellstadium in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit keilförmigen Schneckentrögen. Nach dem Aspirieren des Mediums drücken Sie die Embryonen vorsichtig in die Tröge. Richten Sie die Embryonen unter dem Präpariermikroskop aus, um die Zelle sichtbar zu machen.

Stechen Sie dann mit der Injektionsnadel in das Corian und dann in das Eigelb ein, um ein oder zwei Tropfen Morpho in das Eigelb zu injizieren. Die injizierten Embryonen werden in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit E drei Wasser gegeben und bei 28,5 Grad Celsius inkubiert. Notieren Sie die Anzahl der lebensfähigen injizierten Embryonen, um ein Phänotyp-Rettungsexperiment durchzuführen.

Wählen Sie einen Ortholog aus einem Gen einer anderen Spezies, das eine andere primäre Basenpaarstruktur aufweist, die daher resistent gegen das Morpho ist. In diesem Beispiel wurde die Maus fünf A gewählt. Entwerfen Sie ein Primer-Set, wobei der Forward-Primer an der Translationsstartstelle und der Reverse-Primer nahe dem Ende der MR-NA-Coderegion beginnt.

Fügen Sie eine T-Sieben-Promotorsequenz am fünfprimalen Ende der vorderen Primersequenz mit den Primern und einem Mikrogramm Template-DNA hinzu, die den Mauswind enthält. Fünf A-C-D-N-A-Sequenzen. Richten Sie eine 50-Mikroliter-PCR-Reaktion ein und führen Sie sie mit dem hier gezeigten Programm aus.

Nachdem Sie die Größe des PCR-Produkts überprüft, es gereinigt und die Konzentration überprüft haben, verwenden Sie ein gedeckeltes RNA-Synthesekit, um in vitro gedeckelte mRNA zu synthetisieren. Verwenden Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers 20 Mikroliter RNAs freies Wasser, um die MR NA zu verdünnen und die Konzentration aliquot zu bestimmen und die RNA am Tag der Injektion bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Bereiten Sie eine Arbeitslösung des MR NA vor, die eine Dosis von 40 Pikogramm oder weniger liefert, um unspezifische oder toxische Wirkungen auf den Embryo zu vermeiden.

Halten Sie die MNA-Lösung auf Eis, injizieren Sie Morphosen und dann mRNA in die Embryonen oder injizieren Sie die Lösungen co. Entnehmen Sie am nächsten Tag tote Embryonen und überprüfen Sie, ob die Embryonen Blähungen unterzogen wurden. Fügen Sie dann 0,003% Endphenyl THREA oder PTU zu den drei Wasser E hinzu, um eine Melone 48 Stunden nach der Befruchtung zu verhindern.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen manuell zu beschichten, bevor Sie ein Präpariermikroskop verwenden, um sofort Bilder aufzunehmen, und betäuben Sie die Embryonen 72 Stunden nach der Befruchtung, etwa 10 Minuten vor der Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie sie in eine 10 Zentimeter große Petrischale legen, die 160 Mikrogramm pro Mikroliter gepufferte Trica enthält. Verwenden Sie 3%ige Methylcellulose, um die Embryonen zu montieren, und richten Sie sie unter einem Präpariermikroskop in Bauchlage aus. Verwenden Sie dann ein Bild mit 10-facher und 20-facher Vergrößerung.

Die Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop wickeln fünf A-A-Knockdown wurde durch Einführung von Translationsblocking-Morpho, auch UG-Morpho oder Exon-Intro-Grenz-Spleiß-Morpho genannt, auch Spleiß-Morpho genannt, bei Zebrafisch-Embryonen erreicht. Im Ein-Zell-Stadium zielt das A-UG-Morpho auf das Startcodon ab und hemmt daher sowohl die mütterliche als auch die zygotische Win-Five-a-Expression. Der Spleißmorph zielt auf die dritte Spleißdonorstelle ab und hemmt nur das zygotische Transkript von win fünf A. Wie hier gezeigt, kopierten sich das A-UG- und das Spleißmorphin-Phänotyp gegenseitig mit mehreren Defekten, einschließlich Curly Tail, Down Body Axis und Perikardödem.

Diese Abbildung zeigt, dass die Maus fünf Mal eine mRNA den Morph-Phänotyp teilweise rettet, was zeigt, dass dies nicht auf hier gezeigte Off-Target-Effekte zurückzuführen ist. Der transgene WT one BGFP-Fisch exprimiert GFP, das durch den WT one B-Promotor angetrieben wird, und skizziert die Profic-Struktur. Die Fische zeigten eine glomeruläre Zystenbildung nach Wind fünf, einem Knockdown 48 Stunden nach der Befruchtung.

Die Kontrollfische, denen nur Phenolrot injiziert wurde, zeigten eine normale Entwicklung in Bauchlage und bildeten ein verschmolzenes glomeruläres Glomerular in U-Form mit Tubuli, die sich 72 Stunden nach der Befruchtung seitlich erstrecken. Die glomerulären Strukturen entwickelten sich mit Gefäßschlingen weiter und sowohl die A-UG- als auch die Spleißmorph-injizierten Embryonen entwickelten Zysten in den Glomeruli und proximalen Tuben, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. HNE-Färbung der transversalen histologischen Schnitte 72 Stunden nach der Befruchtung zeigten morante Embryonen Zystenbildung, gestörte glomeruläre Strukturen und erweiterte Nierenröhren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein mögliches gery-Phasenmodell der zystischen Nierenerkrankung durch Knockdown der Windalterung entwickeln und die Systembildung mit der Grippeberichtsgesichtslinie beobachten können.

Sobald nachgewiesen ist, dass eine Genmutation zur Bildung von Nierenzysten beim Zebrafisch führt, können weitere Experimente durchgeführt werden, um die detaillierten Mechanismen der Nierenzystenbildung zu untersuchen.