Name: Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner Fibroblasten zu faktorfreien induzierten pluripotenten Stammzellen und deren Umwandlung in klinisch relevante Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Herstellung GMP-konformer Zelllinien für therapeutische Anwendungen.

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Wir möchten Patrick C. Lee, Cyril Ramathal und Saravanan Karumbayaram (SK) für ihre Unterstützung bei der Durchführung der iPSC-Ableitungs- und Charakterisierungsexperimente danken; Aaron Cooper für die Durchführung der iPSC-Analyseexperimente; Vittorio Sebastiano und Renee A. Reijo Pera für die Leitung der ersten Neuprogrammierung; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack und Donald B. Kohn für die Leitung der Einrichtung der UCLA GMP-Einrichtungen, die die Umwandlung und Charakterisierung von iPS-Zellen in klinischer Qualität ermöglichen; Gustavo Mostoslavsky für die Bereitstellung des polycistronischen Reprogrammierungsvektors STEMCCA. Diese Arbeit basiert auf einer Forschungskooperation mit Fibrocell Science und der Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Acquired Derivatives (CIDMOD) Initiative zur Entwicklung sicherer personalisierter zellulärer Therapeutika. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, der Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. und des UCLA CTSI Scholar's Award an JAB unterstützt.

. HINWEIS: Diese Methode wurde in der Forschung im Awe et al berichteten 10 verwendet. 1. Reprogrammierung Erwachsene menschliche Fibroblasten der Haut mit STEMCCA <ol><li> Thaw Erwachsenen dermalen Fibroblasten (HUFS), Durchgang 4 oder niedriger, in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten, dabei nicht an die Spitze der Ampulle mit Wasser tauchen. </li><li> Legen Sie die 1-ml Aufschlämmung von menschlichen Fibroblasten in einen 15-ml-Erlen Fläschchen und langsam setzen 4 ml Standard HUF Medien, auf 37 ° C vorgewärmt, in einem tropfenweise Mode, zu verdünnen aus Dimethylsulfoxid (DMSO) und resuspendieren Zellen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere Zellen in einem ausreichenden Volumen an Medium, um eine Suspension von 100.000 Zellen / ml zu erstellen und dann 2 ml in ein Well einer Sechs-Well-Platte für 20 Minuten mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet. HINWEIS: Eine Schwester auch mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Zeile und Zustand muss fo ausgesät werdenr die Zellzählung / Multiplizität der Infektion (MOI) Berechnung. </li><li> Rock the Platte hin und her und hin und her, um gleichmäßige Verteilung der Zellen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Am Tag der Weiterleitung erhalten Zellzahl (n) von der Schwester gut (e) etwa 24 Stunden nach der ersten HUF Beschichtung. </li><li> Auftauen 2 x 10 8 TU, oder gleichwertig, lentiviralen Konzentrat (STEMCCA) und mit Wasser auf 1 x 10 8 TU / ml in HUF Medien. </li><li> Transduzieren Zellen bei einer 10-MOI-Verhältnis in HUF Medien mit 8 ug / ml Transfektionsagens ergänzt. Mischungs transduziert Vertiefungen gleichmäßig beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Etwa 24 Stunden nach lentivirale Transduktion, schalten Sie das HUF Medien Standard humanen pluripotenten Stammzellen (PSC) Medium. </li><li> An den Tagen 2 bis 6, ändern Medien täglich mit menschlichen PSC Medium. </li><li> An Tag 6 der Platte zwei 0,2% Gelatine beschichteten 10-cm-Platten von1,5 bis 1,75 x 10 6 MEFs ab CF1-Mäuse in HUF Medien 12 abgeleitet. </li><li> Am Tag 7, darauf achtend, nicht mehr als 100 × g, Gebrauch Raumtemperatur Trypsin zentrifugieren, um von einem Brunnen der sechs-Well-Platte und Durchgang heben Sie den Tag ab 7 umprogrammiert Fibroblasten in einer 1.16-Verhältnis, durch Plattierung alle Zellen gleichmäßig auf zwei 10-cm-Platten, die mit frischen menschlichen PSC Medien, die am Vortag mit MEFs vergoldet wurden. Verteilen Zellaggregate im Uhrzeigersinn Spiralbewegung und in eine 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator über Nacht. </li><li> Etwa 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen auf neu programmiert MEFs und jeden Tag danach, ändern Sie verbrachte menschlichen PSC Medien durch frische Medien. </li><li> Nach 3 bis 4 Wochen, nehmen einzelne Kolonien mit typischer ESC artige Morphologie mit einer 21-Gauge-Nadel und Subklonierung in eine 24-Well-Platte durch Einbringen von etwa 8 bis 10 Einzelteile der spezifischen Kolonien in einzelne Vertiefungen in einer 0,2% Gelatine beschichtete 24-Well-Platte Vorimpfteilchened mit MEFs ab CF1-Mäuse in der menschlichen PSC Medium abgeleitet. HINWEIS: Nach dem Ausbau des gepickten Kolonien haben die Kolonien als pluripotent von Embryoidkörperbildung und Expressionsanalyse von Pluripotenzmarker auf Proteinebene charakterisiert werden. </li></ol> 2. Vektor-Integration Standortanalyse und STEMCCA Excision <ol><li> Analysieren Sie den STEMCCA Integrationsstelle von nicht einschränkenden lineare Verstärkung PCR wie beschrieben 10. </li><li> Nach Untersuchung auf eine Integration in einen gewünschten Bereich des Genoms, Verbrauch STEMCCA durch Absaugen von der alten menschlichen ESC Medium zu gewährleisten. Dann kombinieren 45 ul konzentrierter Adeno-Cre-PuroR Virus mit 8 ug / ml Transfektionsmittel in 3 ml Standard PSC Medien für 24 Stunden. </li><li> Nach der 24-stündigen Inkubationszeit, absaugen des gemischten Virusüberstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit menschlichen PSC Medien. Platzieren frischen menschlichen PSC Medien zusammen mit 2 &amp; mgr; g / ml Puromycin für einen Zeitraum von 5 Tagen, wenn der Medien täglichen with frisches Medium und Antibiotikum. </li><li> Nach 5 Tagen Subklon verbleibenden Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel auf 0,2% Gelatine beschichtete Vertiefungen in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit MEFs aus CF1mice abgeleitet vorbeschichtet und erweitern, wie oben beschrieben. HINWEIS: Nach ausreichender Expansion eine gefrorene Lager zu erhalten, wird die Umwandlung in Feeder-freien Bedingungen erforderlich. Erwarten mindestens 95% der Stammzellkolonie Tod, da die meisten Zellen nicht erfolgreich transduziert werden und wird Antibiotikum über den Zeitraum von 5 Tagen Inkubation erliegen. Obwohl Adeno-Cre-PuroR integriert an einer 0,001 bis 1% Wirkungsgrad in Wirtschromosomen von infizierten Zellen, reexposing eine Stichprobe von Faktor freie Kolonien Puromycin 100% Zelltod zu gewährleisten wird bestätigen, keine Integration hat 13 aufgetreten. </li><li> Auftauen eines Fläschchens vorge aliquotierten Basalmembranmatrix auf Eis über einen Zeitraum von ca. 2 h (Empfehlungen des Herstellers), bis die Matrix eine Flüssigkeit und verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 1:30 in kaltem Basalmedium. Coauf gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer Sechs-Well-Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Gitterschnitt (mit einer 18-Gauge-Nadel oder ein Glas oder Kunststoff &quot;tip&quot;) mindestens 20 bis 30 Kolonien, die von einem gut vorher mit MEFs beschichtet. Achten Sie darauf, zu reduzieren MEF erhebend und übertragen von der Platte. <ol><li> Generieren Sie die Schraffur-Gerät durch eine Reihe verschiedener Ansätze, von der komplizierter Heizung, ziehen, und Veredelung von Glas Pasteurpipette in offene Flamme, die einfache Verwendung einer sterilen Kunststoffpipettenspitze oder, wie in unserem Fall, 21- und / oder 18-Gauge-Nadeln. </li></ol></li><li> Saugen Sie die Matrix aus dem beschichteten auch nach der Inkubation. </li><li> Stücke der Kolonien zu entfernen durch vorsichtiges Abschaben von der alten Platte mit einem 200-ul-Pipette und vorsichtig in 3 ml frischem kombinierten Medien 1 in der Matrix beschichtete Platte zu platzieren. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. Medienwechsel 48 h nach der Passage. </li><li> Extrahieren genomischer DNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs, bei mehr als 80% Konfluenz, mit kommerziellen DNA-Extraktion-Kits. </li><li> Analysieren Sie für die richtige Exzision mit für exogene Integrationen des STEMCCA Lentivirus Primer: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-Rückwärts, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer mit PCR-grade Wasser zu einer 10-uM Stammlösung. </li><li> Führen Sie einen PCR mit den folgenden fünfstufigen Protokoll: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von jeweils der folgenden: Denaturierung bei 98 ° C für 20 sec, Primer-Annealing bei 62 ° C für 15 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 15 sec; gefolgt von einem einzigen Zyklus abschließenden Extension bei 72 ° C für 3 min. </li><li> Machen Sie eine 3% Agarosegel durch Auswiegen 1,5 Gramm Agarose und stellen Sie es in 50 ml 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer. Mikrowelle bis Agarose aufgelöst und in DNA-Gel-Färbung bei pRoper Verdünnung mischen und verzichten richtige Volumen in Gelkassette für 1 Stunde bei Raumtemperatur verfestigen. </li><li> Last 12 ul PCR-Produkt mit 3 &amp; mgr; l Ladepuffer gemischt und zu einer 3% igen Agarose-Gel. Führen Sie das Gel für 30 min bei 80 V. </li><li> Visualisieren Sie mit UV-Licht für die Abwesenheit einer Bande, die richtige Entfernung. </li></ol> 3. Die Quantifizierung der Genexpression Unterschiede mithilfe von Quantitative PCR von Pre- und Post-geschnitten hiPSCs <ol><li> Auszug Gesamt-RNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs mit Hilfe von kommerziellen RNA-Extraktion-Kits. </li><li> Reverse Transkription und bis zu 1 ug Gesamt-RNA von mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden verankerten Oligo (dT) 18 und Random Hexamer Primer. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PCR-Protokoll ist für die Gen-Transkripte von mehr als oder weniger als 4 kb zugeschnitten. Spezifische Primer müssen jedoch für alle Gen STEMCCA ursprünglich integriert i gemacht werdennto. </li><li> Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Primer PCR-grade Wasser zu einer 20 uM Stammlösung. </li><li> Verwenden Sie 5 ng der Probe pro 20 ul Reaktion, die von 10 uM UPL Sonde besteht, 2x LightCycler® 480 Probes Meister, und 20 &amp; mgr; M Vorwärts- und Rückwärtsprimer. </li></ol> 4. Umwandlung in GMP-grade Bedingungen <ol><li> Am ersten Tag der Umstellung der Post-geschnitten hiPSCs über den GMP-Grade-Bedingungen, machen eine Mischung aus Medien, die aus menschlichen PSC kombiniert Medien 1 (kombinierte Medien 1) und klinischer Qualität der guten Herstellungspraxis (GMP) kompatible Medien (kombinierte Medien 2 ) in einem Verhältnis von 80:20. </li><li> Absaugen der alten kombinierten Medien ein und legen Sie 3 ml der neuen kombinierten Medien 1 und 2 vorgewärmten, im Verhältnis von 80:20. Medien ändern sich täglich für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 4, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 50:50. Absaugen des alten Mediums und replace mit vorgewärmtem Medium, mit den zusammengeführten Medien 1 und 2 im Verhältnis 50:50. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 7, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 20:80. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmten Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 20:80 Verhältnis. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 10, stellen die kombinierten Medien 1 und 2 zu einem 0: 100 Verhältnis. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmter Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 0: 100 Verhältnis. Ändern Medien jeden Tag an diesem bestimmten Verhältnis. Die Zellen sind nun in vollständig definiert Xeno-freien Medien. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. HINWEIS: Während dieser gesamten Umwandlungsprozess wird Routine Passagieren mit einer 18-Gauge-Nadel für eine einwandfreie Kolonie Größe und Dichte zu erhalten. Plan für passaging Zellen alle 4 bis 5 Tage auf der Grundlage der Koloniegröße, Konfluenz und Differenzierung. </li><li> Coat eine Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit einer definierten xeno freien Substrat, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Mechanisch Gang ein konfluenter gut, bereits umgewandelt Xeno freien Medien Bedingungen, von einem Sechs-Well-Platte mit einer 18-Gauge-Nadel. Wichtig ist, legen Sie die neuen Medien (kombinierte Medien 2) auf die Zellen mit 1x ROCK-Hemmer für 1 Stunde, bevor Passage vor, eine Bedingung die Medien. </li><li> Saugen Sie das synthetische Substrat-Lösung aus der neuen Platte, dass die Zellen, die sich zu übergeben. Entfernen Sie alle Medien, die die Stammzellklumpen von der alten Platte und Transfer zum neuen Platte. </li><li> Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 2 Tage bei minimalem physische Störungen (idealerweise Platten, einmal im Inneren Inkubator nicht direkt in keiner Weise berührt), um maximale Befestigung ermöglichen. HINWEIS: Die Zellen werden täglich Medien Änderungen erfordern. Kontinuierliche passaging alle 4 Tage wird wichtig sein. Mit einer 21-Gauge-Nadel, Durchgang nur die Teile der Kolonien mit optimalen ESC-ähnliche Morphologie (Hoch nukleozytoplasmatischen Verhältnis). Dies wird für die richtige Auswahl hiPSC Kolonien, die gut wachsen wird und schließlich ergeben homogene Kolonien zu gewährleisten. Insgesamt Zeit, Ableitung von ESC artige Kolonien zwischen 15-20 Tage nach der ersten kombinierten Medienwechsel. </li><li> Frieren Sie sich die GMP-Grade postgeschnitten hiPSCs vom ersten Gitterschnitt all der Kolonien mit Hilfe eines 18-Gauge-Nadel. Nehmen Sie alle Teile aus mit Hilfe eines 200 ul Pipette und übertragen alle Medien mit den Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Während die Zellen zentrifugiert, einen Gefriermedien, bestehend aus gleichen Volumen kalter kombinierten Medien 2 und Gefriermediums mit einer DMSO-Endkonzentration von 7,5%. </li><li> Nachdem die Zellen pelletiert, absaugen alte Medium und tropfenweise resuspendieren Sie das Pellet mit den gefrierenden Medien. Unmittelbar transfer zu Einfrierröhrchen und in einem -80 ° C Gefrierschrank gelegt. </li></ol> 5. Charakterisierung GMP-Grade-Post-geschnitten hiPSCs <ol><li> Um eine korrekte Ausdruck Pluripotenzmarker nach Umwandlung zu gewährleisten, verwenden QPCR um die Expression von Schlüssel Pluripotenzmarker (SOX2, OCT4 und NANOG) unter Verwendung der in Tabelle 1 mit den gleichen Schritten aufgeführten Primer quantifizieren wie in Schritt 3 QPCR Methoden erwähnt folgen der gleichen Schritte wie in Schritt 3 aufgeführt. </li><li> Verwendung der Durchflusszytometrie, um die nicht-menschlichen Sialinsäure Neu5Gc (N -glycolylneuraminic Säure) in Übereinstimmung mit in dem Kit enthalten sind, wie zuvor veröffentlicht am 10. Standardbedingungen zu erfassen. </li><li> Wäsche leicht die Zellkulturplatten mit Zellen unter Verwendung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Distanzieren Kolonien durch Verwendung 1x Dissoziation Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Während der 5-min Inkubationszeit von Schritt 5.4, bereiten Sie die Blockierungslösung (in bereitgestelltKit), indem sie eine 0,5% Blockierungsmittel in eiskaltem PBS. </li><li> Beschriften Sie den folgenden Satz von Rohren für die Durchflusszytometrie-Analyse: Ungefärbte; 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) DAPI; Kontroll-Antikörper 1: 200; Primärer Antikörper 1: 200; Sekundäre Antikörper 1: 200 Esel Anti-Huhn-IgG (H + L); Beispiel MEFs; Beispielpostgeschnitten Zellen auf Matrix; und Sample Postgeschnitten Zellen auf synthetische Substrat. </li><li> Sanft verdrängen Zellaggregate von Schritt 5.4 durch Zugabe von 2 ml Blockierungslösung und Transfer Inhalt in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 80 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Mit Blockierlösung und zentrifugiert wie in Schritt 5.7 fest Waschen Sie die Zellen zweimal. </li><li> Vorsichtig resuspendieren etwa 1 x 10 6 Zellen in 100 &amp; mgr; l Blockierlösung mit dem entsprechenden Verdünnungsvolumen von jedem Antikörper. Inkubiere unter leichtem Schütteln bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wiederholen wäscht dreimal wie in Schritt 5.8. </li><li> Resuspendieren das Zellpellet in 400 ul Verdünnungspuffer Buffer (aus Kit) mit 1: 100 von DAPI für Rohre 2, 6, 7 und 8 wie unter Punkt 5.6 aufgeführt. </li><li> Stamm Zellen durch ein 40 &amp; mgr; M Sieb und Durchfluss-Zytometer laufen. </li></ol>

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</ol>

James A. Byrne (JAB) und Agustin Vega-Crespo erhalten Forschungsgelder von Fibrocell Science, Inc. JAB ist wissenschaftlicher Berater für Fibrocell Science, Inc. Keine anderen Autoren haben konkurrierende Interessen offenzulegen.

Wir beschreiben eine Methode zur Ableitung Faktor freie hiPSCs und macht sie durch die Umwandlung dieser Zellen in GMP-grade Bedingungen für Downstream-Zelldifferenzierung in Zukunft Humantherapeutika klinisch relevant. Obwohl dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Zelltypen, wählten wir humane dermale Fibroblasten umprogrammieren, aufgrund der Einfachheit der Entnahme aus dem Patienten und ihre Anwendbarkeit auf personalisierten menschliche Therapeutika. Sobald Einschränkungen soweit vollständig...

Adulte menschliche Zellen haben gezeigt, dass sie in der Lage sind, epigenetische Remodellierung und Reprogrammierung zu durchlaufen, als Ergebnis der lentiviralen basierten Expression von vier Schlüsseltranskriptionsfaktoren4,5. Ein wichtiger Fortschritt auf dem Gebiet der Reprogrammierung war die Verwendung einer einzigen excisablen lentiviralen Stammzellkassette (STEMCCA), die alle vier Reprogrammierungstranskriptionsfaktoren enthielt, die ein präzises stöchiometrisches Verhältnis der Proteinexpression ermöglichten6. Darüber hinaus kann STEMCCA, wenn es in einer bestimmten Vielzahl von Infektionsbereichen transduziert wird, während des Reprogrammierungsprozesses zu überwiegend einzelnen genomischen Integrationsereignissen führen7. Die Einführung einer exzizierbaren Version von STEMCCA, die die Cre/loxP-Technologie verwendet, gefolgt von der Exzision des Reprogrammierungsvektors nach der Derivation der Stammzelllinie, ermöglichte die Gewinnung faktorfreier humaner induzierter pluripotenter Stammzelllinien (hiPSC)8. Darüber hinaus musste zur Verbesserung der therapeutischen Anwendungen von hiPS-Zellen eine neuartige, schnelle und leicht anwendbare Methodik für die Umwandlung von Zelllinien in GMP-Qualität (Good Manufacturing Practice) von xeno-haltigen zu xeno-freien Bedingungen implementiert werden. Hier diskutieren wir eine relevante Methodik, die Unterschiede in der integrierten Genexpression, insbesondere bei der Integration in ein Intron, und die Umwandlung von Zellen in klinischer Qualität in mutmaßliche GMP-Bedingungen genauer bewertet. 
Frühere Forschungen haben nur relativ unempfindliche Microarray-Transkriptionsanalysen verwendet, um Genexpressionsunterschiede in integrierten Genen nach STEMCCA-Transduktionzu analysieren 3,9. Hier stellen wir die Methodik der sensitiven quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse vor, um integrierte Genexpressionsunterschiede weiter zu untersuchen. Wichtig ist, dass die derzeitigen Safe-Harbor-Kriterien hiPSCs mit Genen mit viraler Integration verwerfen, wodurch die Anwendbarkeit dieser Zellen für nachgelagerte humane zelluläre Therapeutika eingeschränktwird 9. Wir schlagen vor, dass sich der Status quo durch die Verwendung von vollständig charakterisierten und transgenfreien intronikal reprogrammierten hiPSCs ändern könnte. Darüber hinaus stellen wir ein robustes Zellkonversionsprotokoll in GMP-Qualität vor, das problemlos auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen angewendet werden kann, die ursprünglich unter xeno-haltigen Bedingungen gewonnen wurden10. Dies bietet erhebliche Möglichkeiten für die Entwicklung zukünftiger Zellreprogrammierungsexperimente, die klinische Bedingungen erfordern, um die therapeutische Relevanz für den Menschen zu erhalten. 
Diese Methoden bieten eine Grundlage, auf der die aktuellen Safe-Harbor-Kriterien erweitert werden können, um charakterisierte STEMCCA-reprogrammierte hiPSC-Linien einzuschließen, die nach der STEMCCA-Exzision aus dem integrierten Intron ein normales Genexpressionsprofil beibehalten. Außerdem wird die vollständige Umwandlung in klinische Bedingungen, die frei von nicht-menschlichen tierischen Antigenen sind, dazu beitragen, viel mehr Zelltypen zu integrieren, die bisher nur unter Xeno-haltigen Bedingungen reprogrammiert und charakterisiert wurden. Diese Methoden zusammen sind für die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) ein überzeugender Grund, eine Ausweitung ihrer eingeschränkten Zulassung von humanen embryonalen Stammzellen (ESC)-basierten Therapeutika auf hiPSC-basierte Therapeutika in Betracht zu ziehen11. 
Wir haben kürzlich die Ableitung einer faktorfreien hiPSC-Linie detailliert beschrieben, die vollständig charakterisiert und in mutmaßliche klinische Bedingungen umgewandelt wurde10. Hier beschreiben wir das Protokoll für die hiPSC-Ableitung unter Verwendung des STEMCCA-Lentivirus. Diese Stammzellen durchlaufen dann einen Exzisionsprozess, gefolgt von einer Charakterisierung der Genexpression. Schließlich werden die hiPSCs durch eine langsame Umwandlungsmethode in GMP-Qualität überführt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Medien und Reagenzien</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Basalmedium)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentielles Medium (MEM) nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, Penicillin-Streptomycin, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Auftauen bei 4 > C, aliquotieren und bei &minus lagern; 20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Knockout-Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquotieren und bei &minus lagern; 20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Verdünnen Sie den Rohbestand auf 0,05 % in 1x PBS</td></tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td><td>GSR-2001</td><td>Rekonstitution zu 10 &; Mikro; g/ml Bestand an 0,1 % Rinderserumalbumin, gelöst in 1x PBS und gelagert bei &minus; 80°; C</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, USA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Basalmembranmatrix)</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>356231</td><td>Verdünnen Sie das Matrigel-Fläschchen mit 10 ml DMEM/F12 auf Eis für eine 1:2-Verdünnung. Aliquotieren und speichern bei &minus; 20 °C.</td></tr><tr><td>CELLstart (Synthetisches Substrat)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sonden Master</td><td>Roche (Basel, Schweiz)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medium/Gefriermedium</td><td>Lonza (Basel, Schweiz)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, aus Schweinehaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Zu 0,2 % PBS lagern, autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td><td>5850</td><td>Supplement 5x mit dem Basismedium kombinieren, aliquotieren und bei 4 &deg lagern; C für bis zu 2 Wochen.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Nährmedium</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>Auftauen bei 4 > C O/N, aliquot und bei 4 μg lagern; C für bis zu 2 Wochen.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Dissoziationsreagenz)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Hühner-IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene/Transfektionsmittel</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>18-Gauge-Nadel</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>21-Gauge-Nadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Durchflusszytometer</td><td>KSystem von Nikon (Tokio, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Version 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA Isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptor Erststrang cDNA Synthese Kit</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td><td>Basic Pack</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Kombinierte Medien 1</td><td>StemCell Technologies und Stemgent</td><td></td><td>besteht zu gleichen Teilen aus mTeSR1 und Nutristem</td></tr><tr><td>Kombinierte Medien 2</td><td>StemCell Technologies und Stemgent</td><td></td><td>bestehen zu gleichen Teilen aus TeSR2 und Nutristem</td></tr><tr><td>HUF Medium</td><td></td><td></td><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium/F12 [DMEM/F12] ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Glutamax und 1x Primocin</td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cell Media</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12, ergänzt mit 20 % Knockout-Serumersatz, 1x Glutamax, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Primocin, 1x &beta;-Mercaptoethanol und 10 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' s modifizierter Eagle" s mittel/F12; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung.</td></tr></tbody></table>

ableitung und charakterisierung eines transgens freie menschen induzierten pluripotenten stammzelllinie und umwandlung in definierte clinical-grade bedingungen

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Mit lentiviralen basierte Umprogrammierung Methoden kann Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) erzeugt werden. Jedoch Spuren von potenziell onkogenen Gene in aktiv transkribierten Regionen des Genoms übrigen, die ihr Potenzial für den Einsatz in menschlichen therapeutischen Anwendungen ein. Darüber hinaus nicht-menschlichen Antigene aus Stammzellen Neuprogrammierung oder Differenzierung in therapeutisch relevanten Derivate abgeleitet ausschließen diese hiPSCs können, in den menschlichen klinischen Kontext 2 verwendet. In diesem Video stellen wir ein Verfahren zur Umprogrammierung und Analyse von Faktor freie hiPSCs frei von exogenen Transgenen. Diese hiPSCs kann dann für die Genexpression Abnormalitäten im spezifischen Introns enthaltend das Lentivirus analysiert werden. Diese Analyse kann mit empfindlichen quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Vorteil gegenüber weniger empfindlich Techniken bisher verwendet, um die Genexpression Differenzen 3 zu erkennen ist durchgeführt werden. Vollständige Umwandlung inklinischem guten Herstellungspraxis (GMP) Bedingungen, können die menschliche klinische Relevanz. Unser Protokoll bietet eine weitere Methode, sofern die aktuellen Safe-Harbour-Kriterien zu erweitern und umfassen Faktor freie dadurch gekennzeichnet hiPSC basierten Derivaten für den menschlichen therapeutischen Anwendungen zur Ableitung-GMP-grade hiPSCs, die keine Immunogenität Risiko durch nicht-menschlichen Antigene zu eliminieren sollte. Dieses Protokoll ist breit anwendbar auf lentiviralen umgewandelten Zellen jeglicher Art und stellt eine reproduzierbare Methode zur Umwandlung umgewandelten Zellen in GMP-grade Bedingungen.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Ableitung klinischem Faktor freie hiPSCs mit der STEMCCA lentiviralen basierte Umprogrammierung. 1A zeigt ein repräsentatives Bild der drei vorgeschnitten hiPSC Linien nach Neuprogrammierung mit dem STEMCCA Ansatz auf einer Schicht aus MEFs. Der Hauptvorteil der STEMCCA Umprogrammierung Ansatzes liegt in der konsequenten Neuprogrammierung Erfolg von mehreren Wissenschaftlern erreicht, in verschiedenen Forschungsgruppen und Standorte. 1B stellt die Post...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, lentiviral basierte reprogrammierte faktorfreie humaninduzierte pluripotente Stammzellen abzuleiten und diese Zellen in mutmaßliche klinische Bedingungen umzuwandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst adulte dermale humane Fibroblasten mit einer einzigen ex großen lentiviralen Stammzellkassette oder einem Stammauto in HI-PSCs umprogrammiert werden. Als nächstes werden die reprogrammierten HI-PSCs dem Adeno-Cree-Purr-Virus ausgesetzt, um eine vollständige Exzision und Entfernung des Stammautos aus dem Wirtsgenom zu ermöglichen.Dann bestätigt die genomische DNA-Extraktion aus den Feeder-freien HI-PSCs, gefolgt von einer Agel-Analyse, die korrekte Exzision des Stammautos. Schließlich werden die H-IPCs des Faktors drei durch eine langsame Umwandlungsmethode in vollständig definierte Xeno-freie Bedingungen in mutmaßliche GMP-Bedingungen umgewandelt. Letztendlich unterstreicht die virale Reprogrammierung humaner adulter dermaler Fibroblasten und die vollständige Umwandlung der H-IPCs in klinische Bedingungen die breite Anwendbarkeit dieser Methodik für die Reprogrammierung adulter humaner Zellen und deren Umwandlung in klinisch relevante Zustände.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf klinische Anwendungen von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, da sie völlig faktorfrei sind und in klinische Bedingungen umgewandelt werden, wodurch sie mit humanen Therapeutika kompatibel sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Reprogrammierung, Exzision und Umwandlung in klinischer Qualität aufgrund der wichtigsten komplizierten und spezifischen Verfahren schwer zu erlernen sind, um Faktor drei und humane induzierte pluripotente Stammzellen in klinischer Qualität zu erhalten, um mit dem Auftauen zu beginnen. Erwachsene dermale humane Fibroblasten oder HAFs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für zwei Minuten.Achten Sie darauf, den Deckel des Fläschchens nicht in das Wasser zu tauchen. Geben Sie die eine Milliliter-Aufschlämmung der Zellen in ein 15-Milliliter-Chronikfläschchen, um die Zellen zu resuspendieren und das DMSO tropfenweise zu verdünnen. Fügen Sie langsam vier Milliliter vorgewärmtes Huff-Medium hinzu und zentrifugieren Sie das Violett 200 Mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Dann aspirierst du das Sup, Nacent und Reus. Suspendieren Sie die Zellen in einem Medium bis zu 100.000 Zellen pro Milliliter in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 0,2 % Gelatine. Fügen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu und fügen Sie dann zwei Milliliter Suspension zu einer zweiten hinzu.Nun, zur Messung der Multiplizität von Infektionen oder MOI zu verwenden, schütteln Sie die Platte von Seite zu Seite und hin und her, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, bevor Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer inkubieren. 24 Stunden später, nach dem Zählen, tauen Sie die Zellen zweimal auf, zentrieren Sie die acht Transduktionseinheiten oder S eines gleichwertigen lentiviralen Konzentrats und verwenden Sie Huff-Medium, um es auf eins mal 10 zu verdünnen Zu den acht TS pro Milliliter wird ein halbes Medium verwendet, das mit acht Mikrogramm pro Milliliter Transfektionsreagenz ergänzt wird. Transduzieren Sie die Zellen mit einem Infektionsverhältnis von 10.Mischen Sie die Transduziervertiefungen gleichmäßig und inkubieren Sie sie über Nacht, etwa 24 Stunden nach der lentiviralen Transduktion. Entfernen Sie das Huff-Medium und ersetzen Sie es durch normales humanes pluripotentes Stammzell- oder PSC-Medium. Wechseln Sie das Medium täglich an den Tagen zwei bis sechs an den sechs Tagen in zwei 0,2 % mit Gelatine überzogene 10 Zentimeter Schalen Teller 1,5 bis 1,75 mal 10 zu den sechs embryonalen Fibroblasten der Maus, die von Komplementkomponentenfaktor eins oder CF eins abgeleitet sind, Mäuse in halbem Medium am siebten Tag.Fügen Sie Trips bei Raumtemperatur in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen der reprogrammierten Fibroblasten hinzu. Sie hebt die Zellen vorsichtig ab und spinnt eine 100-fache G mit frischer humaner PSC-Medium-Platte alle Zellen im Verhältnis eins zu 16 auf zwei 10 Zentimeter CFI-Meth-Platten. Die Aggregate werden in einer Spiralbewegung im Uhrzeigersinn verteilt und ca. 48 Stunden inkubiert, bevor das Medium ausgetauscht wird.Nach drei bis vier Wochen wird mit einer 21-Gauge-Nadel acht bis 10 einzelne Stücke spezifischer Kolonien mit typischer ESC-ähnlicher Morphologie entnommen und nach der Expansion in einzelne Vertiefungen von CFI MFS subklont. Bestätigen Sie, dass die Zellen pluripotent sind, indem Sie den Embryokörper bilden und die Markerexpression analysieren, nachdem Sie die Integrationsstelle des Stammautos überprüft haben, wie im Begleittextprotokoll beschrieben. Verbrauchsteuerstängel Fahrzeug, indem zunächst das alte menschliche PSC-Medium in drei Milliliter kombiniertes Standard-PSC-Medium abgesaugt wird.45 Mikroliter konzentriertes Adeno Cree Pur oder Virus mit acht Mikrogramm pro Milliliter Transfektionsmittel. Geben Sie dann zu den Zellen und inkubieren Sie 24 Stunden lang, nach der Inkubation aspirieren Sie das virale Supinat, induzieren Sie das menschliche PSC-Medium, um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann HPSC-Medium mit zwei Mikrogramm pro Milliliter reinem Mycin hinzu und ersetzen Sie es täglich nach fünf Tagen, subklonen Sie die restlichen Kolonien und erweitern Sie sie, wie weiter oben im Video beschrieben.Als nächstes tauen Sie ein Fläschchen mit der Prä-Eloqua-Basalmembranmatrix auf Eis auf und verdünnen Sie kaltes Basalmedium auf eine Endkonzentration von eins bis 30. Verwenden Sie einen Milliliter pro Vertiefung, um die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen zu beschichten, und lassen Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. Dann schraffieren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel mindestens 20 bis 30 Kolonien aus einem zuvor mit Mes beschichteten Brunnen.Achten Sie darauf, dass Sie die Hebung der Zellen und die Übertragung der Zellen von der Platte reduzieren. Nach der einstündigen Inkubation aspirieren Sie die Matrix mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus der beschichteten Vertiefung. Entfernen Sie die Stücke der Kolonien, indem Sie sie vorsichtig von der alten Platte abkratzen, und legen Sie sie vorsichtig in drei Milliliter frisch gemischtes Medium, einen in einer mit Matrix beschichteten Platte.Nach 48-stündiger Inkubation ist das Medium täglich zu wechseln, wenn die postexzidierten und feederfrei umgewandelten HI PSCs eine Co-Flüssigkeit von 80 % erreichen. Verwenden Sie ein kommerzielles DNA-Extraktionskit, um die genomische DNA mit den hier gezeigten Primern zu extrahieren, die spezifisch für die exogene Integration des Stamm-Car-Lentivirus sind. Analysieren Sie die DNA mittels PCR auf eine ordnungsgemäße Exzision, um die nach der Exzidierung herausgeschnittenen HI-PSCs auf GMP-Bedingungen zu überführen.Mischen Sie HPSC-Kombinationsmedium eins und GMP-konformes Medium in klinischer Qualität oder kombiniertes Medium zwei in einem Verhältnis von 80 bis 20 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie das alte kombinierte Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch drei Milliliter der neuen Lösung des warmen Mediums. Ersetzen Sie das Medium täglich für drei Tage und passagieren Sie gemäß dem Textprotokoll, um die richtige Koloniegröße und -dichte am vierten Tag beizubehalten, ersetzen Sie das Medium durch eine 50 50 Mischung aus warmen kombinierten Medien eins und zwei inkubieren Sie drei Tage lang.Ersetzen Sie das Medium täglich am siebten Tag, wechseln Sie zu einem Verhältnis von 20 bis 80 der erwärmten kombinierten Medien eins bzw. zwei und ersetzen Sie es drei Tage lang täglich. Wechseln Sie am 10. Tag zu warmem, 100%-kombiniertem Medium zwei und wechseln Sie täglich. Die Zellen befinden sich nun in einem vollständig definierten Xeno-freien Medium.Als nächstes, nachdem ein definiertes Xeno-freies Substrat verwendet wurde, um eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu beschichten, ersetzen Sie das Xeno-freie Medium in einer Vertiefung von Konfluenzzellen durch frisches Medium, das ein x Gestein enthält. Nach einer einstündigen Inkubation die Zellen mit einer 18-Gauge-Nadel mechanisch in die frisch zubereiteten Zellen einfüllen. Lassen Sie die Zellen zwei Tage lang ungestört inkubieren, um eine maximale Anheftung zu ermöglichen, bevor Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll charakterisieren.Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Bild von drei verschiedenen präexzidierten H-I-P-S-C-Linien nach der Reprogrammierung mit dem Stamm-Car-Ansatz auf einer Schicht von mes, hier ist das Post-Exzisions-Reverse-Transkriptions-PCR-Gel, das einen bestimmten Subklon zeigt, der völlig frei vom Stamm-Car-Lentivirus ist, was durch das Fehlen einer Amplikon-Bande belegt wird, die für eine bestimmte Sequenz endogen zum Stamm-Car spezifisch ist. In dieser Abbildung sind prä-con-konvertierte IPCs auf einer Xeno-haltigen Matrix und Post-Excise-freie Xeno-IPCs der Güteklasse H auf synthetischer Matrix mit der Quantifizierung von Standard-Pluripotenz-assoziierten Faktoren dargestellt, einschließlich SOX zwei, OCT vier und Nanog. Die Verwendung von QPCR wird hier veranschaulicht.Schließlich wurden, wie hier zu sehen ist, prä-con-konvertierte und post-konvertierte HI-PSCs unter GMP-Bedingungen mittels Durchflusszytometrie auf die Sialinsäure und Glykol-Neuronsäure getestet, die auf nicht-humane Antigene hinweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane adulte dermale Fibroblasten mit dem Stemco-Reprogrammierungsvirus umprogrammiert, das Virus aus dem Genom herausschneidet und diese HI-PSCs dann vollständig in klinische Bedingungen umwandelt, die vollständig mit menschlichen Therapeutika kompatibel sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Staca, einem antiviralen Vektor der dritten Generation, äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte eine geeignete PSA und ein VSL-Zweiplus-Gewebekulturraum verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Die regelmäßige Charakterisierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um die Aufrechterhaltung ihres pluripotenten Zustands zu gewährleisten, ist ein wichtiger Schritt, bevor diese Zellen für andere Anwendungen verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur kleinskaligen Vermehrung von humanen iPSCs, die speziell entwickelt wurde, um ihre einfache und routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie zu ermöglichen.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner Fibroblasten zu faktorfreien induzierten pluripotenten Stammzellen und deren Umwandlung in klinisch relevante Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Herstellung GMP-konformer Zelllinien für therapeutische Anwendungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen (Video) | JoVE Journal

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

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