Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, lentiviral basierte reprogrammierte faktorfreie humaninduzierte pluripotente Stammzellen abzuleiten und diese Zellen in mutmaßliche klinische Bedingungen umzuwandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst adulte dermale humane Fibroblasten mit einer einzigen ex großen lentiviralen Stammzellkassette oder einem Stammauto in HI-PSCs umprogrammiert werden. Als nächstes werden die reprogrammierten HI-PSCs dem Adeno-Cree-Purr-Virus ausgesetzt, um eine vollständige Exzision und Entfernung des Stammautos aus dem Wirtsgenom zu ermöglichen.

Dann bestätigt die genomische DNA-Extraktion aus den Feeder-freien HI-PSCs, gefolgt von einer Agel-Analyse, die korrekte Exzision des Stammautos. Schließlich werden die H-IPCs des Faktors drei durch eine langsame Umwandlungsmethode in vollständig definierte Xeno-freie Bedingungen in mutmaßliche GMP-Bedingungen umgewandelt. Letztendlich unterstreicht die virale Reprogrammierung humaner adulter dermaler Fibroblasten und die vollständige Umwandlung der H-IPCs in klinische Bedingungen die breite Anwendbarkeit dieser Methodik für die Reprogrammierung adulter humaner Zellen und deren Umwandlung in klinisch relevante Zustände.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf klinische Anwendungen von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, da sie völlig faktorfrei sind und in klinische Bedingungen umgewandelt werden, wodurch sie mit humanen Therapeutika kompatibel sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Reprogrammierung, Exzision und Umwandlung in klinischer Qualität aufgrund der wichtigsten komplizierten und spezifischen Verfahren schwer zu erlernen sind, um Faktor drei und humane induzierte pluripotente Stammzellen in klinischer Qualität zu erhalten, um mit dem Auftauen zu beginnen. Erwachsene dermale humane Fibroblasten oder HAFs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für zwei Minuten.

Achten Sie darauf, den Deckel des Fläschchens nicht in das Wasser zu tauchen. Geben Sie die eine Milliliter-Aufschlämmung der Zellen in ein 15-Milliliter-Chronikfläschchen, um die Zellen zu resuspendieren und das DMSO tropfenweise zu verdünnen. Fügen Sie langsam vier Milliliter vorgewärmtes Huff-Medium hinzu und zentrifugieren Sie das Violett 200 Mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Dann aspirierst du das Sup, Nacent und Reus. Suspendieren Sie die Zellen in einem Medium bis zu 100.000 Zellen pro Milliliter in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 0,2 % Gelatine. Fügen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu und fügen Sie dann zwei Milliliter Suspension zu einer zweiten hinzu.

Nun, zur Messung der Multiplizität von Infektionen oder MOI zu verwenden, schütteln Sie die Platte von Seite zu Seite und hin und her, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, bevor Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer inkubieren. 24 Stunden später, nach dem Zählen, tauen Sie die Zellen zweimal auf, zentrieren Sie die acht Transduktionseinheiten oder S eines gleichwertigen lentiviralen Konzentrats und verwenden Sie Huff-Medium, um es auf eins mal 10 zu verdünnen Zu den acht TS pro Milliliter wird ein halbes Medium verwendet, das mit acht Mikrogramm pro Milliliter Transfektionsreagenz ergänzt wird. Transduzieren Sie die Zellen mit einem Infektionsverhältnis von 10.

Mischen Sie die Transduziervertiefungen gleichmäßig und inkubieren Sie sie über Nacht, etwa 24 Stunden nach der lentiviralen Transduktion. Entfernen Sie das Huff-Medium und ersetzen Sie es durch normales humanes pluripotentes Stammzell- oder PSC-Medium. Wechseln Sie das Medium täglich an den Tagen zwei bis sechs an den sechs Tagen in zwei 0,2 % mit Gelatine überzogene 10 Zentimeter Schalen Teller 1,5 bis 1,75 mal 10 zu den sechs embryonalen Fibroblasten der Maus, die von Komplementkomponentenfaktor eins oder CF eins abgeleitet sind, Mäuse in halbem Medium am siebten Tag.

Fügen Sie Trips bei Raumtemperatur in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen der reprogrammierten Fibroblasten hinzu. Sie hebt die Zellen vorsichtig ab und spinnt eine 100-fache G mit frischer humaner PSC-Medium-Platte alle Zellen im Verhältnis eins zu 16 auf zwei 10 Zentimeter CFI-Meth-Platten. Die Aggregate werden in einer Spiralbewegung im Uhrzeigersinn verteilt und ca. 48 Stunden inkubiert, bevor das Medium ausgetauscht wird.

Nach drei bis vier Wochen wird mit einer 21-Gauge-Nadel acht bis 10 einzelne Stücke spezifischer Kolonien mit typischer ESC-ähnlicher Morphologie entnommen und nach der Expansion in einzelne Vertiefungen von CFI MFS subklont. Bestätigen Sie, dass die Zellen pluripotent sind, indem Sie den Embryokörper bilden und die Markerexpression analysieren, nachdem Sie die Integrationsstelle des Stammautos überprüft haben, wie im Begleittextprotokoll beschrieben. Verbrauchsteuerstängel Fahrzeug, indem zunächst das alte menschliche PSC-Medium in drei Milliliter kombiniertes Standard-PSC-Medium abgesaugt wird.

45 Mikroliter konzentriertes Adeno Cree Pur oder Virus mit acht Mikrogramm pro Milliliter Transfektionsmittel. Geben Sie dann zu den Zellen und inkubieren Sie 24 Stunden lang, nach der Inkubation aspirieren Sie das virale Supinat, induzieren Sie das menschliche PSC-Medium, um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann HPSC-Medium mit zwei Mikrogramm pro Milliliter reinem Mycin hinzu und ersetzen Sie es täglich nach fünf Tagen, subklonen Sie die restlichen Kolonien und erweitern Sie sie, wie weiter oben im Video beschrieben.

Als nächstes tauen Sie ein Fläschchen mit der Prä-Eloqua-Basalmembranmatrix auf Eis auf und verdünnen Sie kaltes Basalmedium auf eine Endkonzentration von eins bis 30. Verwenden Sie einen Milliliter pro Vertiefung, um die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen zu beschichten, und lassen Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. Dann schraffieren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel mindestens 20 bis 30 Kolonien aus einem zuvor mit Mes beschichteten Brunnen.

Achten Sie darauf, dass Sie die Hebung der Zellen und die Übertragung der Zellen von der Platte reduzieren. Nach der einstündigen Inkubation aspirieren Sie die Matrix mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus der beschichteten Vertiefung. Entfernen Sie die Stücke der Kolonien, indem Sie sie vorsichtig von der alten Platte abkratzen, und legen Sie sie vorsichtig in drei Milliliter frisch gemischtes Medium, einen in einer mit Matrix beschichteten Platte.

Nach 48-stündiger Inkubation ist das Medium täglich zu wechseln, wenn die postexzidierten und feederfrei umgewandelten HI PSCs eine Co-Flüssigkeit von 80 % erreichen. Verwenden Sie ein kommerzielles DNA-Extraktionskit, um die genomische DNA mit den hier gezeigten Primern zu extrahieren, die spezifisch für die exogene Integration des Stamm-Car-Lentivirus sind. Analysieren Sie die DNA mittels PCR auf eine ordnungsgemäße Exzision, um die nach der Exzidierung herausgeschnittenen HI-PSCs auf GMP-Bedingungen zu überführen.

Mischen Sie HPSC-Kombinationsmedium eins und GMP-konformes Medium in klinischer Qualität oder kombiniertes Medium zwei in einem Verhältnis von 80 bis 20 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie das alte kombinierte Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch drei Milliliter der neuen Lösung des warmen Mediums. Ersetzen Sie das Medium täglich für drei Tage und passagieren Sie gemäß dem Textprotokoll, um die richtige Koloniegröße und -dichte am vierten Tag beizubehalten, ersetzen Sie das Medium durch eine 50 50 Mischung aus warmen kombinierten Medien eins und zwei inkubieren Sie drei Tage lang.

Ersetzen Sie das Medium täglich am siebten Tag, wechseln Sie zu einem Verhältnis von 20 bis 80 der erwärmten kombinierten Medien eins bzw. zwei und ersetzen Sie es drei Tage lang täglich. Wechseln Sie am 10. Tag zu warmem, 100%-kombiniertem Medium zwei und wechseln Sie täglich. Die Zellen befinden sich nun in einem vollständig definierten Xeno-freien Medium.

Als nächstes, nachdem ein definiertes Xeno-freies Substrat verwendet wurde, um eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu beschichten, ersetzen Sie das Xeno-freie Medium in einer Vertiefung von Konfluenzzellen durch frisches Medium, das ein x Gestein enthält. Nach einer einstündigen Inkubation die Zellen mit einer 18-Gauge-Nadel mechanisch in die frisch zubereiteten Zellen einfüllen. Lassen Sie die Zellen zwei Tage lang ungestört inkubieren, um eine maximale Anheftung zu ermöglichen, bevor Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll charakterisieren.

Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Bild von drei verschiedenen präexzidierten H-I-P-S-C-Linien nach der Reprogrammierung mit dem Stamm-Car-Ansatz auf einer Schicht von mes, hier ist das Post-Exzisions-Reverse-Transkriptions-PCR-Gel, das einen bestimmten Subklon zeigt, der völlig frei vom Stamm-Car-Lentivirus ist, was durch das Fehlen einer Amplikon-Bande belegt wird, die für eine bestimmte Sequenz endogen zum Stamm-Car spezifisch ist. In dieser Abbildung sind prä-con-konvertierte IPCs auf einer Xeno-haltigen Matrix und Post-Excise-freie Xeno-IPCs der Güteklasse H auf synthetischer Matrix mit der Quantifizierung von Standard-Pluripotenz-assoziierten Faktoren dargestellt, einschließlich SOX zwei, OCT vier und Nanog. Die Verwendung von QPCR wird hier veranschaulicht.

Schließlich wurden, wie hier zu sehen ist, prä-con-konvertierte und post-konvertierte HI-PSCs unter GMP-Bedingungen mittels Durchflusszytometrie auf die Sialinsäure und Glykol-Neuronsäure getestet, die auf nicht-humane Antigene hinweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane adulte dermale Fibroblasten mit dem Stemco-Reprogrammierungsvirus umprogrammiert, das Virus aus dem Genom herausschneidet und diese HI-PSCs dann vollständig in klinische Bedingungen umwandelt, die vollständig mit menschlichen Therapeutika kompatibel sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Staca, einem antiviralen Vektor der dritten Generation, äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte eine geeignete PSA und ein VSL-Zweiplus-Gewebekulturraum verwendet werden.