Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Entwicklung einer neuartigen DNA-Extraktionstechnik, die die mechanische DNA-Homogenisierung mit der Entfernung von PCR-Inhibitoren und der Goldstandard- und somatischen Extraktionsmethode kombiniert, um Umweltproben entlang des Kontinuums der Geflügelproduktion zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Umweltprobe in Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt wird, die eine Mischung aus Kügelchen enthalten, um die komplexen Umweltproben effektiv zu homogenisieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Röhrchen in einen Hochleistungs-Homogenisator zu geben, um Nukleinsäuren effizient aus den Bakterienzellen und der Umweltmatrix freizusetzen.

Als nächstes wird das Homogenat als Ausgangsmaterial für die enzymatische DNA-Extraktionsmethode des Goldstandards durch die PCR-Inhibitionsbindungsphase verwendet. Der letzte Schritt besteht darin, die Proben in eine DNA-Extraktionsroboter-Workstation zu legen, um dem Benutzer extrahierte DNA-Proben zur Verfügung zu stellen, die für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen geeignet sind, letztendlich quantitative PCR- und Mikrobiomanalyse mit der Aluminium-MiSeq-Plattform, um zu zeigen, dass diese neuartige Hybridmethode im Vergleich zur Verarbeitung von Proben mit der mechanischen oder enzymatischen Extraktionsmethode die beste Kombination aus qualitativen und quantitativen Bewertungen der gesamten Bakteriengemeinschaften bietet allein. Diese Methode bietet Einblicke in die Analyse mikrobieller Gemeinschaften entlang des Kontinuums der Geflügelproduktion, kann aber auch auf andere landwirtschaftliche Systeme wie Schweine-, Rinder- oder Pflanzenproduktion angewendet werden, die ähnlich komplexe Umweltproben enthalten.

Kaitlyn Griffin, eine Studentin in meinem Labor, wird dieses Verfahren heute vorführen. Um das Experiment zu beginnen, stellen Sie ein Wasserbad auf 95 Grad Celsius ein. Wiegen Sie als Nächstes drei Repliken von 0,33 Gramm ab, um insgesamt ein Gramm Raumtemperatur, Boden oder Fäkalien in eine zwei Milliliter Lysematrix ET-Röhrchen-Wechselhandschuhe zwischen den Proben zu analysieren.

Geben Sie 825 Mikroliter Natriumphosphatpuffer und 275 Mikroliter Prälyselösung oder PLS in ein Probenröhrchen. Dann die Proben 15 Sekunden lang vortexen, nach dem Mischen zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 14.000 g. Den Überstand dekantieren und 700 Mikroliter Puffer A SL zugeben. Wirbeln Sie dann das Rohr fünf Sekunden lang durch.

Öffnen Sie jeweils ein Röhrchen, um eine Kontamination zu vermeiden. Stellen Sie anschließend sicher, dass sich ein Kopfraum von 10 % des Gesamtvolumens im konischen Röhrchen befindet, bevor Sie die Proben in das Instrument fast prep 24 einsetzen. Homogenisieren Sie die Proben mit einer Geschwindigkeit von sechs Metern pro Sekunde für 40 Sekunden.

Beachten Sie den Unterschied zwischen Fast Prep 24 und Vortexen nach der Homogenisierung. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 14.000 g. Der Überstand wird in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die verbleibende Probe im ET-Röhrchen der Lysingmatrix wird mit weiteren 700 Mikrolitern eines SL-Puffers erneut homogenisiert und zentrifugiert.

Platzieren Sie mit den vorherigen Einstellungen Kunststoff-Verriegelungsclips an den Probenröhrchen, um sicherzustellen, dass sie nicht aufspringen, und inkubieren Sie die Überstände fünf Minuten lang in einem 95 Grad Celsius warmen Wasserbad. Öffnen Sie anschließend jedes Mikrozentrifugenröhrchen, um den Druck abzulassen, verschließen Sie die Röhrchen wieder und wirbeln Sie sie 15 Sekunden lang ein. Zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 14.000 GS.

Nach der Zentrifugation werden 1,2 Milliliter des Überstands in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Legen Sie dann die Blisterverpackung mit der Lasche direkt über das geöffnete Mikrozentrifugenröhrchen und schieben Sie die Lasche vorsichtig aus der Blisterverpackung in das Röhrchen. Um einen Kontakt zwischen der Inhibit-X-Tablette und dem Röhrchen zu vermeiden, fügen Sie jeder Probe eine Inhibit-X-Tablette hinzu.

Drehen Sie dann die Röhrchen, bis sich die Proben in eine gleichmäßig cremefarbene Flüssigkeit verwandeln. Inkubieren Sie die Proben eine Minute lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 14.000 Käse, wobei verbleibende Partikel am Boden der Röhrchen vermieden werden. Übertragen Sie die gesamte Flüssigkeit in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei voller Drehzahl. Bevor Sie mit der automatisierten DNA-Aufreinigung beginnen, stellen Sie sicher, dass die Workstation die richtige Menge an Filterspitzen und Puffern enthält. Als nächstes fügen Sie Ellucian-Röhrchen und Filterröhrchen zu den Rotoradaptern hinzu und geben Sie 400 Mikroliter jeder Probe in den mittleren Schlitz des Rotoradapters.

Setzen Sie die Rotoradapter in die Zentrifuge der Workstation ein und stellen Sie sicher, dass alle Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen ordnungsgemäß im Rotoradapter befestigt sind. Geben Sie die Proteinase-K-Lösung in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und setzen Sie es in Schlitz A an der Workstation ein. Legen Sie zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit sicherem Verschluss in den Schüttelbereich der Workstation und stellen Sie sicher, dass die Deckel der Probenröhrchen sicher platziert sind.

Wählen Sie über den Touchscreen an der Workstation das DNA-Stuhl-Nachweisprotokoll für menschliche Stuhlpathogene aus und lesen Sie die nachfolgenden Bildschirme durch, um sicherzustellen, dass die Workstation korrekt geladen wurde. Wenn alle Prüfbildschirme durchlaufen sind, wählen Sie Start, um das Protokoll auszuführen. Entfernen Sie dann die Proben von den Rotoradaptern.

Kombinieren Sie die drei Replikataufreinigungen für eine einzelne Probe mit einem auf Zentrifugation, Verdampfung basierenden System. Die Probe wird mit Tris-EDTA-Puffer auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern eluiert. Zum Schluss verschließen Sie die Proben und stellen sie bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie für die nachgelagerte Analyse benötigt werden.

Diese Grafik zeigt, dass die mechanische Methode durchweg die insgesamt höchsten Schätzungen der gesamten bakteriellen normierten Genhäufigkeit für Stuhl- und Streuproben lieferte. Die enzymatische Methode hatte in allen Fällen die niedrigsten Schätzungen. Die neuartige Hybridextraktionsmethode ergab die beste Kombination aus qualitativen und quantitativen Schätzungen der Gesamtbakteriengemeinschaft.

Von den drei getesteten Extraktionsmethoden. Sie sollten nun ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie diese neuartige, halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsmethode durchführen können, und ihren Nutzen in der qualitativen und quantitativen Bewertung mikrobieller Gemeinschaften aus komplexen Umweltproben sehen.