Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende Bilder von Photorezeptorproteinen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie zu sammeln. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe des Photorezeptors entnommen und verdünnt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Proteinprobe für etwa 30 Sekunden auf eine frisch gespaltene und saubere Glimmeroberfläche aufzutragen.

Dann wird die MICA mit Puffer gespült, um ungebundene und lose anhaftende Moleküle zu entfernen. Anschließend wird die Probe an einer Flüssigkeitszelle befestigt, die mit einer entsprechenden Sonde ausgestattet ist. Diese Baugruppe wird auf den Scanner geladen.

Nachdem Sie die Flüssigkeitszelle mit Pufferlösung gefüllt haben, greifen Sie mit der Spitze in die Probe ein und beginnen Sie mit dem Scanvorgang. Letztendlich die Rasterkraftmikroskopie unter Einbeziehung der Spitzenkraft. Die quantitative Kartierung nanomechanischer Eigenschaften wird verwendet, um Bilder von einzelnen Photorezeptorproteinen auf der Probenoberfläche zu sammeln.

Die Rasterkraftmikroskopie, die die Spitzenkräfte q und m berücksichtigt, kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Molekularbiologie beantworten, z. B. welche wichtigen strukturellen und chemischen Eigenschaften die Funktion biologisch aktiver Makromoleküle bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber gängigen Methoden wie NMR und Röntgenkristallographie besteht darin, dass hochauflösende Bilder von intakten Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in einer biologisch relevanten Umgebung erhalten werden können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Abstimmung der Sonde und der Lösung mehrere Schritte erfordert, von denen einige recht komplex sind.

Mit peak force q und m und automatisierter Software werden mehrere dieser Schritte vereinfacht, wodurch der Prozess für neue Benutzer und Studenten erheblich vereinfacht wird. Dieses Verfahren wird von drei Studenten aus meinem Forschungslabor demonstriert, Marie Kroger, Blair Sorenson und Jessica Thomas. Diese Studenten werden im kommenden Jahr ein Aufbaustudium in den Bereichen Mikrobiologie, Chemieingenieurwesen und Chemie absolvieren.

Diese Elemente müssen in einer bestimmten Reihenfolge aktiviert werden. Zuerst den Computer, dann den Controller und schließlich das faseroptische Licht. Das Mikroskop muss ein FM und LF fm lesen.

Die Kamera muss in der Software über dem optischen Kopf eines FM zentriert werden. Folgendes sollte ausgewählt werden. Die Versuchskategorie sind die mechanischen Eigenschaften.

Die Experimentgruppe ist quantitative nanomechanische Kartierung, und das Experiment ist die Spitzenkraft q und m in Flüssigkeit. Wenn die Einstellungen richtig gewählt sind, kann das Experiment geladen und eingerichtet werden. Der Kamerafokus sollte zuerst mit dem Z-Objektiv eingestellt werden, gefolgt von der Verwendung der Kurssteuerung, um den Tisch zu positionieren, das Ziel ist es, die A-FM-Kopfblende einen Millimeter vor der Tischoberfläche zu platzieren, um die Probenscheiben mit frisch gespaltenem Glimmer mit kreisförmigen Scheibengreiferpinzetten zu manipulieren.

Beginnen Sie mit dem Zusammenbau der Flüssigkeitszelle aus makellos gereinigten Teilen. Befestigen Sie zunächst den Schlauchadapter an den Anschluss an den sauberen Flüssigkeitszellen. Drücken Sie dann mit einer Flachkopfpinzette sehr vorsichtig den O-Ring in seine Vertiefung auf der Flüssigkeitszelle.

Drücken Sie dann auf den Sondenhalterclip leicht auf die Feder und drehen Sie sie von der Nut weg. Fassen Sie die Sonde mit derselben Pinzette an und schieben Sie sie in die Rille, so dass die Spitze zur Mitte der Zelle zeigt. Befestigen Sie dann die Sonde mit dem Clip.

Der nächste Schritt besteht darin, zu überprüfen, ob die Klemme an der A-FM.It vollständig eingefahren sein muss. Platzieren Sie die Baugruppe mit der Vorderseite nach unten auf der Probe. Montieren Sie die Baugruppe zur Stabilisierung auf die Bolzen des A FM.

Senken Sie die Klemme ab. Um den O-Ring zu inspizieren, drücken Sie den Abwärtsschalter am Mikroskop, bis der O-Ring zu sehen ist. Es sollte zwischen der Stützscheibe und der Fluidzelle fest zusammengedrückt werden.

Die Fluidzelle kann über den groben Einstellknopf scharf gestellt werden. Fokussieren Sie sich anschließend mit der XY-Einstellung auf die Sondenspitze. Es sieht aus wie ein metallisches goldenes Dreieck.

Bewegen Sie nun mit dem Pizo-Hebel nach unten die Spitze nahe an die Probenoberfläche, stellen Sie den Fokus auf die Spitzen und die Reflexion ein und überwachen Sie die Position des Auslegers in Bezug auf diese Reflexion. Derzeit sollten sie eng ausgerichtet sein, sich aber nicht vollständig überlappen. Bereiten Sie nun die Spritze vor.

Füllen Sie es mit einem Milliliter Pufferlösung und befestigen Sie den Adapter. Befestigen Sie dann die Spritze am Auswurfschlauch und fahren Sie den Kolben vollständig aus. Befestigen Sie dann den Schlauch mit einem Adapter an der Flüssigkeitszelle, um die Kammer zu füllen, und drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis die Mitte der Kammer voll ist.

Es sollten keine Luftblasen entstehen oder aus der Flüssigkeitszelle auf das Mikroskop gelangen. Platzieren Sie dann die Spritze in einer gut gestützten Position über der Kammer. Verwenden Sie als Nächstes den Kamera-Feed und die XY-Verschiebungsknöpfe.

Um den Laser auf dem Bildschirm zu lokalisieren, sollte er als diffuser roter Punkt erscheinen. Sobald Sie es gefunden haben, verwenden Sie die Lasersteuerung, um es zur Sonde zu bewegen. Stellen Sie nun die Laser- und Spiegelsteuerung ein, bis das Summensignal am Mikroskop auf vier bis sechs maximiert ist, und stellen Sie die Quadrantendiode ein.

Verwenden Sie dann die Knöpfe am Scankopf, um die vertikalen und horizontalen Auslenkungen einzustellen, bis die Werte am Mikroskop wieder so nahe wie möglich an Null liegen. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Akquisitionsoptionen auswählen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie die Abtastrate im Fenster "Abtastungen pro Zeile" auf etwa ein Hertz ein.

Geben Sie 256 ein. Für die automatische Steuerung des Scan-Assists. Wählen Sie eine Person für die automatische Z-Begrenzungsauswahl der Scan-Unterstützung aus.

Die Z-Grenze sollte 500 Nanometer betragen, und die Scangröße sollte ein Mikrometer betragen. Wenn Sie die Einstellungen richtig eingestellt haben, messen Sie die Sonde. Beobachten Sie die Änderung der Z-Pazo-Spannung, wenn sich die Sondenspitze der Oberfläche nähert.

Wenn die Spitze außerhalb des Bereichs liegt, sich zurückzieht und sich wieder nähert, muss die Sondenspitze möglicherweise ausgetauscht werden. Wenn dies nicht funktioniert, sollten beim Einrasten der Spitze Linien in jedem der Erfassungsfenster angezeigt werden, und diese Linien erstellen ein Bild. Beginnen Sie mit der kontinuierlichen Aufnahme von Bildern des Glimmers.

Vergrößern Sie die Kamera langsam, um sicherzustellen, dass die MICA-Oberfläche sowohl flach als auch sauber ist. Bereiten Sie eine Petrischalen mit vier Kammern mit gekühlter Pufferlösung für die Bildgebung vor. Jede Kammer benötigt mindestens fünf Milliliter.

Bevor Sie ein Aliquot aus verdünntem Protein einnehmen, rühren Sie es vorsichtig mit der Mikropipette um. Nehmen Sie dann ein 200-Mikroliter-Aliquot und tragen Sie das verdünnte Protein auf die MICA-Oberfläche auf. Warten Sie etwa 30 Sekunden, bis sich die Lösung auf der Oberfläche befindet.

Heben Sie dann mit den Scheibengreifern die Scheibe an, ohne sie zu kippen, und tauchen Sie sie sofort in den ersten Pool mit Pufferlösung. Stellen Sie eine Sekunde lang sicher, dass die Scheibe parallel zur Bank bleibt. Es ist sehr wichtig, die Probe während des Spülschritts parallel zur Petrischale zu halten.

Diese weichen, flexiblen Moleküle können auf der Oberfläche durch starke Ströme wässriger Lösung verzerrt werden. Tauchen Sie dann die Disc jeweils eine Sekunde lang pro Pool kurz in jeden der anderen drei Pools ein. Übertragen Sie dann die Disc auf ein trockenes und staubfreies Tuch.

Lassen Sie die überschüssige Feuchtigkeit auf das Tuch übertragen, aber lassen Sie die Disc nicht vollständig trocknen. Lassen Sie das Tuch die Probe nicht berühren. Nehmen Sie die Probe vorsichtig mit den Scheibengreifern aus dem Tuch und legen Sie die Probe auf den A FM-Scanner. Platzieren Sie die Flüssigkeitszelle auf der Probe und fahren Sie mit der Einrichtung und Bildgebung fort.

Nachdem alle Parameter für die Sonde korrekt eingestellt sind, sind die Federgröße und der Spitzenradius richtig eingestellt. Messen Sie die Sonde wie bei der Bildgebung. Micah, beobachte das ZP-Azo, wie sich die Spitze der Oberfläche nähert.

Lassen Sie den Scanner beim Aufnehmen von Bildern mindestens zwei aufeinanderfolgende Durchgänge lang denselben Bereich abbilden. Verwenden Sie die kontinuierliche Aufnahme, um jedes Bild zu speichern. Passen Sie die Bildgröße und den Speicherort wie gewünscht an.

Sobald die automatisierte Software die Scanparameter für eine bestimmte Bildgröße angepasst hat. Schalten Sie die Software auf fine aus. Passen Sie den Fokus des Bildes manuell an, passen Sie die Scanrate, die Z-Grenze, die Anzahl der Zeilen und den Sollwert an.

Wenn das Bild zu unscharf wird, schalten Sie die Software wieder ein, um zur ursprünglichen Ausgangsposition zurückzukehren. Wenn Sie auf ein Protein zoomen, verringern Sie die Abtastrate und erhöhen Sie die Anzahl der Zeilen proportional, um die Auflösung des Bildes zu erhöhen. Später. Wenn Sie die Bilder analysieren, glätten Sie zunächst das Bild, indem Sie auf das Symbol "Abflachen" klicken.

Wählen Sie die nullte Ordnung aus und führen Sie die Operation aus. Manchmal ist es notwendig, eine glatte Passform zu verwenden, um entsprechend flache Bilder zu erhalten. Wählen Sie das Symbol für die einfache Passform aus und zeichnen Sie mit dem Cursor eine Ebene über einen flachen Bereich im Bild.

Führen Sie die glatte Passung aus, und wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Querschnitt aus, um die Abmessungen des Proteins zu messen. Zeichnen Sie mit dem Cursor eine Linie über das zu analysierende Molekül oder den zu analysierenden Bereich.

Wiederholen Sie diesen Vorgang in mehreren Bereichen. Wenn ein Overlay gewünscht ist, kann eine beliebige Anzahl biologischer Moleküle mit einem FM für ein Photorezeptorprotein in seinem lichtadaptierten Zustand untersucht werden, ein frisch gespaltenes Glimmersubstrat ist eine geeignete ebene Oberfläche für die Proteinabsorption. Einzelne Photorezeptorprotein-Dimere waren mit dem Spitzenkraft-QNM-Modus beobachtbar.

Die Pfeile zeigen auf einzelne Dimere und das Sternchen kennzeichnet ein Proteinaggregat mit Hilfe einer Bildanalysesoftware. Querschnitte der Proteine können gemessen werden, nachdem das Bild abgeflacht wurde. XY-Daten korrelieren mit den Höhenmessungen.

Diese können für eine Vielzahl von Berechnungen verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein A FM-Experiment einzurichten, um hochauflösende Bilder von Proteinen auf einer Oberfläche in einer biologisch relevanten Umgebung zu sammeln. Mit der Spitzenkraft q und m Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei bis vier Stunden durchgeführt werden.

Daher ist die Spitzenkraft q und m eine geeignete Form der Rasterkraftmikroskopie, um Studenten vorzustellen, die in Laborkursen wie instrumenteller Analyse, Biochemie und moderner Physik eingeschrieben sind. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Methode Forschern auf dem Gebiet der Rastersondenmikroskopie den Weg, biologische Moleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und sogar lebende Zellen in biologisch relevanten Medien zu erforschen.