Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs viral zu manipulieren, um Proteine von Interesse zu überexprimieren. Für die In-vitro-Studie der ZNS-Myelinisierung Nation wird dies durch die erste Klonierung eines lentiviralen Vektors erreicht. Die nächsten Schritte sind die Herstellung des Lentivirus und die Bestimmung der optimalen Viruskonzentration für das Experiment.

Anschließend werden präparierte und kultivierte OPCs mit dem Lentivirus transduziert. Der letzte Schritt besteht darin, die transduzierten OPCs auf kultivierte Neuronen zu säen, die aus dem DRG seziert wurden. Letztendlich werden die myelinisierenden Co-Kulturen mittels Western-Blot-Analyse auf Myelinproteinexpression untersucht und durch Immunfärbung für die Bildung myelinisierter axonaler Segmente sichtbar gemacht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. pharmakologischen Werkzeugen, besteht darin, dass der lentivirale Ansatz es uns ermöglicht, entweder Wildtyp- oder mutierte Proteine in unserem gewünschten Zelltyp, wie in diesem Fall Oligodendrozyten, selektiv zu überexprimieren. Zur Vorbereitung klonen Sie die erforderlichen 2K-Vektoren mit sieben geliehenen Vektoren, wie im Textprotokoll beschrieben, am Morgen des Tages der Transfektion, 32 Millionen HEK 2 93 T-Zellen in einem T 1 75-Kolben mit 25 Millilitern Medium herstellen. Entscheidend ist, dass diese Zellen vor der Transfektion festgeklebt werden müssen, also plattieren Sie sie bei Bedarf früher. In einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen wird ein Mastermix für die Transfektion des T 1 75-Kolbens hergestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben, DNA in den warmen DMEM-Vortex gegeben, dann zuletzt steriles PEI hinzugefügt, um eine vorzeitige Ausfällung zu vermeiden.

Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen drei- oder viermal umdrehen und dann die Mischung etwa 15 Minuten lang auf der Bank inkubieren. Wechseln Sie das Medium auf den Zellen und fügen Sie dann die Transfektionsmischung hinzu. DROPWISE mischt das Medium vorsichtig über die Zellen und inkubiert die Zellen dann über Nacht.

Am nächsten Tag. Die GFP-Expression kann durch Fluoreszenzmikroskopie überprüft werden. 48 Stunden nach der Transfektion entnehmen Sie die erste Charge des Virusüberstands und geben Sie 25 Milliliter frisches Medium in die Zellen.

Zentrifugieren Sie den Virusüberstand bei 1.140 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Virusüberstand ohne das Pellet der Zelltrümmer in ein neues Röhrchen und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Entnehmen Sie am nächsten Tag, 72 Stunden nach der Transfektion, die letzte Charge der Virusüberstandszentrifuge, um die Zelltrümmer zu entfernen, und legen Sie eine Zelle mit der ersten Charge des geklärten Virusüberstandes.

Konzentrieren Sie dann das Virus, indem Sie den Virusüberstand 90 Minuten lang bei 170.000 g ultrazentrifugieren. Bei vier Grad Celsius. Entladen Sie die Ultrazentrifuge und gießen Sie den Überstand weg, so dass ein Gaumen mit gefälltem PEI und dem Virus zurückbleibt, der am Boden des 30-Milliliter-Röhrchens nicht sichtbar ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang. Zentrifugieren Sie alle viralen Supernat in Chargen in denselben 30-Milliliter-Röhrchen, um das Virus zu konzentrieren und das Virus in jedem Ultrazentrifugenröhrchen zu resuspendieren. Geben Sie 500 Mikroliter Sato-Medien hinzu und decken Sie die Tube mit Folie ab.

Wirbeln Sie dann das Röhrchen 30 Sekunden lang vor und lösen Sie das Pellet mechanisch mit einer Pipettenspitze. Wiederholen Sie diesen Zyklus des gelösten Wirbels etwa sechsmal, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig in das Sato-Medium suspendiert ist. Sammeln Sie nun alle resuspendierten Viren in Sato in einem frischen Mikroröhrchen.

Schleudern Sie den gepoolten Überstand eine Minute lang kurz bei maximaler Geschwindigkeit herunter. Um das PEI zu pelletieren, sammeln Sie den Überstand, der das Virus enthält, und filtern Sie, indem Sie die Lösung mit einer Spritze durch einen 0,45-Mikron-Filter leiten, um sie einzuwickeln. Aliquotieren Sie das gereinigte Virus in Sedia in 2050- und 100-Mikroliter-Volumina und lagern Sie sie alle bei minus 80 Grad Celsius.

Für dieses Protokoll haben primäre Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. OPCs, die in 10 Zentimeter großen Platten mit 10 Millilitern Sedia kultiviert werden, die die folgenden Wachstumsfaktoren enthalten, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT drei, und für die Zellen müssen 24 Stunden lang unter 8% Kohlendioxid kultiviert worden sein. Beginnen Sie mit dem Ansaugen des Mediums und entfernen Sie es vollständig.

Ersetzen Sie es dann durch 10 Milliliter des gleichen Mediums mit den Wachstumsfaktoren. Infizieren Sie Ihre OPCs mit Lentiviren und exprimieren Sie das Protein von Interesse, indem Sie das erforderliche Virusvolumen tropfenweise in das Medium geben. Ebenfalls in einer separaten OPC-Platte mischen Sie das Kontroll-Lentivirus, das nur GFP exprimiert, in die Medienkultur, die Zellen für weitere 48 Stunden.

Sammeln Sie dann die OPCs von den Platten, um sie auf die kultivierten GRG-Neuronen zu säen. Spülen Sie zunächst jede Platte zweimal mit acht Millilitern EBSS aus. Bilden Sie einen Milliliter Trypsin EDTA 0,05% mit neun Millilitern warmem EBSS.

Geben Sie fünf Milliliter des verdünnten Trypsins auf jede Platte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für bis zu zwei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie fünf Milliliter 30% FBS in EBSS hinzufügen.

Dann mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie die OPCs von der Plattenoberfläche. Drehen Sie die Platte jedes Mal um eine Vierteldrehung, um alle Zellen zu sammeln.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 180 Gs. Aspirieren Sie nun den Überstand und die Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter warmem Saddo-Medium ohne Wachstumsfaktoren und zählen Sie die Zellen.

Bereiten Sie als Nächstes die DRG-Neuronen vor, die auf den 22-Millimeter-Deckgläsern kultiviert werden, indem Sie das Medium vollständig von ihrer Platte absaugen. Säen Sie dann vorsichtig 200.000 OPCs tropfenweise auf jeden Deckglas. Das Aussaatvolumen muss weniger als 200 Mikroliter pro Deckglas betragen.

Lassen Sie die Zellen sich absetzen, ohne die Platte zu bewegen. Nach 10 Minuten befüllen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter warmem Pulver. Wiederholen Sie nun die verbleibenden Schwester-OPCs. Da sie Wachstumsfaktoren enthalten, können sie später zur Überprüfung der Expression des interessierenden Proteins verwendet werden.

Eine Flagge markierte die extrazelluläre signalbezogene Kinase. Ein Konstrukt wurde für die Einschränkung der Lentivirusproduktion verwendet: Enzyme wurden verwendet, um das Verpackungskonstrukt zu verifizieren, und das Zubehörkonstrukt, um die optimale Virusverdünnung für die Verwendung auf den OPCs zu bestimmen. Das IR-1-Lentivirus wurde in HEK 2 93 T-Zellen bei einem Bereich der viralen Verdünnung zu HEK 2 93 T-Zellen titriert.

Die Expressionsniveaus des interessierenden Gens nahmen mit der Zeit zu. Anschließend wurden gereinigte OPCs infiziert und mindestens zwei Tage lang kultiviert, um die Transgenexpression sicherzustellen. Die FLAG- und GFP-Spiegel wurden in den Schwester-OPCs bestätigt.

Die OPCs wurden dann auf DRG-Neuronen gesetzt. Die OPCs differenzierten sich dann zu Oligodendrozyten und begannen, wie von Westlern beurteilt, Myelinproteine zu exprimieren. Einige reife Oligodendrozyten myelinisiert, was durch MBP-färbende Axone sichtbar gemacht wurde, wurden mit Neurofilament oder Beta-3-Tubulin gefärbt, um sicherzustellen, dass die Axondichten berücksichtigt wurden.

Bei der Analyse des Myelinisierungsgrades Nach der Aussaat der OPCs ist es wichtig, sich zu kultivieren. Die Schwester-APCs. Auf diese Weise kann die Expression des interessierenden Proteins oder des Tags auf dem Protein of Interest in den Schwester-APCs verifiziert werden, wenn dies in der Co-Kultur nicht möglich ist.