Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mukosale Candidiasis anhand des juvenilen Zebrafisches zu modellieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Lösung, die lebende Albiane enthält, in eine Mikronadel geladen wird. Im zweiten Schritt wird ein definiertes Volumen der Hefezellen in die Schwimmblase eines juvenilen Zebrafisches injiziert.

Anschließend werden die Fische auf ein homogenes Inokulum gesiebt und für die gewünschte Zeit inkubiert. Im letzten Schritt wird mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie die dynamische Interaktion des Erregers mit dem Immunsystem des Zebrafisches verfolgt. Zusätzlich kann die Schwimmblase mikroseziert werden, um konfokale Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten.

Die Methode, die wir hier vorstellen, beantwortet zentrale Fragen der Pilzimmunologie sowie der Mikrobiologie, wie z.B. die genaue Abfolge von Ereignissen, die zu einer fehlgeschlagenen Immunantwort auf den Pilzerreger und Candida-Leuchtfeuer an den Schleimhautoberflächen führen. Vor Beginn des Eingriffs erwärmen Sie eine Injektionsschale mit 2%aros in einem 33 Grad Celsius heißen Inkubator. Verwenden Sie nach 30 Minuten eine 25-Milliliter-Pipette, um 100 Milliliter des E drei Medien plus PTU von einer Platte des vierten Tages zu entfernen, nach der Befruchtung Zebrafische, achten Sie darauf, keinen der Fische zu aspirieren, und fügen Sie zwei Milliliter von vier Milligramm pro Milliliter hinzu.

Trica Methansulfonat wird an die Medien geliefert, um die Tiere zu betäuben. Nach 15 Minuten verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Fische mit aufgeblasenen Schwimmblasen zu identifizieren, und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 30 Zebrafische auf die vorwarme Injektionsschale zu übertragen. Entfernen Sie das überschüssige Medium, halten Sie dann die Schale schräg und verwenden Sie eine Angelschnur mit einem Durchmesser von 0,012 Zoll, die in eine Boro-Silikat-Kapillare eingeklebt ist, um drei Leinen mit je 10 vertikal ausgerichteten Fischen zu machen, die jeweils als nächstes eine Tube frisch zubereiteter Meeresalbikane in einer Konzentration von 1,5 mal 10 bis zum siebten KBE pro Milliliter gründlich durchwirbeln.

Und dann laden Sie drei Mikroliter der Hefelösung auf die EC-geclippte Mikronadel. Stellen Sie die Impulsdauer auf die entsprechende Einstellung ein. Drehen Sie dann die Injektionsschale, um einen Winkel von 20 Grad zwischen der Mikronadel und dem Kopf des Fisches zu erreichen, der auf die Rückseite der Schwimmblase zeigt.

Schiebe nun die Mikronadel in die Schwimmblase, achte darauf, dass sich die Bohrung der Nadel im Lumen befindet und drücke die Pfütze. Sobald die Überprüfung, welche Fische injiziert wurden, relativ einfach ist, da der Bolus die Luftblase verdrängt und die Rückseite der Schwimmblase anschließend mit Medien gefüllt wird, kann die Co-Injektion von Phenolrot mit dem Bolus die Visualisierung einer erfolgreichen Injektion weiter erleichtern. Nachdem Sie alle 30 Fische injiziert haben, fluten Sie die Schale mit E drei Medien und leeren Sie den Fisch dann in die Auffangschale.

10 Tiere werden in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter E drei Medien überführt und die Fische mit 200 Mikrolitern Trica eingeschläfert. Ordnen Sie dann für jedes Tier vier Tropfen Vakuumfett in einem Quadrat im Abstand von einem Zentimeter auf einem Mikroobjektträger an und geben Sie zwei Tropfen frisch zubereitetes, 2 % niedrigschmelzendes Fett in die Mitte des Quadrats. Legen Sie dann einen Fisch auf einen separaten Objektträger unter ein Präpariermikroskop und überprüfen Sie, ob das Herz des Tieres aufgehört hat zu schlagen, und entfernen Sie das überschüssige Wasser.

Verwenden Sie nun eine feine Pinzette, um den Kopf in einer festen Position zu halten, und eine andere, um den vorderen Darm nach unten zu ziehen. Nehmen Sie die Schwimmblase am pneumatischen Gang auf, trennen Sie sie vom Verdauungstrakt und platzieren Sie sie in der Mitte eines der vorbereiteten Mikropräparate, bevor sich das Agro verfestigt. Legen Sie zum Schluss einen Deckschirm über das Gewebe, drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, bis er das Vakuumfett und die Agarose berührt, und stellen Sie die Schwimmblase innerhalb von 10 Minuten nach der Ernte dar.

Injektion von vier Nanolitern Meer-Albianen bei eins bis 1,5 mal 10 des siebten. KBE pro Milliliter liefert die konsistentesten Daten, was zu einem Bereich von 10 bis 50 Hefezellen pro Fisch führt. Die Verengung des Inokulums auf 15 bis 25 Hefezellen führt zu einem noch engeren Phänotyp und einer noch engeren Reaktion.

Neutrophile spielen eine Schlüsselrolle bei der Resistenz gegen Candidiasis bei Mäusen und Menschen, und die Infektion der Schwimmblase von Zebrafischen mit lebenden Albianen führt zu einer schnellen und anhaltenden Rekrutierung von Neutrophilen. Das passiert nicht, wenn hitzeabtötende Hefezellen injiziert werden. Die Filamente entwickeln sich schnell nach der Injektion der Hefezellen, wobei das filamentöse Wachstum in den ersten 24 Stunden nach der Injektion anhält, danach beginnt diese Zahl abzunehmen. Die Fähigkeit, einzelne Fische nicht-invasiv zu verfolgen, ermöglicht diese Längsschnittstudien und unterstreicht die individuellen Unterschiede im Krankheitsverlauf und in der Reaktion des Wirts.

Ein experimentelles Protokoll, das in der Mausbildgebung unpraktisch bleibt, nämlich die Wechselwirkungen von Immun- oder Epithelzellen mit calbicanen ist in dem hier vorgestellten Modell relativ einfach. Die soeben gezeigte Präparierung der Schwimmblase verbessert jedoch die Qualität der Bildgebung erheblich. Dies ist besonders nützlich bei der Visualisierung transgener Fischlinien, bei denen die Fluoreszenz ubiquitär exprimiert wird und es eine fremde Fluoreszenz im umgebenden Gewebe gibt, wie in diesen Bildern einer präparierten Schwimmblase aus der alpha Catine Citrin-Fischlinie beobachtet

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie z. B. die Morph-Technologie oder die chemische Hemmungsbehandlung, können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, wie z. B. welche Rolle eine bestimmte Immunzelle oder ein bestimmter Signalweg bei der Candidiasis der Schleimhaut spielt.