Name: Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung von Mukosaler Candidiasis durch Injektion von Candida albicans in die Schwimmblase von Zebrafisch-Larven. Konfokale Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Beobachtung von Pathogen-Immun-Interaktionen.

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Die Autoren danken Dr. Le Trinh und Dr. Tobin für die großzügige Bereitstellung der α-Catenin: Citrin Angelschnur und Bill Jackman für die Erlaubnis, die Dreharbeiten in seinem Labor zu tun. Die Autoren erkennen die Finanzierungsquellen National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 und R15AI094406) und USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Dieses Manuskript ist als Haupt Land- und Forstwirtschaft Experiment Station Veröffentlichungsnummer 3371 veröffentlicht.

HINWEIS: Alle Zebrafisch Pflegeprotokolle und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien unter Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Protokoll A2012-11-03 geführt. 1. Zebrafisch Aufzucht bis 4 Tage nach der Befruchtung <ol><li> Sammeln AB Zebrafisch oder andere transgene Linien, innerhalb der ersten 3 Stunden nach der Befruchtung, wie in einem anderen Video 34 gezeigt. </li><li> Inkubieren 120 Eier in eine 15 cm Petrischalen mit 150 ml E3 Medien (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES; pH 6,8) mit Methylenblau (0,3 ug / ml final Konzentration) in einem 33 ° C Inkubator mit 12/12 Hell / Dunkel-Photoperiode. </li><li> Ersetzen Sie die Medien nach 6 Stunden mit E3 + PTU (1-Phenyl-2-thioharnstoff, 10 ug / ml Endkonzentration) und entfernen Sie die toten Eiern. </li><li> Inkubieren für 4 Tage bei 33 ° C, die Medien mit frischen E3 + PTU Austausch nach 2 Tagen. </li></ol> 2.Projektions Micro-Nadel Vorbereitung <ol><li> Ziehen Borosilikat Kapillare (OD 1,2 mm; 0,69 mm ID) in eine Mikronadel mit einem Nadelzieher mit den folgenden Einstellungen (550 Wärme; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time). HINWEIS: Die Einstellungen werden vom Filament variieren Filament ähnlich geformte Mikronadeln zu erhalten (siehe Abbildung 1) und muss neu eingestellt werden, wenn ein neues Filament eingebaut ist. </li><li> Füllen einer Mikronadel mit 3 &amp; mgr; l von 0,4 &amp; mgr; m-filtriert Phosphatpuffersalzlösung (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) unter Verwendung einer 20 ul-Pipette Microloader Tipp. </li><li> Richten Sie das Mikro-Nadel auf einer Mikropipette Halter auf einem Mikromanipulator mit einem Druckinjektionssystem befestigt. Stellen Sie den Einspritzdruck auf 30 PSI und der Impulsdauer bei 30 ms. </li><li> Mit einer Petrischale mit destilliertem Wasser, senken Sie die Mikronadel, bis 1/5 der Nadel in das Wasser. Clip der Mikronadel with feinen Pinzette gerade unter dem Wasserspiegel. Bringen Sie die Mikronadel aus dem Wasser, und drücken Sie das Pedal mehrmals, bis ein Bolus erscheint. </li><li> Den Durchmesser des Bolus durch Absenken der Mikronadel auf einem Hämocytometer mit einem Tropfen des Typs A Sionsöl geschichtet. Stellen Sie die Impulsdauer, um die gewünschte Lautstärke zu erhalten (siehe Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie den Gegendruck für den Bolus in Öl stabil bleiben (senken Sie den Druck, wenn der Bolus-Volumen erhöht und erhöht den Gegendruck, wenn der Bolus-Volumen nimmt ab). Notieren Sie sich die Pulsdauer für jede Mikronadel. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Mikronadel durch Absaugen es mit Hilfe eines Microloader Pipettenspitze und vertreiben die übrig gebliebenen PBS, indem Sie es wieder auf dem Injektor und spiegeln die kontinuierliche Impulsschalter. Reservieren Sie jede Mikronadel. </li></ol> 3. Candida Vorbereitung <ol><li> Streak Candida albicans mit codonoptimierten dTomato, GFP, BFP, EOS oder Far verwandeltRot aus einem gefrorenen Lager (-80 ° C lagerfähig in 25% Glycerin) mit einer sterilen Holzstab auf eine Hefe peptine Dextrose (YPD) Agar-Platte (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose , 20 g / l Agar, autoklaviert und goss 25 ml in Petrischalen) und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Wählen Sie eine Kolonie mit einer sterilen Holzdübel und impfen zu 5 ml YPD-Flüssigkeit (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose, autoklaviert und aseptisch in 5 ml in 16 x 150 mm Glaskultur aliquotiert Röhren). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 30 ° C in einer Rollentrommel bei 60 Upm. </li><li> Sammeln Sie 1 ml C albicans-Kultur und den Transfer in ein 1,7 ml steriles Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 5.000 xg für ein paar Sekunden. Leeren Sie den Überstand und 1 ml sterilem PBS, gründlich vortexen. Wiederholen Sie dies zweimal. </li><li> Zählen Sie die Kolonien mit einer Zählkammer durch Verdünnung der 1 ml Lager 1: 1000 in sterilem PBS. </li></ol> 4. Einspritzen in Zebrafischdie Schwimmblase <ol><li> Erwärmen eines Injektionsform (2% Agarose) für 30 min in einem 33 ° C Inkubator. </li><li> Zum gewünschten Zeitpunkt, zu entfernen 100 der 150 ml E3 + PTU von der 15 cm Petrischale die Fische, die zum Einspritzen mit einer 25 ml Pipette ohne Absaugen keine Zebrafisch. </li><li> Anesthetize 4 dpf Zebrafisch durch Zugabe von 2 ml einer 4 mg / ml gepufferte Tricaine Methansulfonat Lager (TR), um die verbleibenden die 50 ml Medium (Endkonzentration 200 ug / ml), und warten Sie 15 Minuten. </li><li> Unter einem Binokular, wählen Sie Fisch mit einem aufgeblasenen Schwimmblase. Fisch kann zu diesem Zeitpunkt auch für homogene Phänotyp gescreent werden, wie beispielsweise neutrophile Verteilung in MPO: GFP-Leitung mit Epifluoreszenz Präpariermikroskop. </li><li> Verdünnen Sie die C albicans Lager aus seiner ursprünglichen Konzentration (Schritt 3.8) in 1,5 x 10 7 koloniebildenden Einheiten pro ml (cfu / ml) in PBS. </li><li> Übertragen Sie 30 Zebrafisch auf die Injektions Gericht mit einem Kunststoffüberführungsrohrtte und entfernen Sie das überschüssige Medien. </li><li> Mit einem Fischerdraht-Werkzeug (in ein Borosilikatglas Kapillaren 0,012 Zoll Durchmesser Angelschnur super geklebt), stellen Sie 3 Zeilen 10 Fische, indem Sie die Injektions Teller vertikal und orientieren die Fische vertikal. </li><li> Entfernen Sie die überzähligen Medien. </li><li> Das Röhrchen gründlich vortexen mit 1,5 × 10 7 cfu / ml C. albicans. </li><li> Füllen einer Mikronadel mit 3 ul C. albicans mit einem neuen Microloader Pipettenspitze und stellen Sie die Pulsdauer auf die entsprechende Einstellung (siehe Schritt 2.9). </li><li> Drehen Sie den Einspritz Gericht, um einen Winkel von 20 ° zwischen der Mikro-Nadel und der Kopf des Fisches zu machen, mit dem Ziel in Richtung der Rückseite des Schwimmblase (3A). </li><li> Drücken Sie den Mikro-Nadel in die Schwimmblase, um sicherzustellen, die Bohrung der Nadel in das Lumen, und drücken Sie das Pedal einmal. </li><li> Wiederholen Sie für jeden Fisch und übertragen zu einer Erholung Schale (25 ml E3 + PTU) durch Fluten der Schale mit einem E3d Entleerung in die stabile Schale. </li><li> Übertragen Sie weitere 30 Fische an der Einspritz Gericht. </li><li> Wiederholen Sie die Injektion mit einer neuen Mikro-Nadel mit gut gefüllten verwirbelt C. albicans. </li><li> Fertig durch Einspritzen der PBS-Kontrolle, wenn nötig, mit einem anderen Gericht Injektion zur Vermeidung von Verunreinigungen und Transfer zu einem separaten Recovery Gericht (Schritt 4.10). </li></ol> 5. Screening der Fisch zum Wunsch Inokulum <ol><li> Vorbereitung 40 ml 0,4% niedrigschmelz Agaroselösung (LMA) durch Zusatz von 160 mg des niedrigen Schmelz Agarose zu 40 ml E3, siedet durch Mikrowellenbehandlung bis zur Auflösung und Abkühlen auf 37 ° C. Fügen Sie 400 ul TR (Endkonzentration 200 ug / ml) nach dem Abkühlen. </li><li> Nach 30 Minuten Erholung, betäuben die Fische, wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU, Endkonzentration 200 ug / ml). </li><li> Übertragungs 30 Fisch (mit möglichst wenig Medien wie möglich), um 2 ml LMA in einem Gewichts Boot. </li><li> Saugen Sie einzelne Fische mit einer Transferpipette und Platte den Fisch mit 1 Tropfen LMA in einen 96-Loch-Bildplatte, nur mit den 10 x 6 zentralen Brunnen. </li><li> Wiederholen, bis alle Fische zu Bildschirm werden der Bildplatte geladen. </li><li> Lassen Sie das Medium erstarren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Positionieren Sie den Fisch auf ihrer Seite, dafür, dass sie in Kontakt mit dem Glasboden gibt. </li><li> Mit dem 20x-Objektiv auf einem umgekehrten Epifluoreszenz / Konfokalmikroskop und der entsprechenden Filter, notieren Sie die Anzahl der C albicans Hefe-Zellen in jeder Fischschwimmblase. </li><li> Wählen Sie den Fisch mit 15-25 Hefezellen in der Schwimmblase (oder gewünschte Inokulum) euthanize nicht ausgewählte Fisch (800 ug / ml TR in E3) und zurück gewählt Fische einer tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU durch Zugabe von 3 Tropfen E3 auf die Bildplatte ausgewählt Brunnen und Absaugen der Fisch mit einer Plastiktransferpipette. </li><li> Inkubiere bei 33 ° C für die gewünschte Dauer. </li></ol> 6. Visualisierung der Fisch-Post-Screening <ol><li> Zu der gewünschten Zeit, entfernen Sie 25 der 50 ml E3 + PTU Medien aus dem tiefen Petrischale die Fische Bild enthält. </li><li> Betäuben des Fisches wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU verbleibenden, Endkonzentration 200 ug / ml). </li><li> Platte der Fische in eine 96-Loch-Speicherfolie und Position entsprechend (Schritte von 5,3 bis 5,7). </li><li> Bild durch Scannen der konfokalen Mikroskopie mit den entsprechenden Laser und Emissionsfilter. Zuerst auf den Fisch im 4x Ziel unter differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und Bilder der interessierenden Region unter Verwendung der 20X-Objektiv mit der konfokalen Laser im Scanning-Modus mit 2 &amp; mgr; s / Pixel Geschwindigkeit und 1024 x 600 Pixel-Seitenverhältnis zu erwerben. Erwerben Sie Z-Stapel mit 1 &amp; mgr; m-Schrittweite, die Anwendung Kalman-Filter-Modus von 3 Bildern. </li><li> Die Rückkehr zu einem tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU oder in individual Vertiefungen (24-well-Kulturschale, 3 ml E3 + PTU) und Inkubation bei 33 ° C. </li></ol> 7. Grundlagen zur Schwimmblase <ol><li> Füllen Sie einen 10-ml-Spritze mit Hochvakuumfett. </li><li> Vorbereiten einer 2% LMA (Schritt 5.3 mit 160 mg des niedrig schmelzender Agarose in 8 ml E3). </li><li> Zu der gewünschten Zeit, betäuben die Fische (Schritt 5.2). </li><li> Übertragungs 10 Fische einer 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml E3 und euthanize durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l 4 mg / ml Tricaine (Endkonzentration 800 ug / ml) in das Zentrifugenröhrchen und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie eine Imaging-Objektträger, indem Sie 4 Tropfen Vakuumfett in einem Quadrat, 1 cm voneinander entfernt auf einem Mikroobjekt (75 x 25 mm, Abbildung 2). </li><li> Platzieren Sie 2 Tropfen 2% LMA in der Mitte des Platzes. </li><li> Setzen Sie einen Fisch auf einem separaten Glasobjektträger unter einem Binokular und überprüfen, ob das Herz hat aufgehört zu schlagen, entfernen Sie das überschüssige Wasser. </li><li&gt; Mit einer feinen Pinzette sezieren die Schwimmblase durch die Aufrechterhaltung der Kopf in einer festen Position mit dem linken Pinzette und Herunterziehen des vorderen Darm mit den richtigen Pinzette (4A). </li><li> Nehmen Sie den Schwimmblase durch den pneumatischen Kanal mit den linken Pinzette und trennt sie vom Verdauungstrakt, und legen Sie sie in der Mitte der 2% LMA, bevor es erstarrt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas (18 x 18 mm) an der Oberseite des bildgebenden Glasplatte und schieben Sie es, bis es die Vakuumfett sowie die LMA (Abbildung 2) berührt. </li><li> Bild innerhalb von 10 Minuten der Dissektion, wie in Schritt 6.4 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 7,7-7,11 mit den anderen Fischen. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Fortschritte und Grenzen der Schwimmblase Mikroinjektion Krankheitsmodell Das hier vorgestellte Modell ist eine Erweiterung des in Gratacap et al Schleimhaut Candidiasis Tauch Modell (2013). es fügt die Vorteile eines kontrollierten Infektion Zeit eine hoch reproduzierbare Infektionsdosis und damit eine verbesserte Effizienz. Wir zeigen hier neue Methoden, die nicht-invasive zeitliche Dokumentation der Infektionsdynamik im Detail als auch eine höhere Auflösung Ex-vivo-Bild...

Schleimhautinfektionen können aufgrund der Schädigung der Epithelbarriere, die Krankheitserregern den Zugang zur systemischen Umgebung ermöglicht, zu lebensbedrohlichen Blutbahninfektionen führen1,2. Darüber hinaus können Schleimhautinfektionen auch dann eine signifikante Immunpathologie verursachen, wenn sie extern eingedämmt werden3-5. Der kommensale einzellige Pilz Candida albicans kommt bei der Mehrzahl der Bevölkerung in der Mundhöhle und an anderen Schleimhautstellenvor 6-9. Obwohl sie normalerweise durch angeborene und adaptive Immunantworten eingedämmt werden, können angeborene Immundefekte und medizinische Eingriffe zu einer schweren mukosalen Candidiasis führen. Der Angriff auf die Epithelbarriere führt zu einem erhöhten Risiko für lebensbedrohliche disseminierte Erkrankungen sowie immunpathologische Erkrankungen, wie im Fall der vulvovaginalen Candidiasis, zusätzlich wurde die Besiedlung von C. albicans mit der Immunhomöostase der Lunge in Verbindung gebracht10,11. Die disseminierte Candidiasis ist heute die vierthäufigste Blutbahninfektion auf Intensivstationen12 und eine Sterblichkeit von bis zu 40 % macht sie zu einem großen Problem. Aufgrund der Zunahme immunmodulatorischer Behandlungen für Patienten mit Autoimmunerkrankungen, Krebs oder Organtransplantationen ist es unerlässlich, die Wechselwirkung zwischen diesem Erreger und dem Immunkompartiment der Schleimhaut zu verstehen.
Die meisten zellbiologischen Fortschritte in Bezug auf C. albicans-Zell-Interaktionen auf Schleimhautebene stammen aus in vitro13-15 und murinen Modellen16-18. Beide Ansätze haben deutliche Vorteile, aber die Möglichkeit, lebende Zellen in einem intakten Wirt mit hoher Auflösung abzubilden, hat die zeitliche und räumliche Charakterisierung der Infektion eingeschränkt. Für diese Studien besteht der Bedarf an einem in vivo Modell, in dem das Zusammenspiel von Krankheitserreger, angeborenen Immun- und Epithelzellen in einem intakten Wirbeltierwirt sichtbar gemacht werden kann.
Der Zebrafisch hat sich zu einem unschätzbaren Werkzeug für das Verständnis menschlicher Krankheiten entwickelt, hauptsächlich aufgrund seiner Transparenz und Zugänglichkeit für genetische Manipulationen. Die Zell- und Organentwicklung wurde bis ins kleinste Detail abgebildet, was zur Beschreibung neuartiger Verhaltensweisen von Immunzellen führte, wie z.B. das Verhalten von T-Zellen im sich entwickelnden Thymus19 oder der Kampf zwischen intrazellulären Mykobakterien und Fresszellen20-22. Neuere Arbeiten haben intestinale Mikroben-Wirt-Interaktionen im Zebrafisch beschrieben und gezeigt, dass die mikrobielle Besiedlung des Darmtrakts die Darmphysiologie des Wirts und die Resistenz gegen andere Infektionen beeinflusst23,24. Darüber hinaus wurde bei mehreren Erregern eine Infektion über das Darmepithel beschrieben.
Im Gegensatz zum Darmtrakt stellt die Schwimmblase ein isolierteres und komplementäreres Schleimhautmodell dar. Dieses Organ ist eine Verlängerung der sich entwickelnden Darmröhre und bildet sich anterior zur Leber und Bauchspeicheldrüse25,26. Es produziert Tensid, Schleim und antimikrobielle Peptide27,28 und sowohl anatomisch als auch ontogenetisch wird dieses Organ als Homolog der Säugetierlunge angesehen29,30. Da der pneumatische Gang beim Zebrafisch mit dem Darm verbunden bleibt, kann es auf natürliche Weise zu einer Tauchinfektion kommen. Bemerkenswert ist, dass die einzigen bekannten natürlich vorkommenden Infektionen von Fischen mit Candida-Arten C. albicans-Infektionen in der Schwimmblasesind 31. Wir haben kürzlich ein experimentelles Immersionsinfektionsmodell beschrieben, bei dem C. albicans die Schwimmblase infiziert, und festgestellt, dass diese Infektion einige der Kennzeichen der C. albicans-Epithel-Interaktion in vitro rekapituliert 32,33. 
In der hier vorgestellten Methode wird das ursprüngliche Immersionsinfektionsmodell verbessert, indem C. albicans direkt in die Schwimmblase von Zebrafischen 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) injiziert wird. Dies ermöglicht eine präzise zeitliche Kontrolle der Infektion sowie ein hochreproduzierbares Inokulum. Es ermöglicht eine detaillierte intravitale Bildgebung, gepaart mit der Vielseitigkeit des Zebrafischmodells. Als Beispiel dafür, was mit dieser Methode gemacht werden kann, stellen wir die räumlich-zeitliche Dynamik des Wachstums von C. albicans zusammen mit der Rekrutierung von Neutrophilen an den Infektionsort vor. Da es schwierig ist, das Schwimmblasengewebe von Zebrafischen intravital abzubilden, stellen wir auch eine schnelle Schwimmblasendissektionstechnik vor, die das Fluoreszenzsignal und die mikroskopische Auflösung verbessert. Diese Methoden erweitern den Werkzeugkasten für die Pilz-, Immun- und Aquakulturforschung und beschreiben einen neuartigen Infektionsweg, der auf die Modellierung anderer Pilz-, Bakterien- oder Virusinfektionen von Schleimhautoberflächen übertragen werden kann.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Tiefe Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Holzdübel</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr> Low <tr><td>Melt Agarose</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillare</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 Injektionssystem</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Gegendruckeinheit</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter-Kit</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Fußschalter</td><td>Angewandte Wissenschaft Instrumentierung</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische</td><td>Basis Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>Magnetische Basis</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 Basis</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-81 mit FV-1000 Laserscanning konfokales System</td><td></td></tr><tr><td>20X Mikroskop Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0,75</td><td></td></tr><tr><td>Rollentrommel</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Kinder Tonerde (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer ( Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A Immersionsöl</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Angeldraht</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Speicherplatte (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (18 x 18 mm), Nr. 1,5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petrischale (Olympus Kunststoffe)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin (EMD-Chemikalien)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Kulturschale (Olympus Kunststoffe)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Hantelboote (8,9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung mucosal candidiasis in zebrafisch-larven von schwimmblase injection

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Frühe Verteidigung gegen Krankheitserreger Schleimhaut besteht sowohl eine Epithelbarriere und angeborenen Immunzellen. Die immunocompetency von beiden, und ihre Zwischenverbindung, an erster Stelle stehen für den Schutz vor Infektionen. Die Wechselwirkungen von Epithelzellen und Zellen des angeborenen Immunsystems mit einem Pathogen besten in vivo, wo komplexe Verhalten entfaltet über Zeit und Raum untersucht. Allerdings sind bestehende Modelle nicht für den einfachen Raum-Zeit-Bildgebung der Kampf mit Krankheitserregern an der Schleimhautniveau ermöglichen. Die hier entwickelten Modell erstellt eine Schleimhaut-Infektion durch direkte Injektion des Pilzpathogen, Candida albicans, in die Schwimmblase der jugendlichen Zebrafisch. Die daraus resultierende Infektion ermöglicht hochauflösende Bildgebung von epithelialen und angeborenen Immunzellverhaltens in der gesamten Entwicklung der Mucosal Disease. Die Vielseitigkeit dieser Methode ermöglicht die Abfrage des Host, um die detaillierte Abfolge der Ereignisse, die zu Immun pH-Sondeagocyte Rekrutierung und die Rollen von bestimmten Zelltypen und molekulare Signalwege in Schutz zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Verhalten des Erregers als Funktion der Immunangriff gleichzeitig unter Verwendung fluoreszierende Protein exprimierenden C. abzubildenden albicans. Erhöhte räumliche Auflösung der Wirt-Pathogen-Interaktion ist auch möglich, mit dem beschriebenen schnellen Schwimmblase Dissektionstechnik. Die hier beschriebene Schleimhaut-Infektionsmodell ist einfach und sehr gut reproduzierbar, so dass es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Schleimhautinfektionen. Dieses System kann auch allgemein übersetzbar andere Schleimhautpathogene, wie beispielsweise mykobakteriellen, bakterielle oder virale Keime, die normalerweise durch epitheliale Oberflächen infizieren.

Mikroinjektion in der hinteren Schwimmblase Die hier präsentierten experimentellen Methode beschreibt die Injektion von einem konsistenten Dosis C. albicans Hefezellen in der Schwimmblase von 4 dpf Zebrafisch. Frühere Arbeiten mit der Immersions Modell schlägt vor, dass der Schwimmblase Immunantwort auf C. albicans ähnelt Säugerschleimhaut Candidiasis 32. Hier zeigen wir eine modifizierte Infektionsmethode, die einfacher, reproduzierbare und schnelle ist; mehrere hu...

In vivo räumlich-zeitliche Interaktionen von Krankheitserregern und Immunabwehr auf Schleimhautebene sind in bestehenden Wirbeltierwirten nicht leicht abzubilden. Die hier vorgestellte Methode beschreibt eine vielseitige Plattform zur Untersuchung der mukosalen Candidiasis bei lebenden Wirbeltieren unter Verwendung der Schwimmblase des juvenilen Zebrafisches als Infektionsstelle.

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mukosale Candidiasis anhand des juvenilen Zebrafisches zu modellieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Lösung, die lebende Albiane enthält, in eine Mikronadel geladen wird. Im zweiten Schritt wird ein definiertes Volumen der Hefezellen in die Schwimmblase eines juvenilen Zebrafisches injiziert.Anschließend werden die Fische auf ein homogenes Inokulum gesiebt und für die gewünschte Zeit inkubiert. Im letzten Schritt wird mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie die dynamische Interaktion des Erregers mit dem Immunsystem des Zebrafisches verfolgt. Zusätzlich kann die Schwimmblase mikroseziert werden, um konfokale Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten.Die Methode, die wir hier vorstellen, beantwortet zentrale Fragen der Pilzimmunologie sowie der Mikrobiologie, wie z.B. die genaue Abfolge von Ereignissen, die zu einer fehlgeschlagenen Immunantwort auf den Pilzerreger und Candida-Leuchtfeuer an den Schleimhautoberflächen führen. Vor Beginn des Eingriffs erwärmen Sie eine Injektionsschale mit 2%aros in einem 33 Grad Celsius heißen Inkubator. Verwenden Sie nach 30 Minuten eine 25-Milliliter-Pipette, um 100 Milliliter des E drei Medien plus PTU von einer Platte des vierten Tages zu entfernen, nach der Befruchtung Zebrafische, achten Sie darauf, keinen der Fische zu aspirieren, und fügen Sie zwei Milliliter von vier Milligramm pro Milliliter hinzu.Trica Methansulfonat wird an die Medien geliefert, um die Tiere zu betäuben. Nach 15 Minuten verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Fische mit aufgeblasenen Schwimmblasen zu identifizieren, und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 30 Zebrafische auf die vorwarme Injektionsschale zu übertragen. Entfernen Sie das überschüssige Medium, halten Sie dann die Schale schräg und verwenden Sie eine Angelschnur mit einem Durchmesser von 0,012 Zoll, die in eine Boro-Silikat-Kapillare eingeklebt ist, um drei Leinen mit je 10 vertikal ausgerichteten Fischen zu machen, die jeweils als nächstes eine Tube frisch zubereiteter Meeresalbikane in einer Konzentration von 1,5 mal 10 bis zum siebten KBE pro Milliliter gründlich durchwirbeln.Und dann laden Sie drei Mikroliter der Hefelösung auf die EC-geclippte Mikronadel. Stellen Sie die Impulsdauer auf die entsprechende Einstellung ein. Drehen Sie dann die Injektionsschale, um einen Winkel von 20 Grad zwischen der Mikronadel und dem Kopf des Fisches zu erreichen, der auf die Rückseite der Schwimmblase zeigt.Schiebe nun die Mikronadel in die Schwimmblase, achte darauf, dass sich die Bohrung der Nadel im Lumen befindet und drücke die Pfütze. Sobald die Überprüfung, welche Fische injiziert wurden, relativ einfach ist, da der Bolus die Luftblase verdrängt und die Rückseite der Schwimmblase anschließend mit Medien gefüllt wird, kann die Co-Injektion von Phenolrot mit dem Bolus die Visualisierung einer erfolgreichen Injektion weiter erleichtern. Nachdem Sie alle 30 Fische injiziert haben, fluten Sie die Schale mit E drei Medien und leeren Sie den Fisch dann in die Auffangschale.10 Tiere werden in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter E drei Medien überführt und die Fische mit 200 Mikrolitern Trica eingeschläfert. Ordnen Sie dann für jedes Tier vier Tropfen Vakuumfett in einem Quadrat im Abstand von einem Zentimeter auf einem Mikroobjektträger an und geben Sie zwei Tropfen frisch zubereitetes, 2 % niedrigschmelzendes Fett in die Mitte des Quadrats. Legen Sie dann einen Fisch auf einen separaten Objektträger unter ein Präpariermikroskop und überprüfen Sie, ob das Herz des Tieres aufgehört hat zu schlagen, und entfernen Sie das überschüssige Wasser.Verwenden Sie nun eine feine Pinzette, um den Kopf in einer festen Position zu halten, und eine andere, um den vorderen Darm nach unten zu ziehen. Nehmen Sie die Schwimmblase am pneumatischen Gang auf, trennen Sie sie vom Verdauungstrakt und platzieren Sie sie in der Mitte eines der vorbereiteten Mikropräparate, bevor sich das Agro verfestigt. Legen Sie zum Schluss einen Deckschirm über das Gewebe, drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, bis er das Vakuumfett und die Agarose berührt, und stellen Sie die Schwimmblase innerhalb von 10 Minuten nach der Ernte dar.Injektion von vier Nanolitern Meer-Albianen bei eins bis 1,5 mal 10 des siebten. KBE pro Milliliter liefert die konsistentesten Daten, was zu einem Bereich von 10 bis 50 Hefezellen pro Fisch führt. Die Verengung des Inokulums auf 15 bis 25 Hefezellen führt zu einem noch engeren Phänotyp und einer noch engeren Reaktion.Neutrophile spielen eine Schlüsselrolle bei der Resistenz gegen Candidiasis bei Mäusen und Menschen, und die Infektion der Schwimmblase von Zebrafischen mit lebenden Albianen führt zu einer schnellen und anhaltenden Rekrutierung von Neutrophilen. Das passiert nicht, wenn hitzeabtötende Hefezellen injiziert werden. Die Filamente entwickeln sich schnell nach der Injektion der Hefezellen, wobei das filamentöse Wachstum in den ersten 24 Stunden nach der Injektion anhält, danach beginnt diese Zahl abzunehmen. Die Fähigkeit, einzelne Fische nicht-invasiv zu verfolgen, ermöglicht diese Längsschnittstudien und unterstreicht die individuellen Unterschiede im Krankheitsverlauf und in der Reaktion des Wirts.Ein experimentelles Protokoll, das in der Mausbildgebung unpraktisch bleibt, nämlich die Wechselwirkungen von Immun- oder Epithelzellen mit calbicanen ist in dem hier vorgestellten Modell relativ einfach. Die soeben gezeigte Präparierung der Schwimmblase verbessert jedoch die Qualität der Bildgebung erheblich. Dies ist besonders nützlich bei der Visualisierung transgener Fischlinien, bei denen die Fluoreszenz ubiquitär exprimiert wird und es eine fremde Fluoreszenz im umgebenden Gewebe gibt, wie in diesen Bildern einer präparierten Schwimmblase aus der alpha Catine Citrin-Fischlinie beobachtet.Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie z. B. die Morph-Technologie oder die chemische Hemmungsbehandlung, können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, wie z. B. welche Rolle eine bestimmte Immunzelle oder ein bestimmter Signalweg bei der Candidiasis der Schleimhaut spielt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Quelle: Li, J. et al. Entwicklung eines Zebrafisch-Infektionsmodells für Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten Clostridioides difficile in das Darmlumen einer anästhesierten Zebrafischlarve. Es beschreibt die Schritte der Larvenvorbereitung, der bakteriellen Injektion und der fluoreszenzmikroskopischen Bestätigung der bakteriellen Lokalisierung im Darm.

Lokalisierte Abgabe von Bakterien in das Darmlumen einer Zebrafischlarve mittels Mikroinjektion

Quelle: Flores, E., et al. Verwendung des protozoen Paramecium caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen bei Zebrafischlarven. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert die Methode, ein lebensmittelbedingtes bakterielles Darminfektionsmodell bei Zebrafischlarven zu etablieren, indem man ihnen Paramecia füttert, die mit fluoreszierendem E. coli infiziert sind.

Modellierung von Darminfektionen bei Zebrafischlarven unter Verwendung lebensmittelbedingter Bakterien

Quelle: Li, J. et al. Entwicklung eines Larven-Zebrafisch-Infektionsmodells für Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert das Mikrogavage-Verfahren, bei dem eine betäubte Zebrafischlarve in Agarose immobilisiert und oral mit einer Tracer-Nadel mit einem pathogenen Bakterium injiziert wird. Die nicht-invasive Verabreichung ahmt eine natürliche Infektion nach und ermöglicht so die Analyse bakterieller Replikation, Toxinfreisetzung und Darmepithelschäden.

Entwicklung eines Zebrafisch-Larveninfektionsmodells unter Verwendung von Mikrogavage

Systemische und lokalisierte Zebrafisch-Infektionsmodelle für humane Influenza-A-Viren werden demonstriert. Unter Verwendung eines systemischen Infektionsmodells kann der Zebrafisch zum Screening von antiviralen Medikamenten verwendet werden. Unter Verwendung eines lokalisierten Infektionsmodells kann der Zebrafisch zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts verwendet werden.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

In diesem Protokoll Eindringmittel beschrifteten T. Trypanosoma wurden in durchsichtigen Zebrafischlarven injiziert und Parasiten Motilität wurde in Vivo mit Lichtblattmikroskopie Fluoreszenz beobachtet.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Modell menschlichen Tuberkulose in einem Erwachsenen Zebrafisch mit seiner natürlichen Erreger Mycobacterium Marinum. Extrahierte DNA und RNA aus den inneren Organen der infizierten Zebrafisch lässt sich zeigen, dass die Summe mykobakteriellen in die Fische und Immunantwort des Wirtes mit qPCR lädt.

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

Zebrafish Embryos Modell für bei Vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierte Staphylococcus Aureus Infektion

Hier beschreiben wir die Synthese von medikamentenbelasteten Liposomen und deren Mikroinjektion in Larvenzebrafische zum Zweck der gezielten Medikamentenabgabe an Makrophagen-Linienzellen.

Targeting Drogen zu Larval Zebrafish Makrophagen durch Injektion von Drogen-geladenen Liposomen

Präsentiert hier ist eine sichere und effektive Methode, um Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten anaeroben C. difficile durch Mikroinjektion und nichtinvasive Mikrogavage zu infizieren.

Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Dieses Protokoll demonstriert die Mikroinjektion von Lipopolysaccharid in die ventrikuläre Hirnregion in einem Zebrafisch-Larvenmodell, um die resultierende neuroinflammatorische Reaktion und Neurotoxizität zu untersuchen.

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Erfahren Sie die Modellierung von Mukosaler Candidiasis durch Injektion von Candida albicans in die Schwimmblase von Zebrafisch-Larven. Konfokale Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Beobachtung von Pathogen-Immun-Interaktionen.

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