Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Thymus- und Knochenmarkproduktion zu schätzen, indem sowohl T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreise als auch REX und K Deleting Rekombination Exzisionskreise oder -korrekturen in einem einzigen Assay quantifiziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Triple-Insert-Plasmid konstruiert wird, das Fragmente der DNA-Sequenz von TRX corrects und eines Einzelkopie-Referenzgens enthält, um ein Verhältnis von eins zu eins zu eins zwischen den drei Zielen nach der DNA-Amplifikation aufrechtzuerhalten. Als nächstes wird eine Standardkurve erstellt, indem serielle Verdünnungen des Triple-Insert-Plasmids durchgeführt werden, die die absolute Quantifizierung der drei Zielsequenzen durch reale realtime PCR ermöglicht.

Abschließend wird ein realtime PCR-Assay durchgeführt, der zur absoluten Quantifizierung von Tres und Rissen führt. Die berichteten Ergebnisse zeigen die Veränderungen der Thymus- und Knochenmarkproduktion mit Alter und Geschlecht bei gesunden Kindern und Erwachsenen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir sowohl die Knochenmark- als auch die Thymusausscheidung bei Neugeborenen oder Säuglingen analysieren mussten, da die normalerweise entnommene Blutmenge im Vergleich zu Erwachsenen knapp ist.

Daher haben wir uns entschieden, die beiden Methoden der Tracks und Korrektur der Quantifizierung in einem einzigen Assay zu kombinieren, um die Probenvorbereitung und die Reagenzienkosten zu optimieren. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose von primären und erworbenen Immundefekten, aber die Methode kann auch bei allen Krankheiten eingesetzt werden, die mit dem Verlust von TMB-Zellen einhergehen, sowie zur Untersuchung einer neuen Rekonstitution nach einer Knochenmarktransplantation. Es kann auch in der Grundlagenforschung angewendet werden, vor allem in der Grundlagenforschung, die sich mit der Lymphozytenhomöostase befasst.

Der Hauptvorteil besteht darin, dass durch die Verwendung eines dreifachen Überschusses nur eine einzige Standardkur benötigt wird, wodurch die experimentelle Variabilität reduziert wird. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund des langwierigen Verfahrens, das für die Präparation des Triple-Insert-Plasmids erforderlich ist, oder aufgrund der Probleme im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Standardkurve Schwierigkeiten haben. Zu Beginn wird eine Probe entnommen, die Zellen enthält, die sehr wahrscheinlich TRX und Risse aufweisen, die durch PCR nachweisbar sind, wie z. B. peripheres Blut eines jungen gesunden Probanden, das unter Verwendung einer Standard-Dichtegradienten-Trennmethode in EDTA-Röhrchen gesammelt wurde.

Trennen Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes nach der Extraktion der DNA aus den Zellen gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie Primer, spezifisches Fort TRX REX- und TCR-alpha-konstantes Gen, um das Rex-Signal, das gemeinsame Rex-Signalgelenk und die TCR-alpha-konstante Genfragmente zu amplifizieren. Fügen Sie das PCR-Produkt des Trax-Signalgelenks in die TA-Akzeptorstelle des PCR 2.1-Topovektors ein und verwenden Sie die Plasmid-DNA, um chemisch kompetente XL one blaue, chemisch kompetente Zellen durch Hitzeschock zu transformieren, isolieren Sie ampicillinresistente weiße Kolonien, die ihre Beta-Laktase-Komplementation verloren haben, auf eine neue Masterschale und verwenden Sie PCR, um die Kolonien zu identifizieren, die das Trek-Fragment enthalten. Nachdem Sie eine der trek-positiven Kolonien gezüchtet und die DNA isoliert haben, verwenden Sie SP eins, um das Plasmid und das TCR-alpha-konstante Genamplifikationsprodukt zu verdauen und das TCR-alpha-konstante Genfragment in das Plasmid zu ligieren.

Wiederholen Sie die Transformation, die Kolonieauswahl und -expansion sowie die DNA-Isolierung, um das richtige Fragment einzufügen, verwenden Sie hintere drei anstelle von SP eins, um das Plasmid und das richtige PCR-Fragment zu verdauen, und wiederholen Sie den Prozess, um die DNA zu ligieren und zu isolieren. Sobald die Sequenzen der drei Inserts verifiziert wurden, expandieren Sie die Kolonie und reinigen Sie die Plasmid-DNA durch MIDI-Vorbereitung gemäß dem Textprotokoll, um eine Standardkurve zu erstellen. Nachdem Sie die Masse und Konzentration des Plasmids wie hier gezeigt berechnet haben, tauen Sie ein Aliquot des Plasmids auf und Sie zeigen eins, um zwei Mikrogramm mit dem linearisierten Aliquot der DNA zu linearisieren.

Verwenden Sie die Formel: C eins V eins ist gleich C zwei V zwei. Um das Verdünnungsvolumen zu berechnen, das zur Herstellung des ersten Standardkurvenpunkts der Reihe erforderlich ist, wie hier gezeigt, bereiten Sie eine Reihe von eins bis 10 Verdünnungen vor, um die verbleibenden Standardkurvenpunkte zu erhalten. Lagern Sie die Plasmidverdünnung bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius Um Proben für die Echtzeit-PCR vorzubereiten, ordnen Sie eine PCR-Platte an, die mindestens zwei Replikate für jede zu analysierende Probe enthält, und zwar auf folgende Weise mit zwei separaten Röhrchen, eines für Rex und Risse und eines für die TCR-Alpha-Konstante.

Bereiten Sie die Mastermixe für die Gesamtzahl der benötigten Wells vor. Geben Sie 20 Mikroliter in die Vertiefungen der Platte. Fügen Sie als Nächstes fünf Mikroliter genomische DNA hinzu, die aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder P-BMCs extrahiert wurde.

Geben Sie fünf Mikroliter Wasser in die Kontrollvertiefungen ohne Schablone, bevor Sie eine optische Klebeabdeckung verwenden, um die Reaktionsplatte zu versiegeln. Tauen Sie dann die Verdünnung der Plasmid-DNA-Standardkurve auf und bereiten Sie die höchste Verdünnung vor. Decken Sie nur die Vertiefungen auf, die sich zwischen den Zeilen A bis H und den Spalten eins bis vier befinden.

Und nach kurzem Vortexen fügen Sie fünf Mikroliter von jedem Verdünnungspunkt zu seinem vorgesehenen Punkt hinzu. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen am Boden der Vertiefungen befinden und dass sich die Reagenzien am Boden absetzen. Verwenden Sie ein Echtzeit-PCR-System, um den Assay mit dem folgenden Protokoll durchzuführen.

50 Grad Celsius für zwei Minuten und anfängliches Erhitzen auf 95 Grad Celsius für 10 Minuten, gefolgt von 45 Denaturierungszyklen bei 95 Grad Celsius für 15 Sekunden. Und eine kombinierte Zündhütchensonde kniet und dehnt eine Minute lang bei 60 Grad Celsius. Um die Echtzeit-PCR-Daten zu analysieren, öffnen Sie die gespeicherte Ergebnisdatei in der Software und klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse oben im Fenster.

Klicken Sie auf das Analysemenü und wählen Sie Analyseeinstellungen. Lassen Sie die Software den Schwellenwert automatisch bestimmen, indem Sie alle Detektoren und den automatischen CT für den Schwellenwertzyklus auswählen. Lassen Sie die Software standardmäßig die automatische Baseline für die Hintergrundbeseitigung festlegen.

Klicken Sie auf die Registerkarte Amplifikationsdiagramm und wählen Sie ganz rechts im Fenster einen der drei Detektoren im entsprechenden Dropdown-Menü aus. Wählen Sie direkt unter Wählen Sie manuelle CT aus, um manuell einen Schwellenwert festzulegen Im unteren Teil des Fensters wählen Sie die Wells aus, die den Standardkurvenverdünnungspunkten des ausgewählten Detektors entsprechen, um die Amplifikationsdiagramme anzuzeigen, indem Sie mit der Maus auf die entsprechenden Zellen der Tabelle klicken und ziehen. Um den Schwellenwert manuell anzupassen, ziehen Sie die rote Schwellenwertlinie nach oben und unten, und klicken Sie dann auf Analysieren, um die Ergebnisse erneut zu analysieren.

Um zu überprüfen, wie sich das Festlegen des Schwellenwerts auf die Ergebnisse auswirkt, wählen Sie die Registerkarte "Bericht" und sehen Sie sich die resultierende CT der jeweiligen Standardkurvenverdünnungspunkte an. Wenn Sie den Schwellenwert verschieben, um eine optimale Platzierung auf der Registerkarte "Verstärkungsdiagramm" zu erhalten, stellen Sie sicher, dass sich der Schwellenwert in einem Bereich exponentieller Verstärkung befindet, der ausreichend über dem Hintergrundrauschen, aber unterhalb der Plateauphase liegt. Wenn das Amplifikationsdiagramm nicht in logarithmischer Skala angezeigt wird, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, um die Diagrammeinstellungen aufzurufen und die Einstellung nach dem Lauf als log festzulegen.

Stellen Sie den Schwellenwert in der Mitte des linearen Teils des Diagramms ein, und beobachten Sie die Verstärkungskurven ungefähr parallel zueinander. Klicken Sie auf die Registerkarte Bericht, um die CT-Ergebnisse anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass die Platzierung des Schwellenwerts Ergebnisse liefert, die die Genauigkeit der beiden Replikationen der einzelnen Standardkurven maximieren.

Verdünnungspunkte. Vergewissern Sie sich, dass der Schwellenwert an dem Punkt platziert ist, der die extremen Größenordnungen der Verdünnungspunkte der Standardkurve auf der Registerkarte "Bericht" am besten widerspiegelt. Ziehen Sie die Maus erneut in die Tabelle im unteren Teil des Fensters, um die Zellen auszuwählen, die den Vertiefungen der Standardkurve entsprechen. Stellen Sie bei allen Detektoren sicher, dass die resultierende CT der drei Ziele an denselben Verdünnungspunkten sehr ähnlich ist.

Passen Sie z. B. bei Differenz nicht mehr als 0,5 CT die Schwellenwerte bei Bedarf an und überprüfen Sie sie erneut auf der Registerkarte "Bericht" im unteren Teil des Fensters. Wählen Sie NTC-Wells aus und prüfen Sie, ob in den NTC-Wells keine Amplifikation vorhanden ist, was einer CT von unbestimmt entspricht. Wählen Sie die Registerkarte Standardkurve und rechts neben dem Diagrammfenster die Detektoren aus dem Dropdown-Menü aus und prüfen Sie, ob die gemeldete Standardkurvensteigung zwischen minus 3,55 und minus 3,32 liegt, was einer PCR-Effizienz von 91 bis 100 % entspricht. Stellen Sie sicher, dass der Bestimmungskoeffizient oder das R-Quadrat höher als 0,998 ist, indem Sie seinen Wert direkt unter der Steigung und dem Schnittpunkt überprüfen.

Klicken Sie auf die Registerkarte Bericht und überprüfen Sie in den entsprechenden Zellen der Tabelle unter dem Diagramm, ob die CT der Positivkontrolle mit den Ergebnissen der vorherigen Assays an derselben bekannten Positivkontrolle übereinstimmt. Klicken Sie auf das Menü Datei, Speichern und dann in eine CSV-Datei exportieren, um die Mengen aller Wells in eine Textdatei mit kommagetrennten Werten zu exportieren. Importieren Sie abschließend die CSV-Datei in eine Tabellenkalkulationssoftware und berechnen Sie die Anzahl der Spuren oder Korrekturen pro 10 für die sechs PBMs, indem Sie die folgende Formel entsprechend einstellen.

Der in diesem Video beschriebene Assay wurde an einer repräsentativen Stichprobe von 87 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt: 42 Kinder im Alter von null bis 17 Jahren und 45 Erwachsene im Alter von 24 bis 60 Jahren. Wie hier gezeigt, nahm die Anzahl der Treks mit zunehmendem Alter aufgrund der Thymusinvolution bei Erwachsenen von null auf drei bis vier Jahre ab.

Die Anzahl der Wanderungen hängt auch vom Geschlecht ab, da sie bei Männern schneller abnimmt als bei Frauen, was sich auf die Fähigkeit auswirken kann, geeignete Referenzbereiche festzulegen. Diese Diagramme zeigen, dass die Anzahl der Risse jedoch mit zunehmendem Alter abnahm, ähnlich dem Muster, das bei T-TREXs nur bei Kindern beobachtet wurde. Bei Erwachsenen hingegen ist die Knochenmarkproduktion während des gesamten Lebens ziemlich stabil und hängt nicht vom Geschlecht ab.

Die Triple-in-Insert-Plasmidvorbereitung dauert etwa zwei bis drei Wochen, danach halten die gelagerten Plasmidzuteilungen drei Jahre. Der restliche Teil der Technik kann bei richtiger Ausführung in nur vier bis fünf Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, alle plasmidbezogenen Manipulationen in einem speziellen Bereich durchzuführen, um eine DNA-Kreuzkontamination zu vermeiden.

Es ist auch wichtig, die Stabilität des Standardrohrs bei der Analyse der Ergebnisse nach seiner Entwicklung zu überprüfen. Diese Technik bot Forschern auf dem Gebiet der klinischen Immunologie oder Hämatologie ein verbessertes Werkzeug zur Identifizierung primärer Immundefekte, um das Ergebnis der Immunrekonstitution nach einer Knochenmarktransplantation zu überwachen oder einfach die Lymphozytenhomöostase zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Tripel im Plasmid erhalten, die Standardkurve vorbereiten, das Echtzeit-PCR-Experiment durchführen und die notwendigen Berechnungen durchführen, die erforderlich sind, um eine reproduzierbare absolute Quantifizierung von Trax und Rissen zu erhalten.