Name: Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Lernen Sie eine postaurikuläre chirurgische Methode für den Gentransfer ins Mausinnenhör durch die runde Fenstermembran. Diese Technik ermöglicht minimal-invasive virale Lieferung mit geringem Blutverlust und niedriger Mortalität.

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Diese Arbeit wird durch einen R21-Zuschuss von den National Institutes of Health und durch einen Zuschuss von Hearing Research, Incorporated unterstützt.

HINWEIS: Alle Verfahren und Behandlung der Tiere mit NIH Ethikrichtlinien und genehmigte Protokoll Anforderungen der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco eingehalten werden. 1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie <ol><li> Führen Sie chirurgische Eingriffe an einem sauberen, gewidmet Raum. Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten, sterilisieren mit einer Glasperlen Sterilisator vor der Operation. HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden postnatalen Tag 10 bis 12 (P10-12) FVB Mäusen. Unterschiedlichen Alters und Mäusestämme können verwendet werden, um die Bedürfnisse einer bestimmten Projekt zu erfüllen. Mäuse älter als P40 kann eine Herausforderung sein, weil die Bulla Knochen wird härter. </li><li> Anesthetize die Mäuse intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg), Xylazinhydrochlorid (10 mg / kg) und Acepromazin (2 mg / kg). Beginnen chirurgische Vorbereitung erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. Wo notwendigy, zu verwalten eine Auffrischimpfung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) des Anästhetikums Cocktail, um das ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. HINWEIS: Achten Sie darauf, bei diesem Schritt, weil die meisten der in diesem Alter beobachtet Sterblichkeit durch Narkoseüberdosierung verursacht. </li><li> Bedeckung Augen des Tieres mit einer Schutzaugensalbe, die Augen während der Anästhesie feucht zu halten, unterdrückt Lidschlusseflexes des Tieres. </li><li> Bewegen Sie die Maus mit Hals auf einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens verlängert, bis die Maus ganz wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die links nach Ohrregion mit einer Schneidemaschine und Desinfektion mit 70% Ethanol und PVP-Jod vor der chirurgischen Manipulation. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren und Vector Injection <ol><li> Verwenden Sie einen Post-Ohrenansatz, um die Bulla tympanica aussetzen. Inzision das subkutane Gewebe mit einer kleinen Schere, um die Post-Ohrmuskel aussetzen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes zu the posterioren Seite des Einschnitts, trennen die Muskeln, um die rechte und linke Seite senkrecht zum Einschnitt, um die zeitliche Knochen freizulegen. Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt ist lang genug, um bequem mit ausreichender Visualisierung zu arbeiten. </li><li> Perforieren die Bulla tympanica mit einer 25 G-Nadel und erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit einer Zange durch Abziehen der Knochen zurück, um Zugang zum basalen Windung der Cochlea zu ermöglichen, und dann erweitern ausreichend, um das Steigbügel Arterie und die Rundfenstermembran zu visualisieren (RWM) . </li><li> Punktion der RWM sanft in der Mitte mit einem Borosilikat Kapillarpipette. Beachten Flüssigkeit Ausfluss durch die RWM an dieser Stelle; das ist normal. Warten Sie, bis die Auslauf stabilisiert hat (die effluxed Flüssigkeit aus der Cochlea ist mit einem sterilen Filterpapier getrocknet). HINWEIS: Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Glasnadel, so dass der RWM Perforation ist so klein wie möglich. Abhängig von dem Mikroskop verwendet wird, halten die Pipetten mit Hilfe eines Mikromanipulators oder von Hand mit einer PipetteHalter. </li><li> Bereiten Sie die Pipetten für die Injektion mit einer Pipette Abzieher die gleiche Weise Patch-Clamp-Pipetten werden vorbereitet. Sicherzustellen, dass der Kopfkreisdurchmesser groß ist (etwa 15 &amp; mgr; m im Durchmesser), so dass Pipettieren des Virus in die und aus leicht gemacht. </li><li> Erstellen Sie 1-2 ul AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oder AAV2-GFP in eine Injektionspipette. Nachdem der Ausfluß stabilisiert (5 bis 10 min), microinject diese feste Volumen in die Scala tympani durch das gleiche Loch zuvor in RWM hergestellt. </li><li> Verschließen Sie den RW Nische schnell nach dem Herausziehen der Pipette mit einem kleinen Stecker des Muskel- und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber auf den Muskel platziert, um ein Auslaufen aus dem runden Fenster zu vermeiden. HINWEIS: Verschließen Sie das Loch sehr gut, nachdem die Nadel mit einem kleinen Stecker des Muskel entfernt, um jede Leckage aus Perilymphe der Cochlea-diesem Schritt verhindern, ist entscheidend für die Anhörung zu bewahren. Nicht versiegeln komplett die RWM in Hörverlust im Laufe der Zeit führen. </li><li> Nach der Injektion decken dieLoch im Gehör Bulla mit Fettgewebe, geben die Post-Ohrmuskulatur und Fettgewebe in ihre normale Position und Naht der Wunde in Schichten mit einer 6-0 oder kleiner Chrom resorbierbaren Nahtmaterial. </li><li> Desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod. </li></ol> 3. Postoperative Behandlung <ol><li> Zeigen Mäuse in einem warmen Käfig und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig erholt, dann verschieben Sie sie zurück mit der Mutter. Es wird empfohlen, die männliche aus dem Käfig, bevor die Welpen wieder mit der Mutter entfernen. </li><li> Verwalten subkutane Carprofen (2 mg / kg) zur Analgesie postoperativ und jeder 24 Stunden danach für 3 Tage, um Entzündung und Schmerz zu verwalten. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Not, abnorme Gewichtsverlust, Schmerzen oder Infektionen. Allgemein mit der 3. Tag nach der Operation alle Mäuse normalerweise handeln. Falls irgendwelche Anzeichen von Leiden oder Krankheiten werden in einer Maus nach dem 3. Tag, sollten euthanizing ter Maus nach den Richtlinien des Instituts. </li></ol> 4. Bewertung der Cochlear Funktion Folgende Viral Lieferung Mit Hirnstammaudiometrie (ABR) Aufnahmen HINWEIS: Die akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) ist ein akustisch evozierte Potenzial aus der laufenden elektrischen Aktivität im Gehirn extrahiert und über Elektroden unter der Kopfhaut platziert aufgezeichnet. Das Tier wird mit Ton stimuliert. Die resultierende Aufzeichnung besteht aus fünf Wellen, die die elektrische Aktivität des aufeinanderfolgenden Punkten in der Hörbahn in den ersten 10 ms nach Beginn eines auditorischen Reizes zu reflektieren. <ol><li> Anesthetize Mäusen durch intraperitoneale Injektion eines Gemisches von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der gesamten Hörtest bis die Maus ist völlig wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. HINWEIS:die folgenden Klangreize in diesem Experiment: klicken (5 ms Dauer; 31 Hz Präsentation Rate). </li><li> Zeigen subdermale Nadelelektroden an der Spitze, unter der Ohrmuschel des linken Ohrs (Referenz), und unter dem Gegenohr (Masse) und starten Sie die Aufnahme ABRs wie zuvor in einer schalldichten Kammer 27,28 beschrieben. Nehmen ABR-Wellenformen in 5 Intervallen unten von maximalen Amplitude dB Schalldruckpegel. </li><li> Bestimmen ABR Schwellen postoperativ bereits 4 Tage nach der viralen Lieferung HINWEIS: Threshold wird als die niedrigste Reizniveau, bei dem die Antwortpeaks für Wellen definiert I-V waren eindeutig und wiederholt auf Sichtkontrolle vor. </li><li> Messen Welle I, um die Aktivität des Cochlea-Nervs analysieren. Die niedrigste Anregungspegel, der ein nachweisbares ABR-Wellenform liefert als Schwellwert definiert. </li></ol> 5. Cochlear Transgene Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz <ol><li> Anesthetize Mäuse durch eine Überdosis intraperitoneal Injektion einer Mischung von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Enthaupten den Kopf erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. </li><li> Präparieren Sie die cochleae heraus und Verfahren für ganze-mount Immunfluoreszenz wie beschrieben 26. Ein detailliertes Protokoll Cochlea ganze Montage Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-VGLUT3 und Anti-Myosin Antikörper 7a in Akil et al., 2013 29 beschrieben. </li><li> Für GFP-Markierungen, brüten die Cochlea Ganz Halterungen über Nacht bei 4 ° C mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper bei 1: 250-Verdünnung. </li><li> Zweimal Spülen der Cochlea für 10 min mit PBS gewaschen und dann für 2 Stunden inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert Cy2, verdünnt 1: 4.000 in PBS. </li><li> Zweimal spülen cochleae mit PBS für 10 Minuten inkubieren sie mit DAPI für 15 min. </li><li> Montieren Sie den cochleae auf Glasobjektträgern und beobachten under ein Mikroskop mit konfokaler Immunfluoreszenz. </li></ol>

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<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Technik, die für Cochlea-Gentherapie eingesetzt werden können, mit dem Ziel der Wiederherstellung oder der Rettung normaler Gehörfunktion, die durch einen genetischen Defekt beeinträchtigt ist. Da es in der Regel atraumatisch ist, ist dieser Ansatz sicher für Cochlea-Gentransfer oder andere potenzielle molekulare Therapien 30. Andere Ansätze für Cochlea-Therapie beschrieben worden, einschließlich eines Bauchansatz 24, Cochleostomie 31,32 un...

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu 1 blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt 2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen 3 und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle 4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität 5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust 8. Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust 9 entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth 10, 11,12,13,14, 15. Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten 16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors 17,18, 19, 20,21 erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell 22, 23,24. So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen. Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse 25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen. Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze 9. Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör 26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazin</td><td>Bereitgestellt von UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen Analgesie</td><td>Bereitgestellt von UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Betadine Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason Augensalbe (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G Nadel</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillarpipette</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Nahtmaterial PDS*plus Antibakterielles</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekleber (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFP-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flammende/ Braune Mikropipette&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abzieher Modell P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT BioSig III System&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische verfahren zum viral vermittelte gentransfer in die maus-innenohr über die runde fenstermembran

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Die Gentherapie, verwendet werden, um die funktionelle Erholung von Innenohrschwerhörigkeit zu erreichen, verspricht besseres Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und genetischen Mechanismen, die zu Gehörverlust zur Folge gewähren. Einführung von Vektoren in das Innenohr sind in einer Weise, die weit verteilt das Agens durch die Cochlea und minimiert eine Schädigung der bestehenden Strukturen erfolgen. Diese Handschrift beschreibt eine postOhr chirurgischen Ansatz, der für Maus Cochlea-Therapie mit molekular, pharmakologischen und virale Lieferung an Mäusen postnatalen Tag 10 Jahren über die Rundfenstermembran (RWM) verwendet werden kann. Diese chirurgischen Ansatz ermöglicht die schnelle und direkte Lieferung in die Scala tympani und minimiert den Blutverlust und die Vermeidung von Tiersterblichkeit. Diese Technik beinhaltet vernachlässigbare oder keine Schäden an wesentlichen Strukturen des inneren und des Mittelohres und Nackenmuskulatur, während hundert Erhaltung Anhörung. Um die Wirksamkeit dieser chirurgischen Technik wird der vesikulären glutam demonstrierenaß transporter 3 Knockout (VGLUT3 KO) Mäusen wird als ein Beispiel von einem Mausmodell für angeborene Taubheit, die Erholungsfähigkeit nach Abgabe VGLUT3 zum inneren Ohres unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV-1) verwendet werden.

Um die technischen Merkmale und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie zu verifizieren, wurden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP und AAV2-GFP in P10-12 Mäuse Innenohr über die RWM geliefert. Dieser Ansatz zeigt erfolgreiche Expression des Transgens im inneren Haarzellen (IHC) (VGLUT3 Abbildung 1 und Abbildung 2 GFP und GFP 3A), äußeren Haarzellen (OHC) (GFP Abbildung 2) und Stützzellen (GFP Abbildung 2 und Ab...

Der beschriebene postaurikuläre chirurgische Ansatz ermöglicht eine schnelle und direkte Verabreichung in die Cochlea-Scala tympani der Maus bei gleichzeitiger Minimierung des Blutverlusts und der Tiersterblichkeit. Diese Methode kann für die Cochlea-Therapie mit molekularer, pharmakologischer und viraler Verabreichung an postnatale Mäuse durch die runde Fenstermembran verwendet werden.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen postaurikulären chirurgischen Ansatz zu beschreiben, der eine schnelle und direkte Abgabe des Virus in die Cochlea-S-Skala timi der Maus durch die runde Fenstermembran ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zuerst die Trommelfellbulla freigelegt wird. Im zweiten Schritt wird das Gewebe perforiert und die Arteria edia und die runde Fenstermembran sichtbar gemacht.Anschließend wird die runde Fenstermembran durchstochen und das Virus in den Spon injiziert. Im letzten Schritt wird das Loch verschlossen. Letztendlich können die Expression des transgenen Proteins und die Wiederherstellung des Gehörs des Tieres durch Immunfluoreszenzmikroskopie bzw. Messung der auditorischen Hirnstammreaktion beurteilt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden wie Coch, Stoma und ventralem Zugang besteht darin, dass die postulare Injektion mit Rundfenstermembran relativ schnell minimalinvasiv ist, Injektionen mit höherem Volumen ermöglicht und eine weit verbreitete Transfektion einer Vielzahl von Zellen in der Cochlear ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Verfahren stark von einem gründlichen Verständnis der Anatomie der Cochlea abhängt. Nach Bestätigung der Anästhesie durch die Zehe die linke postaurikuläre Region zusammenkneifen und die Haut von 10 bis 12 Mäusen nach der Geburt mit 70% Ethanol und Povidon-Jod desinfizieren.Bedecken Sie dann die Augen mit einer schützenden Augensalbe und positionieren Sie das Tier mit ausgestrecktem Hals auf einem Heizkissen. Wenn die chirurgische Vorbereitung abgeschlossen ist, schneiden Sie das Unterhautgewebe mit einer kleinen Schere ein, um den postaurikulären Muskel freizulegen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes auf die hintere Seite des Schnitts trennen Sie die Muskeln nach rechts und links senkrecht zum Schnitt.Um das Schläfenbein freizulegen, perforieren Sie die Trommelfellbulla mit einer 25-Gauge-Nadel und schälen Sie den Knochen bei Bedarf mit einer Pinzette zurück, um das Loch zu erweitern und den Zugang zur basalen Drehung der Cochlea zu ermöglichen. Erweitern Sie dann das Loch so weit, dass die Arterie und die runde Fenstermembran sichtbar sind. Punktieren Sie die runde Fenstermembran vorsichtig in der Mitte mit einer Kapillarpipette aus Burro-Silikat.Trocknen Sie die runde Fensterbahn mit einem sterilen Filterpapier ab. Warten Sie dann fünf bis 10 Minuten, bis sich das flüssige Flussmittel bei diesem Schritt stabilisiert hat. Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Pipette darauf, die Perforation der Rundfenstermembran so klein wie möglich zu halten.Je nach Verwendung des Mikroskops kann die Pipette mit der Hand oder mit einem Mikrom-Manipulator gehalten werden. Wie Sie hier sehen können, halten wir die Pipette mit der Hand, da das Mikroskop zu nah an der Maus ist, um einen Mikromanipulator zu ermöglichen. Ziehen Sie nun ein bis zwei Mikroliter des Virus in eine gezogene Glaspipette mit einer Spitze von 15 Mikrometern Durchmesser und injizieren Sie das Virus durch das gleiche Loch, das zuvor in der runden Fenstermembran gemacht wurde, in die Schuppe von Timani.Ziehen Sie dann die Pipette heraus und verschließen Sie die runde Fensternische schnell mit einem kleinen Muskelpfropfen und befestigen Sie sie mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber. Decken Sie das Loch in der Hörblase mit Fettgewebe ab und bringen Sie die postaurikulären Muskeln und das Fettgewebe wieder in ihre normale Position. Als nächstes verschließen Sie die Wunde mit einem resorbierbaren chromhaltigen Naht 6,0 oder kleiner und desinfizieren den Schnittbereich mit Povidon-Jod.Setzen Sie die Maus dann in einen warmen Käfig und geben Sie den Pop nach vollständiger Genesung mit täglicher Überwachung an die Mutter zurück. Um die Cochlea-Funktion bereits vier Tage nach der Virusverabreichung zu beurteilen, positionieren Sie ein sediertes transfiziertes Tier auf einem Heizkissen und platzieren Sie dann subdermale Nadelelektroden am Scheitelpunkt unterhalb der Ohrmuschel des linken Ohrs und unterhalb des kontralateralen Ohrs. Beginnen Sie schließlich mit der Aufzeichnung der auditorischen Hirnstammreaktionen oder eines BR in einer schalldichten Kammer, wie zuvor beschrieben, und messen Sie die erste Welle, um die Aktivität des Cochlea-Nervs zu analysieren, wie sie in der Cochlea-Lochhalterung zu sehen ist.Dieser Ansatz zeigt eine erfolgreiche Transgenexpression in inneren Haarzellen, äußeren Haarzellen und Stützzellen, ohne dass eine signifikante Organverletzung durch COR T verursacht wird, so dass verschiedene Zelltypen, die GFP exprimieren, im Cochlea-Loch beobachtet werden können. Mount zeigt, dass die Wahl des Adeno-assoziierten Virus-Serotyps mit den zu transduzierenden Zelltypen kompatibel sein muss. Die Anzahl der transfizierten Zellen variiert je nach Konzentration und Volumen, das das Virus injiziert hat.In diesem Fall führte die Erhöhung von 0,6 auf einen Mikroliter zu einem Anstieg der Anzahl der transfizierten Zellen auf ein Niveau, das mit dem Wildtyp V Glute 3 vergleichbar war. Die Transgenexpression wurde in injizierten KO-Mäusen wiederhergestellt, wie in diesen Bildern zu sehen ist. Die Wirkung der postaurikulären Abgabe des V GL 3-Virus in das Innenohr von V gl 3-Knockout-Mäusen auf die Hörrettung ist zu sehen. die Grafik. Die A BR-Spuren wurden in den drei geretteten Knockout-Mäusen der VLU wiederhergestellt und erreichten Schwellenwerte, die mit denen von Wildtyp-Mäusen vergleichbar waren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sich für jeden Schritt Zeit zu nehmen, um Schäden an den Innen- und Mittelohrstrukturen sowie der Nackenmuskulatur zu vermeiden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen postoperativen Ansatz für die Verabreichung molekularer pharmakologischer viraler experimenteller Behandlungen in die MAs re Skelettpfanne durch die runde Windmembran durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren...

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

Quelle: Kozin, E. D., et.al. Direkte Visualisierung des dorsalen Cochlea-Kerns der Maus zur optogenetischen Stimulation der Hörbahn. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den virusvermittelten Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern (DCN) der Maus, um eine lichtinduzierte auditive Stimulation zu ermöglichen. Ein viraler Vektor, der für Opsin, einen lichtempfindlichen Ionenkanal, kodiert, wird nach einer Kraniotomie und Kleinhirnaspiration in das DCN injiziert, um einen direkten Zugang zu...

Virusvermittelter Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern der Maus zur lichtinduzierten auditiven Stimulation

Dieses Video zeigt die Kanalostomie, ein Verfahren, das die lokale Verabreichung von Medikamenten in das Innenohr einer Maus durch den Bogengang mit minimaler Schädigung des Gehörs und der vestibulären Funktion ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Inokulation von viralen Vektoren, Pharmazeutika und kleinen Molekülen in das Innenohr der Maus.

Kanalostomie zur lokalen Verabreichung von Medikamenten in das Innenohr einer erwachsenen Maus

Quelle: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verabreichung eines therapeutischen Gens in das Innenohr eines Mauswelpen mit genetisch bedingtem Hörverlust. Unter Verwendung eines Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors wird das Gen durch die runde Fenstermembran injiziert, wodurch Viruspartikel in Haarzellen eindringen, die Produktion von...

Virale vektorbasierte Gentherapie zur Wiederherstellung des Gehörs im Mausmodell

Es gibt verschiedene Methoden, um ototoxische Wirkstoffe in die Cochleae von Tiermodellen einzuführen. Vorgestellt wird ein chirurgisches Protokoll zur Verabreichung von ototoxischen Wirkstoffen an die runde Fensternische. Das Verfahren ist zuverlässig, erzeugt gezielte intracochleäre Läsionen und vermeidet mechanische Schäden an der Mikroarchitektur. Eine Untersuchung der Selbstreparatur/Regeneration der Cochlea ist möglich.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Zwei mikrochirurgische Ansätze zur lokalen Wirkstoffabgabe an das Innenohr werden hier beschrieben und hinsichtlich ihres Einflusses auf Hörparameter, die Cochlea-Zytoarchitektur und die Expression von Entzündungsmarkern verglichen.

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanale Injection

Wir berichten über eine chirurgische Methode, Drogen an das Innenohr von nichtmenschlichen Primaten, Weißbüschelaffe (Callithrix Jacchus), zu verwalten über die Membran des runden Fensters.

Ein chirurgischer Eingriff für die Verwaltung der Medikamente an das Innenohr in eine nicht-menschliche Primaten Weißbüschelaffe (Callithrix Jacchus)

In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine zuverlässige Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen.

Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus

Hier beschreiben wir Canalostomy Verfahren die lokale Medikamentenabgabe in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen durch den Semicircular Kanal mit minimalschaden Hör- und vestibulären Funktion ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, virale Vektoren, Pharma und kleine Moleküle in das Innenohr Maus impfen.

Canalostomy als ein chirurgisches Vorgehen zu Local Drug Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Lernen Sie eine postaurikuläre chirurgische Methode für den Gentransfer ins Mausinnenhör durch die runde Fenstermembran. Diese Technik ermöglicht minimal-invasive virale Lieferung mit geringem Blutverlust und niedriger Mortalität.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

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