High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Veränderungen des phagozytären Prozesses oder der Polymerisation nach der Zugabe von Agonisten oder Antagonisten zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem fluoreszenzmarkierte Partikel zu den phagozytären Zellen hinzugefügt werden und ausreichend Zeit für die Phagozytose eingeräumt wird. Als zweiter Schritt, um die Phagozytose zu stoppen, werden die Zellen mit Triamblau behandelt, um die Fluoreszenz von nicht internalisierten Partikeln zu löschen, gewaschen und später mit Paraldehyd fixiert.

Als nächstes folgt die Färbung und Quantifizierung. Um die Fluoreszenzdetektion von Zellen und Partikeln zu erleichtern, die mit DPI oder Aktin aufrechterhalten werden, zeigen die Ergebnisse die Wirkung der Behandlung auf die Phagozytose und die Aktinpolymerisation, die durch ein Verhältnis von grüner, roter Fluoreszenz zu blauer Fluoreszenz auf der Grundlage einer fluormetrischen Analyse quantifiziert wird. Der Hauptvorteil der fluormetrischen Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es sich um eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Phagozytose handelt.

Es ermöglicht eine minimale Probenmanipulation und eine schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus der Immunologie und Zellbiologie zu beantworten, etwa wie effektiv und wie schnell diese Erreger-Clearance ist. Änderung der Aktionspolymerisation während der Phagozytose und wie wird die Phagozytose oder Axonpolymerisation durch Agonisten oder Antagonisten moduliert.

Zu Beginn der Eingriffsplatte inkubieren die Makrophagen aus der murinen J 7 74-Zelllinie in einer 96-Well-Platte mit klarem oder schwarzem Boden die Adhärenzzellen bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden, um Adion auf die Platte zu lassen. Geben Sie dann die gewünschten Agonisten oder Antagonisten oder Vehikelkontrolle zu den Zellen in zweifacher Konzentration in 50 Mikrolitern PBS oder ergänzten Medien und inkubieren Sie für eine gewünschte Zeitspanne. Stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass die fluoreszierenden Partikel und Markierungen während der Verarbeitung, des Waschens und der Inkubation jederzeit vor Licht geschützt sind.

Um Photobleichen zu verhindern, verwenden Sie die Partikel in Suspension, wie z. B. fluoreszenzmarkierte Dextra-Kügelchen oder exex die Stammlösung für eine Minute. Geben Sie dann eine gleiche Menge opsonisierendes Reagenz zu den fluoreszierenden Partikeln und wirbeln Sie sie eine weitere Minute lang kräftig ein. Anschließend inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, nach der Inkubationszentrifuge waren die Partikel fünf Minuten.

Bei 500-facher G.Entfernen Sie den S-Überstand, der überschüssiges opsonisierendes Reagenz enthält. Waschen Sie danach die Partikel mit 100 Mikrolitern PBS. Wirbeln Sie die Probe vor, um das Pellet zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang von 500 bis mal G. Wiederholen Sie diese Schritte zwei weitere Male, um eine ordnungsgemäße Optimierung und Entfernung des ungebundenen Antikörpers sicherzustellen.

Zur Herstellung der Arbeitslösung aus ionisierten Partikeln werden die Partikel in fünf Millilitern Medium wieder suspendiert. Bewahren Sie es dann bis zur weiteren Verwendung lichtgeschützt auf. Geben Sie nun die Arbeitslösung der Partikel in ein steriles Reagenzreservoir.

Geben Sie 50 Mikroliter Opsonisierungspartikel zu den Zellen, die zuvor auf eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter vorbereitet wurden, und lassen Sie die Phagozytose unter Standard-Zellkulturbedingungen stattfinden. Bei der kontinuierlichen Phagozytose-Methode warten Sie 30 Minuten bis eine Stunde, bis die fluoreszierenden Partikel den Boden der Vertiefung erreichen und mit den Zellen in Kontakt kommen. Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, fügen Sie Bakterien in unterschiedlichen Zeitintervallen hinzu und stoppen Sie gleichzeitig die gesamte Platte der Reaktionen.

Um die Verarbeitungsgeschwindigkeit für Adhärenzzellen zu erhöhen, entfernen Sie das Sennet und fügen Sie 50 Mikroliter verdünntes Triamblau mit PBS hinzu, um die Fluoreszenz von nicht internalisierten Bakterien nach der Trian-Inkubation zu löschen. Waschen Sie die Platte zweimal mit PBS, um alle Trianreste zu entfernen. Als nächstes fixieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern 4%Paraldehyd und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Dann den Teller mit PBS waschen. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und fügen Sie 50 Mikroliter DPI hinzu Nach fünf Minuten Färben waschen Sie die Platte zweimal mit PBS. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter PBS in jede Vertiefung und erfassen Sie die Phagozytose nach der Paraldehydfixierung.

Waschen Sie die Platte bei jeder Wäsche zweimal mit 100 Mikrolitern PBS pro Vertiefung. Geben Sie dann 50 Mikroliter 0,1 % Triton X 100 in PBS zur Permeation in die Zellen und inkubieren Sie sie drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die 0,1 %Triton X zweimal mit PBS ab.

Blockieren Sie anschließend die Zellen 20 Minuten lang mit 1 %BSA, um eine unspezifische Bindung der Markierung zu vermeiden. Bereiten Sie nun die Arbeitslösung von Rod Domine stain vor, indem Sie 100 Mikroliter Methanol-Stammlösung in fünf Milliliter PBS hinzufügen. Entfernen Sie nach dem Blockieren sofort die BSA-Lösung.

Geben Sie 50 Mikroliter Pansenfutter und Arbeitslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Um die Phagozytose zu quantifizieren, legen Sie die Platte in einen Fluoreszenzplatten-Reader Zeichnen Sie die grüne Fluoreszenz mit einem Anregungsfilter bei einer Wellenlänge von 488 Nanometern und einen Emissionsfilter bei einer Wellenlänge von 518 Nanometern und die blaue Fluoreszenz mit einem Anregungsfilter bei einer Wellenlänge von 355 Nanometern und einem Emissionsfilter bei einer Wellenlänge von 460 Nanometern auf. Um die Aktinpolymerisation mit einem Fluoreszenzplatten-Reader zu quantifizieren, zeichnen Sie die rote Fluoreszenz über einen Anregungsfilter bei einer Wellenlänge von 584 Nanometern und einen Emissionsfilter bei einer Wellenlänge von 620 Nanometern und die blaue Fluoreszenz auf.

Feuer- und Anregungsfilter bei einer Wellenlänge von 355 Nanometern und ein Emissionsfilter bei einer Wellenlänge von 460 Nanometern. Als nächstes dividieren Sie die Gesamt-RFU der grünen oder roten Fluoreszenz durch die blaue Fluoreszenzanzeige, abhängig von der Partikelmarkierung oder der phagozytären versus Aktin-Quantifizierung aufgrund der hohen Platte. Um die Varianz zu kennzeichnen, verwenden Sie relative Indizes, um die beobachteten Trends am besten zu veranschaulichen und eine zuverlässigere statistische Analyse zu ermöglichen.

Dieses Bild veranschaulicht die Veränderungen der Aktinpolymerisation nach der Zugabe eines Inhibitors. Dies sind die Pseudopodienbildung und hier sind die Veränderungen in der Membrankräuselung. In diesem Bild ließen die Zellen fitzy konjugierte X-Kügelchen in einem Verhältnis von 20 zu eins Kügelchen zu Zellen 60 Minuten lang internalisieren.

Dann waschen sich die Zellen mit Trian und PBS, fixiert mit Paraldehyd, durchlässig mit Aceton und färben auf F-Aktin. Unter Verwendung von Stäbchendomine, F-Lende und dpi ist die kontinuierliche Phagozytose von opsonisierten und nicht oxidierten Partikeln durchaus vergleichbar. Wobei J 7 74-Zellen Dextra-Kügelchen internalisieren. Interessanterweise nimmt die Aktinpolymerisation nach der Phagozytose zu späteren Zeitpunkten zu und verlangsamt sich, während die Aktinpolymerisation nach der Internalisierung von unop-Partikeln nicht zunimmt, keine der phagozytären Methoden mit Dextra-Partikeln führt zu Veränderungen der Zellviabilität. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden mit mehreren Platten gleichzeitig durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die metrische Fluoranalyse als effiziente, kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur Analyse von Phagozytose und anderen zellulären Prozessen einsetzen können.