Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs In-vivo- Imaging der Maus Spinal Cord

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Bildgebungskammer über dem dorsalen Rückenmark einer Maus zu implantieren, um eine optische Längsbildgebung zu ermöglichen, ohne dass wiederholte chirurgische Anfälle erforderlich sind. Dazu werden zunächst drei Brustwirbel freigelegt und Weichgewebe oberhalb der Wirbelsäule entfernt. Der zweite Schritt besteht darin, die freiliegenden Wirbel mit den Seitenstücken der Kammer zu klemmen und eine dorsale Laminektomie durchzuführen.

Anschließend wird die obere Platte der Kammer fest über dem freiliegenden Rückenmark befestigt und mit Silikonelastomer und einem Deckglas abgedichtet. Der letzte Schritt besteht darin, die Haut um das Implantat herum mit Klebstoffen zu versiegeln und dem Tier zu ermöglichen, sich zu erholen. Letztendlich wird die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um das zelluläre Verhalten und die Gewebestruktur im Rückenmark mit subzellulärer Auflösung über die Zeit abzubilden.

Der Hauptvorteil unserer neuen Methodik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der wiederholten chirurgischen Eröffnung des Rückenmarks, besteht darin, dass eine nahezu beliebige Anzahl von Bildgebungszeitpunkten über einen langen Zeitraum verteilt werden kann, ohne die mit wiederholten Operationen verbundenen Komplikationen wie mögliche Infektionen, chirurgische Traumata oder Tierstress. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir uns mit den bisherigen Erfolgen der longitudinalen Bildgebung nach einer Querschnittlähmung beim transparenten Zebrafisch beschäftigten. Wir beschlossen dann, dieses Paradigma auf das Säugetiermodell auszuweiten.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Bereich des Brustbogens einer Maus rasieren, die mit Isof-Fluor betäubt wurde. Entfernen Sie dann die getrimmten Haare. Als nächstes verabreichen Sie der Maus die Mischung aus Kochsalzlösung, Ketoprofen und Dexamethason subkutan.

Mit Wattestäbchen. Führen Sie drei abwechselnde Waschgänge mit Jod und 70 % Ethanol durch und warten Sie zwischen den Waschgängen eine Minute. Verabreichen Sie danach 100 Mikroliter 0,125% Bupivacain subkutan in die Mitte des rasierten Pflasters, um die Schmerzen an der Inzisionsstelle zu lindern.

Übertragen Sie dann die Maus auf die benutzerdefinierten Stereo-Attacken. Setzen Sie das Rektumthermometer ein und warten Sie ca. 10 Minuten, bis das Bupivacain unter dem Mikroskop wirkt. Mache mit einer Skalpellklinge einen fünf Millimeter großen Schnitt über den interessierenden Wirbeln.

Vergrößern Sie danach die Öffnung in der Haut durch stumpfe Dissektion. Als nächstes dissoziieren Sie sanft die Bindefaszie zwischen der Haut und dem darunter liegenden Muskel. Halten Sie die Haut für einen größeren Arbeitsbereich mit den Retraktoren zurück und achten Sie darauf, das Gewicht auf der Brust nicht zu erhöhen und die Atmung zu behindern.

Fassen Sie dann mit einer Pinzette den rostralen, den größten Wirbel, der durch den darüber liegenden Muskel freigelegt wird. Schneiden Sie das Gewebe auf beiden Seiten des Dorsalfortsatzes von drei Wirbeln ab. Entfernen Sie anschließend das gesamte darüber liegende Gewebe vom dorsalen Laminat.

Schneiden Sie anschließend vorsichtig die an den Wirbeln ansetzenden Sehnen an beiden Seitenkanten der Wirbelsäule ab. Entfernen Sie vorsichtig so viel Gewebe wie möglich von den Seitenkanten der Wirbelsäule, um eine saubere Klemmfläche zu schaffen. Entferne dann vorsichtig die Wirbel von verbleibendem Weichgewebe.

Schneiden Sie mit einem Knochenschaber und einem Wattestäbchen unpassendes Gewebe mit der chirurgischen Schere ab. Stellen Sie als Nächstes die Retraktoren so ein, dass das Gewebe, das die Wirbelsäule umgibt, zurückgehalten wird. Befestigen Sie die Implantat-Seitenstege zusammen mit der Haut an den Zacken an den Entbindungspfosten und setzen Sie sie in die Stifthalter ein.

Als nächstes klemmst du die drei Wirbel fest. Verwenden Sie die Seitenleisten, indem Sie gerade genug Druck ausüben, um sie sicher zu halten. Verwenden Sie dann die Pinzette, um eine nivellierte Klemmung der drei Wirbel zu gewährleisten.

Stellen Sie sicher, dass die Seitenleisten sowohl waagerecht als auch parallel sind, bevor Sie die Laminektomie durchführen. Reinigen und trocknen Sie danach die Rückenfläche der eingeklemmten Wirbel vorsichtig mit Wattestäbchen. Führen Sie bei diesem Verfahren die Spitzen der Vana-Schere in den Epiduralraum des medial geklemmten Wirbels ein und drücken Sie die Griffe leicht zusammen.

Wenn der Knochen trocken ist, sollte er entlang der Rückenlamina reißen. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der kontralateralen Seite, um die Lamina zu lösen, während Sie die lose Lamina greifen. Schneiden Sie vorsichtig durch den dorsalen Prozess mit einer Pinzette das Bindegewebe an den rostralen und verwöhnten Enden der Lamina ab. Waschen Sie dann das Blut über dem Rückenmark gründlich mit 0,9 % Kochsalzlösung ab oder nehmen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Wattestäbchen auf.

Schneiden Sie danach die seitlichen Kanten des Knochens ab und fahren Sie mit den Seitenstegen des Implantats fort. Kontrollieren Sie anschließend die Blutung mit Wattestäbchen und Kochsalzlösung. Für den Fall, dass sich ein Teil des Periosts abgelöst hat und über dem Rückenmark liegt, entfernen Sie das Gewebe vorsichtig mit Wattestäbchen und einer 29- bis 30-Gauge-Nadel.

Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu verletzen und verwechseln Sie das lose Periost nicht mit einem fest umwickelten Dator. Am Ende. Versiegeln Sie die verbleibenden freiliegenden Ränder des Knochens mit Zahnsäure, Acryl und Cyanacrylat.

Achten Sie besonders darauf, dass der Kleber nicht auf das freiliegende Rückenmark gelangt. Positionieren Sie nun die obere Platte vorsichtig so auf dem Tier, dass die vier Schlitze mit den vier Löchern an den Seitenstangen übereinstimmen und die Öffnung über dem freiliegenden Rückenmark liegt. Beginnen Sie mit einem Juwelierschraubendreher vorsichtig mit der ersten Schraube und stabilisieren Sie den Schaft des Schraubendrehers mit einer weiteren Pinzette.

Ziehen Sie die Schraube zu diesem Zeitpunkt nicht fest, sondern setzen Sie sie so ein, dass die ersten Gewinde eingerastet sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen drei Schrauben. Wenn alle vier Schrauben an Ort und Stelle sind, ziehen Sie jede Schraube abwechselnd in denselben kleinen Schritten fest, bis alle Schrauben fest sitzen.

Verwenden Sie anschließend das Silikonelastomer der Marke Quick Sill, um den Raum zwischen dem Rückenmark und der Glasscheibe zu füllen, und tragen Sie es auf das freiliegende Rückenmark auf. Achten Sie darauf, dass Sie alle silikonhaltigen Luftblasen aus dem Mischkanülen entfernen, bevor Sie es auftragen. Legen Sie dann schnell einen fünf Millimeter dicken Deckslip in den Einsatz in der Deckplatte.

Üben Sie genügend Druck aus, um das flüssige Elastomer allmählich zusammenzudrücken, um das Rückenmark zu umgeben, ohne dass es zu einer Kompression des Rückenmarks kommt. Decken Sie anschließend die Ränder des ausgeschiedenen Elastomers mit Dental-, Acryl- und Cyanacrylat-Stoffen ab und kleben Sie das Elastomer mit den Klebstoffen so weit wie möglich auf den umgebenden Knochen, um zu verhindern, dass sich das Elastomer über die Oberfläche des Rückenmarks verschiebt. Entfernen Sie anschließend die Retraktoren und ziehen Sie die Haut um den Rand des Implantats nach oben.

Verwenden Sie das Cyanacrylat, um die Haut an den Rändern des Implantats zu verkleben. Setzen Sie danach die Schrauben in die Flügel der Deckplatte ein. Verschließen Sie anschließend die Lücken in den Schraubenschlitzen der Deckplatte mit Dentalkunststoff, bevor Sie das Tier zur Bergung wieder in den Käfig setzen.

Vor den bildgebenden Verfahren wird die Maus erneut betäubt und die freiliegenden Schrauben des Implantats zur Stabilisierung an den Gewindestiften befestigt. Diese Abbildung zeigt, dass eine chronische Wirbelsäulenkammer über mehrere Wochen optisch transparent bleibt. Dabei handelt es sich um weiße bis helle Bilder des Rückenmarks, die von einigen Minuten bis drei Wochen nach der Operation reichen.

Die Gefäßmarken sind zu allen Zeitpunkten identifizierbar. Einen Tag nach der Operation ist kaum eine Veränderung zu sehen. Bereits nach drei Tagen ist in einem Teil des Fensters eine dichte fibröse Überwucherung vorhanden, die zu einer teilweisen Verschleierung des Bildgebungsbereichs führt.

Eine leichte Neovaskularisation ist ebenfalls vorhanden, verdeckt aber das ursprüngliche Gefäßsystem nicht bei weißem Licht oder zwei PEF-Bildgebungen. Die chronische Wirbelsäulenkammer ermöglicht eine wiederholte Multiphotonen-Bildgebung, ohne dass wiederholte Operationen erforderlich sind. Hier sind die Bilder einer transgenen Maus, die YFP in einer Untergruppe von DRG-Axonen im dorsalen Fii des Rückenmarks exprimiert.

Das Gefäßsystem wurde durch intravaskuläre Farbstoffinjektion markiert, dargestellt in rot. Die Aktivität von Mikroglia kann auch im Laufe der Zeit in Oberschenkelmäusen, einer, YFP, CX, drei CR, einer GFP, doppelt transgenen Mäusen verfolgt werden, während Axone und Mikroglia sichtbar bleiben. Kontrast und Auflösung nehmen mit der Zeit leicht ab.

Einmal gemeistert. Diese Technik kann in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie nach ihrer Entwicklung richtig durchgeführt wird. Diese Technik ebnete uns den Weg, um die zeitliche und räumliche Heterogenität des Axonsterbens nach einer Rückenmarksverletzung zu erforschen.

Und Mäuse.