Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Ein hochgradig reproduzierbares Modell für Myokardinfarkt bei Mäusen mit minimalinvasiven Manipulationen wird beschrieben. Das Modell kann einfach durchgeführt werden, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit und Überlebensrate führt. Somit wird das beschriebene Modell die Anzahl der benötigten Tiere reduzieren, wie es das 3R-Prinzip (Replacement, Refinement and Reduction) verlangt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit minimalinvasiven Manipulationen einen hochreproduzierbaren Myokardinfarkt bei Mäusen zu induzieren. Dies wird durch eine Intubation unter einem Stereomikroskop erreicht, um die Position der Intubationskanüle während des Eingriffs zu kontrollieren. Im zweiten Schritt wird ein diskreter seitlicher linker Schnitt zwischen den Rippen gesetzt, um die Brusthöhle zu öffnen und eine schnelle Heilung zu ermöglichen.

Die Ligatur der linken absteigenden Koronararterie wird dann entsprechend der entsprechenden nachgeschalteten Manipulation platziert. Letztendlich können Größe und Form des Infarkts durch die standardmäßige immunhistomorphometrische Analyse beurteilt werden. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden bestehen darin, dass sie minimalinvasiv, hochgradig reproduzierbar und leicht durchzuführen ist, so dass Forscher mit minimaler Erfahrung mit einer Methode sie in Kleintiermodellen anwenden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Größe des Mausherzens eine hohe Präzision der Manipulation erfordert. Während der Mikrochirurgie. Beginnen Sie damit, eine betäubte acht bis 10 Wochen alte männliche Maus mit dem Typ C 57 BL in Rückenlage auf einen beheizten Operationstisch zu legen.

Nachdem Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenkneifen bestätigt haben, tragen Sie Augensalbe auf das Tier auf und verwenden Sie ein kleines Rasierer, um die Haare aus dem ventralen Halsbereich und der linken Hälfte des Brustkorbs zu entfernen, desinfizieren Sie die Haut mit 70%igem Ethanol und Brutderhaut. Machen Sie dann einen kleinen 0,5 Zentimeter großen Mittelschnitt in der Mitte des Halses. Sobald Sie unter der Haut sind, führen Sie ein Paar steril gebogene Pinzetten durch die beiden Fettkörper, um die Visualisierung der Luftröhre durch den abdeckenden Muskel zu erleichtern.

Führen Sie die Intubationskanüle mit einem Stereomikroskop oral in die Luftröhre ein. Die Kanüle sollte durch das durchsichtige Gewebe hindurch beobachtet werden. Nachdem Sie die richtige Platzierung des Instruments bestätigt haben, schließen Sie die Kanüle an das Beatmungsgerät für Kleintiere an und stellen Sie die Beatmungseinstellungen auf ein Atemzugvolumen zwischen 100 und 150 Mikrolitern und eine Atemfrequenz zwischen 100 und 150 Aspirationen pro Minute ein, um einen Myokardinfarkt auszulösen.

Machen Sie als nächstes einen weniger als 0,5 Zentimeter langen Schnitt in der Haut zwischen dem Xiphoid-Prozess und dem linken Xi.Trennen Sie dann mit einer Pinzette die Muskelschicht von den darunter liegenden Rippen für einen chronischen Infarkt. Machen Sie einen Schnitt im fünften Interkostalraum für ein Ischämie-Reperfusionsmodell. Machen Sie den Schnitt im vierten Interkostalraum.

Als nächstes platzieren Sie Retraktoren in den Schnitt, um die Brusthöhle zu öffnen und das Herz sichtbar zu machen. Entfernen Sie dann vorsichtig das Perikard, um übermäßige fibrotische Prozesse zu verhindern, und stellen Sie sich die linke absteigende Koronararterie als das tief positionierte hellrote Gefäß vor. Für das Modell des chronischen Infarkts platzieren Sie eine Ligatur in der Mitte der ventralen Seite des Herzens zwischen dem Orakel und der Spitze, wobei Sie die linke absteigende Koronararterie als Referenz verwenden.

Um dann den transmuralen vorderen und hinteren Infarkt zu erhalten, verwenden Sie eine Null-Sieben-Seidennaht, um beide Äste der Arterie zu verbinden. Für das Ischämie-Reperfusionsmodell platzieren Sie die Ligatur unter dem Orakel und über einem Silikonschlauch und dem Hauptkörper der linken absteigenden Koronararterie. Legen Sie während der Ischämie-Phase Schläfennähte auf die Rippen und befeuchten Sie die Nähte mit einer Kompresse, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.

Entfernen Sie dann nach der Ischämie den Silikonschlauch und schneiden Sie die Naht mit einer kleinen Schere auf, um die Reperfusion sichtbar zu machen. Nach dem Auslösen des Infarkts den Thorax mit warmer isotonischer Salzlösung füllen, um die Restluft zu beseitigen. Dann verschließen Sie den Thorax mit 3 0 6 Nähten und positionieren Sie die medialen Nähte in einem 90-Grad-Winkel, um einen dichten Verschluss der Rippen zu gewährleisten.

Verschließen Sie die Muskelschicht mit zwei Nähten, gefolgt von einem Verschluss der Haut mit drei bis vier Nähten, je nach Bedarf. Trennen Sie dann die Intubationskanüle vom Beatmungsgerät, um eine spontane Atemmarkierung der Maus für eine spätere Identifizierung zu ermöglichen, und halten Sie das Tier unter eine rote Lampe, bis es aufwacht. Um die Myokardinfarktdaten zu analysieren, überwachen Sie regelmäßig die Ejektionsfraktion, die fraktionierte Verkürzung des Herzzeitvolumens und die Herzdimensionen mittels Echokardio.

Öffnen Sie am Ende des Experiments die Brusthöhle und entfernen Sie das Herz. Legen Sie das Taschentuch für ausgiebiges Waschen in steriles PBS. Sobald das gesamte Blut entfernt wurde, stoppen Sie das Herz in der Diastole mit einer gesättigten Kaliumchloridlösung und fixieren Sie das Gewebe über Nacht in 10%igem Formalin.

Betten Sie den dünnen Schnitt des Herzgewebes in Paraffin ein, indem Sie die Spitze des Herzens am unteren Rand des Montageblocks positionieren, um einen Querschnitt des Gewebes zu ermöglichen. Sammeln Sie dann 20 serielle Abschnitte von fünf Mikrometern und verwerfen Sie die nächsten 300 Mikrometer. Sammeln Sie weiterhin alle 300 Mikrometer 25-Mikrometer-Abschnitte, bis die Höhe der Mitralklappe erreicht ist.

Verwenden Sie dann die einstufige Färbung von mori, um die Infarktgröße des Gewebes zu messen und die TTC-Färbung durchzuführen. Bauen Sie die Ligatur wieder auf und verwenden Sie eine Aortenkanüle, um das Herz mit 200 Mikrolitern 1%iger Evans-Blau-Lösung zu durchbluten, und frieren Sie das Herz in einer kleinen Plastiktüte bei minus 20 Grad Celsius ein, ohne es zu waschen. Nach zwei Stunden entnehmen Sie mit einem scharfen Skalpell fünf Querschnitte aus dem Gewebe und inkubieren die Schnitte 10 bis 15 Minuten lang.

In TTC-Lösung bei 37 Grad Celsius gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach einer weiteren 10-minütigen Fixierung in 10%igem Formalin übertragen Sie die Schnitte auf Glasobjektträger. Für die histologische Analyse.

Je nach verwendetem Modell unterscheidet sich die Infarktgröße. Das Modell des chronischen Infarkts induziert einen zirkulären transmuralen Infarkt der Spitze, während das Ischämie-Reperfusionsmodell eine dünne Mittelwand im gesamten Herzen induziert. Um den direkten Einfluss des Infarkts auf die Lebensfähigkeit des Herzens zu analysieren, kann die Evans-Blau-TTC-Färbung verwendet werden, um das gesunde Myokard, das nicht von der Ischämie betroffen ist, in blau, das lebensfähige Risikomyokard im ischämischen Bereich in rot und das abgestorbene Gewebe in weiß zu zeigen.

In der Regel wird die Infarktgröße als Prozentsatz des Risikobereichs der Maori ausgedrückt. Die einstufige Färbung ermöglicht die Messung der reifen Narbe, die aus dem Umbauprozess resultiert, wobei die blau gefärbten, infarktierten und rot gefärbten gesunden ventrikulären Bereiche im ersten Schnitt aus jeder Ebene des Herzgewebes, die vor der Mitralklappe erworben wurden, analysiert werden. Der Infarkt aus allen Schnitten wird dann als Prozentsatz des gesamten linksventrikulären Volumens ausgedrückt.

Auch konventionelle Färbeverfahren können durchgeführt werden, z. B. in diesen Bildern. Die Färbung von CD 31 und glattem Muskelaktin wurde verwendet, um das Vorhandensein von Angiogenese bzw. Myofibroblasten im infarzierten Gewebe nachzuweisen. Verwenden Sie eine Doppelfluoreszenzfärbung, um die verschiedenen Zielmoleküle im Infarktbereich zu identifizieren, da in Abwesenheit von Kardiomyozyten keine Autofluoreszenz beobachtet wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 25, 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Eine ausreichende Schmerzbehandlung ist notwendig, um eine hohe Reproduzierbarkeit nach diesem Verfahren zu gewährleisten. Es können auch andere Funktionsanalysen durchgeführt werden, wie z. B. intraventrikuläre Untersuchungen, Druckmessungen, Ultraschall oder isolierte Herzlunge.

Ende der Perfusion.