Name: Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Lernen Sie die Perjodsäure-Schiff-Färbung zur Visualisierung von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse des Kohlenhydratgehalts in Immunzellen aus menschlichem Blut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des NSERC Discovery Program mit der Fördernummer RGPIN 418522-2013 unterstützt. Wir danken R. Kilgour für die hilfreichen Diskussionen und Katelin Gresty und Dr. A. Berghdal für die Bereitstellung der Mausmuskelschnitte.

Forschung mit menschlichen Blutproben wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 10000618. die Arbeit an dem Maus-Muskel wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 2010BERG zugelassen. 1. PBMC Isolierung aus Vollblut HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang in einer Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik und hersteller sterilisiert Ausrüstung. <ol><li> Gießen Sie 10-15 ml Vollblut aus dem heparinisierten (Antikoagulans) Blutentnahmeröhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Für kleinere Blutverschmutzungen, wischen Sie mit ddH 2 O und 70% EtOH mit Reinigungstuch. </li><li> Verdünne das Blut in dem konischen Rohr an einen 1: 1-Verhältnis mit Phosphatpuffer-Saline (PBS 1x), pH 7,4. Stellen Sie sicher, dass die maximale Gesamtmenge ist 30 ml nicht überschreiten. </li><li> Mischen Sie vorsichtig mit einem serologische Pipettenpistole blasenfrei. HINWEIS: durch Umdrehen des Röhrchens, um Blut zu vermeiden eine nicht mischenccumulation in der Kappe und nachfolgende Einsickern während der Zentrifugation. </li><li> Hinzufügen 13 ml Ficoll-Paque (siehe Materialien und Geräte-Tabelle), in ein neues konisches Rohr 50 ml Kapazität. Halten Sie das Rohr aufrecht im Rack. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, nehmen verdünnte Blut, berühren Sie die Transferpipettenspitze an der Innenwand der Röhre in der Nähe der Spitze. Mit langsamen und stetigen Druck, übertragen das Blut entlang der Innenwand des Rohres bildet eine Blutschicht, die auf der Oberseite des Saccharose-Schicht. Führen Sie diesen Schritt so oft, bis alle Blut übertragen wurde. </li><li> Das Röhrchen verschließen und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 700 · g in einer Schaukel Rotor mit mittleren Beschleunigungssatz bis 5, und Verzögerung auf Null gesetzt. </li><li> Langsam nehmen Sie das Rohr und ohne die Schichten zu stören, nehmen Sie es zurück zu der Biosicherheitswerkbank. </li><li> Die Buffy-Coat (dünne weiße Schicht bedeckt), wobei PBMCs werden, zwischen dem PBS / Plasma ein gelegt sorgfältig sammelnnd ficoll Schichten mit einer Transferpipette. Vermeiden Sammeln Saccharoseschicht und nicht die Schicht roter Blutkörperchen stören. </li><li> Übertragen Sie die Buffy-Coat in eine neue 50 ml sterilen konischen Rohr. Es kann mehrmals der Wiederholung von Schritt 1.8, alle PBMC sammeln zu nehmen. </li><li> In PBS pH 7,4 in das Röhrchen mit der PBMC und füllen Sie bis zur 45 ml-Marke. Schütteln Sie Rohr gründlich. Nicht mit dem Vortex. </li><li> Waschen Sie 1: Zentrifuge für 15 Minuten bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung bis 9 eingestellt Bildung eines Pellets aus PBMCs Beachten Sie am unteren Rand der konischen Rohr. </li><li> Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in einem Kunststoffbecher mit 10 ml Bleichmittel. </li><li> Lösen Zellpellet vorsichtig &quot;Abstich&quot; gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex. </li><li> Zugeben von 25 ml frischer PBS pH 7.4 mit dem Rohr. Wenn mehr als ein Rohr bearbeitet wird, bündeln die Pellets zusammen in diesem Schritt. </li><li> Waschen 2: zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 · g with sowohl maximale Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt. </li><li> Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Kunststoffbecher mit einem Schuss Bleichmittel. </li><li> Gently &quot;Rack&quot; gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex. </li><li> Zugeben von 25 ml frischer PBS zu dem Rohr. <ol><li> Nehmen Sie 50 ul der Zellen und Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Lebensfähigkeit Zahl. </li><li> In die gleiche Menge (50 ul) von Trypanblau (a Lebensfähigkeit Färbung) und Pipette auf und ab, um sanft zu mischen. </li></ol></li><li> Nehmen Sie 10 ul und überträgt es auf einem Hämocytometer, um die Lebensfähigkeit der Zellen pro ml zu überprüfen. Nehmen die Anzahl der Zellen / ml. </li><li> Nehmen Sie die gewünschte Menge an Zellen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt. </li><li> Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Becher mit Bleichmittel. </li><li> Gently &quot;Rack&quot; gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). In 80 ul PBS in die Röhre. </li></ol> 2. Machen Sie die PBMC Slide <ol><li> Platzieren 80 ul der Zellen auf einen Objektträger. Schmieren Sie das Drop mit Hilfe von einer anderen Folie oder stellen Sie 2 Tropfen von 40 ul jeweils an beiden Enden des Schlittens. </li><li> Lassen Sie Folie in der biologischen Sicherheitswerkbank, um zu trocknen. Beschriften Sie die Folie mit einem Bleistift auf der mattierten Seite. </li></ol> 3. Befestigung der Proben auf den Objektträger <ol><li> Bereiten Sie die Fixierungslösung durch Mischen von 0,5 ml 37% Formaldehyd und 4,5 ml 99% Ethanol. </li><li> Nachdem die Folien getrocknet sind, nehmen Sie 2 ml der frisch zubereiteten Fixierlösung und gießen Sie sie auf der Folie, so dass die gesamte Oberfläche der Folie bedeckt ist. </li><li> Verlassen die Lösung auf den Objektträger für 1 min. Spülen Sie den Schieber für 1 Minute mit Leitungswasser und lassen Sie es an der Luft trocknen. </li></ol> 4. Erstellen Sie die Amylase-Lösung für Negativkontrolle <ol><li> Nehmen 0,25 g Amylase Pulver und in 50 ml Di auflösengestillt Wasser. Füllen Sie die Lösung in einem sauberen 100 ml-Becher. </li><li> Tauchen Sie die Folie in den Becher, so dass die Hälfte der Folie erhält die Behandlung und die andere Hälfte bleibt unbehandelt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur (Abbildung 1 C) inkubieren. </li><li> Notieren Sie sich auf der Seite des Schlittens erhält den Amylase-Behandlung. Ziehen Sie eine Linie auf der Rückseite der Folie, die die Grenze zwischen der Behandlung und Kontrolle. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O, um die Amylase-Lösung zu entfernen und die Folie an der Luft trocknen. </li></ol> 5. Führen Sie Periodic Acid Schiff (PAS) Färbung und Imaging HINWEIS: PAS Reagenzien sind giftig beim Einatmen und korrosiv sind, so dass die Schritte müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden, und die Abfallprodukte müssen fachgerecht gemäß gültiger Richtlinien entsorgt werden. <ol><li> Stellen Sie den Schieber auf eine flache Oberfläche und gießen 1,50-2,00 ml Perjodsäure-Lösung auf die Probe. Incubate für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Folien in mehreren Ladungen destilliertem Wasser. </li><li> Gießen 1,50-2,00 ml Schiffs-Reagenz auf den Objektträger, Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser für 5 Minuten und lassen Sie es an der Luft trocknen. </li><li> Übernehmen 10 ul Eindeckmittel auf dem Objektträger geben und mit zwei kleinen Deckgläser oder gelten 50 ul und Nutzung einer großen Deckglas. </li><li> Bewerben klaren Nagellack auf den Kanten des Deckglases, lassen Sie über Nacht trocknen. </li></ol> 6. Rufen Sie Bilder mit dem Fernglas Lichtmikroskop Mit dem 100X Ziel

<ol><li>Rich, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+keilin%27s+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of keilin's respiratory chain.</a> Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).</li>
<li>Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiles+of+three+fiber+types+of+skeletal+muscle+in+guinea+pigs+and+rabbits%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits).</a> Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).</li>
<li>Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+glycogen+content+in+various+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte glycogen content in various disease.</a> J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).</li>
<li>Scott, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+in+human+peripheral+blood+leukocytes.+I.+characteristics+of+the+synthesis+and+turnover+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).</li>
<li>Fedele, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((positive+index+of+lymphocytes+and+metabolic+control+in+insulin-treated+and+type+II+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabete+Metab%22%5BJournal%5D)">positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus.</a> Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).</li>
<li>Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+peripheral+blood+granulocytes+and+lymphocytes+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Pol.Med.Sci.Hist.Bull%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).</li>
<li>Yunis, A. A., Arimura, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+of+glycogen+metabolism+in+white+blood+cells.+I.+glycogen+phosphorylase+in+normal+and+leukemic+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%2C+Res%22%5BJournal%5D)">Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes.</a> Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).</li>
<li>Hagemans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAS-positive+lymphocyte+vacuoles+can+be+used+as+diagnostic+screening+test+for+pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inherit.+Metab.+Dis%22%5BJournal%5D)">PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease.</a> J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).</li>
<li>Totsuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+performance+and+soleus+muscle+fiber+composition+in+wild-derived+and+laboratory+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains.</a> 95 (2), 720-727 (2003).</li>
<li>Murat, J. C., Serfaty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+enzymatic+determination+of+polysaccharide+%28glycogen%29+content+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues.</a> Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).</li>
<li>Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+protein+regulates+glycogen+phosphorylase+activation+and+controls+interleukin+%28IL%29-2-dependent+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation.</a> J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).</li>
<li>Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+titration+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical titration of glycogen in vitro.</a> J.Vis.Exp. (81), (2013).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagliabracci+V.S.+Glycogen+and+its+metabolism%3A+Some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.J%22%5BJournal%5D)">Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes.</a> Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+of+glycogen+in+rat+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence of glycogen in rat thymus.</a> Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).</li>
<li>Darlington, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+Th17+%28not+Th1%29+responses+underlie+multiple+sclerosis+disease+abrogation+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.Neurol%22%5BJournal%5D)">Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).</li>
<li>Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atlasofms.org">http://www.atlasofms.org</a> (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die kritischen Schritte dieses Video Artikel waren beim Waschen und Amylase-Behandlung der Zellen. Beim Waschen der Objektträger wurde der entscheidende Schritt mit einem Kunststoff squeezable Waschflasche und ließ das Wasser sanft durch die Probe auf dem Objektträger laufen und nicht direkt mit dem Ziel auf die Proben. Selbst die geringste direkte Wasserdruck würde die Zellen veranlassen, kommen aus der Folie. Ein weiterer wichtiger Schritt war, um dieselbe Folie für ± Amylase Bedingungen. Nachdem die PBMCs mit dem Sch...

Perjodsäure Schiff (PAS) -Färbung eine immunohistochemische Technik, die weit verbreitet in der Muskel Forschung und Diagnostik eingesetzt wird. Es wird auch als ein diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet. Diese Technik funktioniert, indem Periodsäure-Lösung zu der Probe, die innerhalb der Polysaccharid Schaffung Aldehydgruppen, die mit dem farblosen Schiffs-Reagenz, wodurch eine tiefmagenta Produkt reagieren Einheiten oxidiert. Die Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Fleck macht nichts mit Polysacchariden magenta, einschließlich Glykogen, Glycoproteine, Glycolipide, Mucinen, oder andere Moleküle mit Polysaccharid-Gruppierungen. PAS-Färbung wird oft verwendet, um Glykogenspiegel in Muskelfasern messen. Muskeln Gewebeschnitte sind für die Technik, wenn sie fest an dem Schieber aushalten mehrere Wasch- und Färbeschritte. Glykogen ist den meisten in schnell kontra vorhanden Typ-II-Muskelfasern, die einen hohen Bedarf habenfür die schnelle Produktion von ATP Glykogen für maximale Leistung 1,2 erfordern. Glycogen ist ein verzweigtes Polymer von Glucose, die in freie Glucose durch die Wirkung von Glycogenphosphorylase-Enzyme abgebaut werden können. In Zeiten der Ruhe und Nahrungsversorgung, wird Glykogen durch den Prozess der Glykogenese aufgefüllt, während in Zeiten der Mangelernährung oder Hochenergiebedarf; Glykogen in Glukose durch Glykogenolyse gebrochen. Bereits ab den 1950er Jahren Kliniker Wissenschaftler haben erforscht PAS-Färbung auf Blutproben Glykogengehalt bei verschiedenen Erkrankungen 3-7 analysieren. Zum Beispiel bei Morbus Pompe-einer bonafide Glykogenspeicher krankheits- weißen Blutkörperchen sammeln sich große Mengen an Glykogen, die wesentlich von gesunden Kontrollen 8 unterscheidet. Dieses Video-Artikel beschreibt eine angepasste Version von PAS-Färbung für den Einsatz in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) Proben von venösem Blut von gesunden Probanden. PBMCs enthalten hauptsächlich Lymphozyten T-Lymphozyten und B-Lymphozyten-Familien, wie auch andere Immunzellen, wie NK-Zellen und Monozyten. Der erste Reinigungsschritt entfernt Erythrozyten, Neutrophilen, Granulozyten und andere. Diese Technik liefert Daten zu einer konzentrierten Anteil der Lymphozyten sich die Robustheit Aufzählung von PAS-positiven Zellen im Vergleich zur Verwendung von Vollblutabstrichen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg"> Abb. 1: Schritt für Schritt Methodik der PAS-Färbung auf PBMC (A) Zunächst wird Isolierung von PBMC durch Ficoll Gradienten erreicht, zeigt der linken Seite die Vorbereitung vor dem Zentrifugieren, zeigt sie nach der Zentrifugation im rechten Feld, wo die Speckhaut, die den PBMC ist in der Mitte des Rohres beobachtet. (B) Isolierte PBMC werden auf den Objektträger unter Verwendung von Formalin-ethanol Fixierungslösungen festtion. Der Schieber wird sanft mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche gespült. (C) Der Objektträger wird dann in einem 100 ml-Becherglas zur Hälfte mit Amylase-Lösung gefüllt, die Glykogen auflöst platziert. Der Objektträger wird vorsichtig gespült. (D) Der Objektträger wird mit Perjodsäure-Lösung, wobei die Oxidation von Sacchariden erfolgt behandelt. Die Objektträger werden schonend gespült; Dies wird das überschüssige Periodsäure zu entfernen und Beenden des Oxidationsschrittes. (E) Wenn der Schiff'schen Reagenz auf den Objektträgern zu, wird es mit Aldehyden während der Oxidationsstufe erstellt reagieren. Dieser farblose Reagenz wird dann in einem tiefrote magenta Produkt führen. Die Objektträger werden schonend gespült, das überschüssige Schiff-Reagenz zu entfernen.

<table><tbody><tr><td>Periodsäure-Schiff-Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Die Materialien in diesem Kit sind toxisch und gesundheitsschädlich. Vorsicht ist geboten.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase aus Schweinepankreas</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen-Assay-Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>Nichtionisches synthetisches Polymer von Saccharose.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td>Für die PBMC-Isolierung wurden Schwenkköbel verwendet.</td></tr></tbody></table>

erkennen von glykogen in peripheren mononukleären blutzellen mit perjodsäure-schiff-färbung

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Die periodische Säure-Schiff-Färbung (PAS) ist eine immunhistochemische Technik, die bei Muskelbiopsien und als diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet wird. Polysaccharide wie Glykogen, Glykoproteine und Glykolipide färben sich hellmagentafarben, was es einfach macht, positive und negative Zellen im Gewebe aufzuzählen. In Muskelzellen wird die PAS-Färbung verwendet, um den Glykogengehalt in verschiedenen Arten von Muskelzellen zu bestimmen, während in Blutzellproben die PAS-Färbung als diagnostisches Instrument für eine Vielzahl von Erkrankungen erforscht wurde. Blut enthält einen Anteil an weißen Blutkörperchen, die zum Immunsystem gehören. Die Vorstellung, dass Zellen des Immunsystems Glykogen besitzen und es als Energiequelle nutzen, ist bisher wenig erforscht. Hier beschreiben wir eine angepasste Version des PAS-Färbeprotokolls, die auf mononukleäre Immunzellen aus dem peripheren Blut aus menschlichem venösem Blut angewendet werden kann. Es wurden kleine Zellen mit PAS-positiven Granulaten und größere Zellen mit diffuser PAS-Färbung beobachtet. Die Behandlung von Proben mit Amylase hebt diese Muster auf und bestätigt die Spezifität der Färbung. Eine alternative Technik, die auf enzymatischem Aufschluss basiert, bestätigte das Vorhandensein und die Menge an Glykogen in den Proben. Dieses Protokoll ist nützlich für Hämatologen oder Immunologen, die den Polysaccharidgehalt in Lymphozyten aus dem Blut untersuchen.

Um die Reagenzien und grundlegende Technik zu validieren, wurde PAS-Färbung nach Angaben des Herstellers auf der Maus Soleusmuskel Abschnitten durchgeführt. Die Färbung wurde am gleichen Tag wie die Opfer gemacht und im letzten Schritt der Färbung wurden die Schnitte mit Xylol fixiert. Der M. soleus ist bekannt, enthalten ~ 35% Glykogen-positiven Zellen 9. Die gefärbten Muskelzellen angezeigt zwei verschiedene PAS-positiven Features-punktförmige Granulat in der Zelle, und eine durchgehende Linie Demarkieren d...

Die periodische Säure-Schiff-Färbung ist eine Technik, die den Polysaccharidgehalt von Geweben sichtbar macht. Dieser Artikel zeigt das periodische Säure-Schiff-Färbeprotokoll, das für die Anwendung auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes angepasst ist, die aus menschlichem venösem Blut gereinigt wurden. Solche Proben werden für Lymphozyten und andere weiße Blutkörperchen des Immunsystems angereichert.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Glykogengehalt von mononukleären Zellen des peripheren Blutes sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst P-BMCs aus menschlichem Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Probenschnitte vorzubereiten, indem die Blutzellen verschmiert oder pipettiert und dann mit Fixierlösung behandelt werden, gefolgt von einem anschließenden Waschen für eine Negativkontrolle.Die Hälfte des Objektträgers wird in Amylaselösung getaucht, die Glykogenpolymere auflöst, gefolgt von einer Wäsche. Nun werden die Proben mit periodischer saurer Lösung gefärbt und anschließend gewaschen. Der letzte Schritt besteht darin, das Reagenz der Schicht hinzuzufügen, gefolgt von einer Wäsche.Letztlich wird die Lichtmikroskopie eingesetzt, um die Glykogenspeicher im Inneren der Zellen zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass im Vergleich zur Vollblutfärbung mehr mononukleäre Zellen pro Objektträger vorhanden sind. Daher ist es effizienter, den Glykogengehalt und die Lymphozyten zu analysieren, da Neutrophile und rote Blutkörperchen nicht vorhanden sind.Um dieses Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank zu beginnen, geben Sie vorsichtig 10 bis 15 Milliliter Vollblut aus dem heparinisierten Blutentnahmeröhrchen in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie anschließend das Blut in PBS one X bei pH 7,4 im Verhältnis eins zu eins und stellen Sie sicher, dass das maximale Gesamtvolumen 30 Milliliter nicht überschreitet. Mischen Sie es vorsichtig mit einer serologischen Pipettenpistole und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.Übertragen Sie dann 13 Milliliter nichtionisches synthetisches Saccharosepolymer, FICO, in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie anschließend das verdünnte Blut mit langsamem und gleichmäßigem Druck hinzu, um eine Blutschicht auf der FICO-Schicht zu bilden. Führen Sie diesen Schritt mehrmals durch, bis das gesamte Blut übertragen wurde.Verschließen Sie anschließend das Röhrchen fest und zentrifugieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 Gs. Nehmen Sie danach das Röhrchen langsam heraus und bringen Sie es zurück in die Biosicherheitswerkbank. Sammeln Sie als Nächstes vorsichtig die Buffy-Schicht zwischen den PBS-Plasma- und FICO-Schichten, in denen sich die pbmc befinden. Vermeiden Sie es, die FICO-Schicht zu sammeln und stören Sie die Schicht der roten Blutkörperchen nicht.Übertragen Sie dann den Buffy Coat in ein neues steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie PBS in die Tube mit den P BMCs und füllen Sie sie bis zur 45-Milliliter-Marke. Schütteln Sie die Tube anschließend gründlich.Dann zentrifugieren Sie es 15 Minuten lang. Bei 277 g wird eine Palette mit p BMCs am Boden des konischen Rohrs gebildet. Anschließend den Überstand in ein Plastikbecherglas mit 10 Millilitern Bleiche geben.Lösen Sie das Küvettenpellet, indem Sie das Rohr vorsichtig gegen eine wellige Oberfläche drücken. Geben Sie 20 Milliliter frisches PBS in die Tube. Wenn mehr als ein Rohr verarbeitet wird, ziehen Sie die Pellets in diesem Schritt zusammen.Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 Minuten lang bei 480 g. Den Überstand mit einem Spritzer Bleichmittel in das Plastikbecherglas geben. Schieben Sie das Rohr dann vorsichtig gegen eine wellige Oberfläche.Geben Sie anschließend erneut 25 Milliliter frisches PBS in die Tube. Übertragen Sie 50 Mikroliter der Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Für die Lebensfähigkeit zählen Sie, um die Zellen zu zählen.Fügen Sie 50 Mikroliter Trianblau hinzu und pipettieren Sie zum Mischen vorsichtig auf und ab. Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter der Mischung in ein Hämozytometer. Um die Lebensfähigkeit von Zellen zu überprüfen und die Anzahl der Zellen pro Milliliter aufzuzeichnen.Nehmen Sie die gewünschte Menge an Zellen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 Minuten lang bei 177 gs. Danach gibst du das SUP-Natant mit Bleiche in das Becherglas. Schieben Sie dann das Röhrchen vorsichtig gegen eine wellige Oberfläche und geben Sie anschließend 80 Mikroliter PBS in das Röhrchen.Um den PBMC-Objektträger herzustellen, geben Sie 80 Mikroliter der Zellen auf einen vorbeschrifteten Objektträger, schmieren Sie den Tropfen mit Hilfe eines anderen Objektträgers ab oder geben Sie zwei Tropfen à 40 Mikroliter auf beide Enden des Objektträgers. Lassen Sie die Rutsche in der biologischen Sicherheitswerkbank trocknen. Bereiten Sie dann die Fixierlösung vor, indem Sie 0,5 Milliliter 37 % Formaldehyd mit 4,5 Millilitern 99 % Ethanol mischen.Nachdem die Objektträger getrocknet sind, geben Sie zwei Milliliter der frisch hergestellten Fixierlösung auf den Objektträger, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie die Lösung eine Minute lang auf dem Objektträger, bevor Sie sie eine weitere Minute lang mit Leitungswasser ausspülen. Lassen Sie es dann an der Luft trocknen.Nun auflösen. Punkt: 25 Gramm Amylasepulver in 50 Milliliter destilliertes Wasser. Gieße die Lösung in ein 100-Milliliter-Becherglas.Tauchen Sie dann die Hälfte des Objektträgers in das Becherglas und inkubieren Sie es 15 Minuten lang. Machen Sie bei Raumtemperatur einen Vermerk auf der Seite, die die Amylase-Behandlung erhält. Zeichnen Sie auf der Rückseite des Objektträgers eine Linie, die die Grenze zwischen Behandlung und Kontrolle anzeigt.Waschen Sie danach den Objektträger mit destilliertem Wasser, um die Amylaselösung zu entfernen. Lassen Sie die Rutsche dann an der Luft trocknen In diesem Schritt legen Sie eine Rutsche auf eine ebene Fläche. Tragen Sie zwei Milliliter periodische Säurelösung auf die Probe auf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Spülen Sie den Objektträger dann mehrmals mit destilliertem Wasser ab. Tragen Sie zwei Milliliter Shifts-Reagenz auf den Objektträger auf und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Rutsche anschließend fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen.Tragen Sie anschließend 100 Mikroliter Montagemedien auf die Folie auf und decken Sie sie mit einem großen Deckglas ab, oder tragen Sie 50 Mikroliter auf und verwenden Sie zwei kleine Deckgläser. Tragen Sie danach Klarlack auf die Ränder des Deckglases auf. Lass sie über Nacht trocknen.Anschließend erhalten Sie Bilder mit dem binokularen Lichtmikroskop mit dem 100-fach-Objektiv PAS. Die Färbung wurde an P-BMCs aus dem venösen Blut gesunder Probanden durchgeführt. Die PAS-gefärbten P-BMCs wiesen eine Vielzahl von Färbemustern auf.Kleine Zellen mit Körnchen waren leicht zu beobachten. Es wurde auch ein Anteil größerer Zellen mit einem diffusen Färbemuster beobachtet. Die Behandlung der Proben mit Amylase entfernte das Granulatsignal und verringerte die diffuse PAS-Positivität.Die PAS- und HEMATIN-Färbung wurde am Vollblutobjektträger durchgeführt. Dieses PBMC ist von vielen Erythrozyten umgeben. 98 % PAS-positives pbmc waren die kleineren Zellen und 40 % die größeren Zellen.Die Amylase-Behandlung eliminierte das PAS-Signal in den kleinen Zellen und verringerte das PAS-Signal in den größeren Zellen signifikant auf 7 %Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit PAS-Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Verwendung einer chemischen Haube sollten während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

detecting-glycogen-peripheral-blood-mononuclear-cells-with-periodic

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert die periodische Säure-Schiff-Färbetechnik zur Bestimmung des Glykogenspiegels von mononukleären Zellen im peripheren Blut in vitro. Der Farbstoff verleiht intrazellulären Glykogenkörnern eine magentafarbene Farbe und macht sie unter dem Mikroskop sichtbar.

Periodische Säure-Schiff-Färbung von Zellen: eine in vitro Technik zum Nachweis des Glykogenspiegels in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

In diesem Video beschreiben wir einen qualitativen spektrophotometrischen Assay, um das Ausmaß der Verzweigung in einer Glykogenprobe mit einer nicht charakterisierten Struktur zu bestimmen. Der Vergleich der Absorptionsmaxima der uncharakterisierten Probe mit denen von Polysacchariden mit bekannten verzweigten Strukturen deutet auf das Vorhandensein von Verzweigungen in der nicht charakterisierten Probe hin.

Glykogenverzweigungsassay zur Messung des Grades der Glykogenverzweigung

Wir beschreiben hier eine genaue, reproduzierbare und bequem biochemische Methode zur Titration von Glykogen in vitro. Diese Technik nutzt die Abcam Glykogen-Assay-Kit und ist auf aufeinander folgende Hydrolyse von Glykogen durch Fluoreszenz Glukose und Glukose-Titration.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Techniken zur Messung der Aktivität von Schlüsselenzymen des Glykogenstoffwechsels werden vorgestellt, wobei ein einfaches Spektralphotometer verwendet wird, das im sichtbaren Bereich arbeitet.

Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.

Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung

Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Der tierische Gewebeassay nutzt die Detektion von Kernszintillation, um die enzymatische Aktivität der Glykogensynthase zu bestimmen, indem der Einbau von radioaktiv markierter Glukose in Glykogen gemessen wird.

Radiochemische Bewertung der Aktivität von Glykogensynthase-Enzymen in tierischem Gewebe

Die Bauchhöhle bei Säugetieren enthält verschiedene Immunzellen Bevölkerung entscheidend für angeborenen Immunantwort. Eine effiziente Isolierung Methode ist für biochemische und funktionelle Analyse dieser Zellen erforderlich ist. Hier bieten wir eine umfassende Methode zur Isolierung von Bauchhöhle Zellen in der Maus.

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

Lernen Sie die Perjodsäure-Schiff-Färbung zur Visualisierung von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse des Kohlenhydratgehalts in Immunzellen aus menschlichem Blut.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Weitere Videos entdecken