Protokoll zur Untersuchung Extinction konditionierter Furcht in natürlich Radfahren weiblichen Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen von Gonadenhormonen auf das Angstauslöschungsverhalten bei Frauen während niedriger und hoher hormoneller Zustände des Esra-Zyklus und die Rolle von Östradiol bei exogener Verabreichung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Esra-Zyklus erwachsener weiblicher Ratten überwacht und vor dem Versuch identifiziert wird, in welcher Phase sie sich befinden. Als nächstes werden die Tiere, die sich in der Brunstphase befinden, in die ihnen zugewiesenen Kammern gebracht, um dort zu leben und Angst zu konditionieren.

Am nächsten Tag, wenn sich die Tiere in der Brunst befinden, werden die Weibchen mit Östradiol oder Vehikel injiziert und durchlaufen ein Angstauslöschungstraining. Am dritten Tag werden die Tiere schließlich wieder in dieselbe Kammer gebracht, um die Erinnerung an die Aussterbesitzung vom Vortag zu testen. Letztendlich ermöglicht der Vaginalabstrich zur Identifizierung von EST-Methoden den Forschern, die natürlichen Schwankungen der Gonadenhormone zu manipulieren, um ihren Einfluss auf das Gedächtnis der Angstauslöschung zu untersuchen.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Geschlechtsunterschiede zu beantworten, wie z.B. sind die Prozesse der Angstauslöschung bei Männern und Frauen unterschiedlich? Und wenn ja, was sind die hormonellen und neurobiologischen Mechanismen, die diesen Unterschieden begegnen? Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es dazu beitragen kann, die Erforschung der weiblichen Welt bei der Angstauslöschung zu fördern, indem Methoden dazu ausgetauscht werden.

neu in diesen Methoden sind, haben oft Schwierigkeiten, den Eser-Zyklus zuverlässig zu überwachen, da das Verfahren zeitaufwändig sein kann und stark von der richtigen Technik abhängt. Die Implikationen dieser Studien können zu geschlechtsspezifischen Behandlungsoptionen für Angst- und Angststörungen beitragen. Dies kann wichtig sein, da Frauen doppelt so häufig wie Männer an diesen Psychopathologien erkranken.

Lisa Man, Postdoc im Labor sowie Care Covert. Eine wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor zeigt das Verfahren zur Entnahme von Proben zur Überwachung des Brunstzyklus. Nachdem Sie eine 0,9%ige Kochsalzlösung hergestellt haben, tauchen Sie einen Applikator mit Wattespitze in die Flüssigkeit und tupfen Sie mit einem Papiertuch die Spitze der überschüssigen Lösung ab, halten Sie den Schwanz einer Ratte nach oben und achten Sie darauf, keinen Stress zu verursachen.

Führen Sie das Wattestäbchen vorsichtig nicht zu tief in den Vaginalkanal ein und rollen Sie es um die Wände, um lose Vaginalzellen einzufangen, bevor Sie schnell vorgehen. Entfernen Sie die Spitze, ohne zu viel Flüssigkeit zu übertragen, und rollen Sie die Applikatorspitze vorsichtig auf einen vorbeschrifteten Objektträger, um sicherzustellen, dass die Probe auf den Objektträger übertragen wird. Sammeln Sie Proben für mindestens zwei vollständige Zyklen und übertragen Sie mehrere aufeinanderfolgende Tage auf einen Objektträger, um die täglichen EST-Extras besser verfolgen und identifizieren zu können.

Sobald die Objektträger trocken sind, tauchen Sie sie 10 Mal in Fixiermittel und dann 10 Mal in Färbelösung. Und zum Schluss fünfmal in die Gegenfleckenlösung. Vorsichtig mit Wasser abspülen.

Lassen Sie die Objektträger vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie sie vor Beginn des Konditionierungsexperiments unter einem Mikroskop betrachten, und setzen Sie die Weibchen drei Tage lang 20 bis 30 Minuten pro Tag bei eingeschaltetem Hauslicht den Konditionierungskammern aus, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können. Weisen Sie die Box, in der sie vorbelichtet wurden, als Kammer für die Studie zu. Reinigen Sie die Boxen zwischen den Sitzungen und den Tieren gründlich, um Gerüche zu entfernen, da diese das Verhalten und den EST-Stresszyklus beeinträchtigen können.

Sobald überprüft wurde, dass sich die Tiere in der Brunstphase des EST-Extrazyklus befinden, beginnen Sie mit der Gewöhnungskonditionierungsphase. Nehmen Sie Pret-Tone-Basismessungen des Einfrierens vor dem ersten Tonbedingungsreiz vor, indem Sie die Sekunden messen, in denen das Tier während des Stimulus ein Handy verbringt. Berechnen Sie ohne Zeitintervall den prozentualen Einfrierungswert, indem Sie die Sekunde der Unbeweglichkeit durch die Dauer des Versuchs dividieren.

Um ein Extinktionstraining während der ME-Östrusphase durchzuführen, konditionieren Sie die Ratten an ihrem letzten Tag der ESTRO, wie durch Abstrich bestimmt. Setzen Sie die Tiere in die Konditionierungskammer und führen Sie einen CS-Alleingewöhnungsversuch durch. Induzieren Sie einen CS-Ton für 30 Sekunden.

Nachdem Sie durchschnittlich drei Minuten vor dem nächsten Versuch gewartet haben, wiederholen Sie den CS-Einzelversuch viermal für insgesamt fünf Versuche, bevor Sie mit der Konditionierung beginnen. Verbinden Sie den Fußschockgitterboden mit einem elektrischen Stimulationsgenerator. Verwenden Sie einen Stimulationspegel von 0,5 bis 0,6 Milliampere als unkonditionierten Stimulus oder US und einen Ton von vier Kilohertz 80 Dezibel als CS unmittelbar nach der Gewöhnungssitzung.

Beginnen Sie gepaarte CS-US-Versuche zur Angstkonditionierung, indem Sie einen 32. CS-Ton präsentieren, gefolgt von einem 0,5-sekündigen US-Schock, der durch ein etwa dreiminütiges Intervall zwischen den Versuchen unterbrochen wird. Wiederholen Sie den gepaarten Versuch am Ende der Konditionssitzung noch sechs weitere Male. Bringen Sie die Tiere bis zum nächsten Tag des zweiten Tages in ihre häuslichen Käfige und in die Tiereinrichtung zurück.

Nach dem Abstrich und der Identifizierung der ME-Östrusphase für alle Tiere, die den ersten Tag des Protokolls durchlaufen haben, bereiten Sie genügend Östradiol in Sesamöl oder 0,9 % Kochsalzlösung für jedes Tier vor, um eine Dosis von 15 Mikrogramm pro Kilogramm zu erhalten, um das Hormon subkutan zu verabreichen. Heben Sie die lose Haut zwischen den Schulterblättern am Hals in einem sanften Kneifen an und führen Sie die Spritze in das Dreieck ein, das durch die Hautfalten gebildet wird. 30 Minuten, nachdem die Tiere ihre Injektionen erhalten haben, legen Sie sie in die Konditionierungskammern und beginnen Sie mit dem Extinktionstraining, indem Sie allein 20 CS durchführen.

Die Versuche bestanden jeweils aus einem 32. Ton von vier Kilohertz und 80 Dezibel mit einem Abstand von etwa drei Minuten zwischen den Versuchen 24 Stunden später. Am dritten Tag werden die Tiere, die die Sitzungen an den Tagen eins und zwei abgeschlossen haben, abgestrichen, nachdem sie in die ihnen zugewiesenen Konditionierungskammern gebracht wurden. Beginnen Sie die Extinktionsrückrufsitzung, indem Sie nach Abschluss der Extinktionssitzung drei Cs-Versuche allein mit einem Abstand von etwa drei Minuten zwischen den Versuchen durchführen, bringen Sie die Tiere in ihre Heimatkäfige zurück und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll in diesem Angstauslöschungsprotokoll.

Tiere, die gut auslöschten und die Erinnerung an das Extinktionstraining behielten, zeigten am letzten Tag der Verhaltenstests während des Extinktionsrückrufs eine geringe Angst. Wie hier gezeigt, unterscheiden sich männliche und weibliche Ratten nicht signifikant in der konditionierten Angstexpression. Während jeder Phase wird ein Geschlechtsunterschied deutlich, wenn die Tiere getrennt als Phasengruppen mit hohem und niedrigem Östrogen-ES analysiert werden.

Dieses Diagramm zeigt die Wirkung der Östrophase auf das Angst-Extinktionsgedächtnis, weibliche Ratten, die während der Phase mit niedrigem Östrogengehalt des EST-Extrazyklus einem Extinktionstraining unterzogen wurden. Erinnern Sie sich nicht an das Extinktionsgedächtnis am dritten Tag sowie an diejenigen, die mit PROEs trainiert wurden. Wenn Metri-Weibchen jedoch vor der Extinktion subkutan mit einer Dosis von 15 Mikrogramm pro Kilogramm Östradiol injiziert werden, scheint die Lernkonsolidierung des Angst-Extinktionsgedächtnisses verbessert zu sein, wie das niedrige Einfrieren während des Extinktions-Recalls zeigt.

Daher deuten diese Daten darauf hin, dass gonadale Hormone die Erinnerung an die Angstauslöschung modulieren und auch geschlechtsspezifische Unterschiede im konditionierten Angstauslöschungsverhalten vermitteln können. Zusätzliche Eingriffe wie Kanülenoperationen und Immunhistochemie können in Verbindung mit der hier beschriebenen Methode durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Wo wirkt Östradiol im Gehirn, um Angst, Extinktion und Gedächtniskonsolidierung zu modulieren, und wie verändert Östradiol die neuronale Aktivität in diesen Regionen? Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie man natürliches Recycling weiblicher Ratten und den Einfluss von Östradiol auf eine klare Ex-Ausdehnung untersucht.