Name: Protokoll zur Untersuchung Extinction konditionierter Furcht in natürlich Radfahren weiblichen Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Extinktion konditionierter Furcht bei weiblichen Ratten untersuchen, indem Sie den Estrous-Zyklus überwachen und Estradiol verabreichen. Diese Methode erlaubt die Analyse hormoneller Einflüsse auf das Gedächtnis.

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Mohammed R. Milad wird durch das NIMH-Stipendium R01 MH097880 und institutionelle Mittel der Abteilung für Psychiatrie am MGH unterstützt.

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Unterausschuss für Forschung Tierpflege, die als Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) für das Massachusetts General Hospital dient zugelassen und sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien. 1. Tierhaltung und Handhabung Vorgehens <ol><li> Bei der Ankunft Haus erwachsenen Sprague-Dawley weiblichen Ratten etwa 8-10 Wochen alt (mit einem Gewicht von 200 bis 225 g) in Gruppen von 3-4 Zoll-Kunststoff-Behälter mit Rauhfaser Bettwäsche. Halten sie auf einer Ernährung ad libitum Zugang zu Futter und Wasser und einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Verlassen Ratten an die Haltungsbedingungen und Tiereinrichtung für mindestens 1 Woche akklimatisiert. HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Manuskript während des Lichtzyklus durchgeführt. </li><li> Nach dieser Eingewöhnungszeit, behandeln alle Tiere für 5 Minuten jeweils für 2-3 Tage. Richtig holen die Ratten ein zu einer Zeit (von der Oberkörper und nicht am Schwanz unterstützt),halten sie sicher und streicheln während dieser Zeit. Behandeln Tiere, die mehr gestresst, nervös, ängstlich oder für längere Zeit angezeigt. Tun Sie dies, um zu minimieren Umgang mit Stress, die die folgenden Schritte in diesem Protokoll beeinträchtigen könnten. HINWEIS: Die Anzahl der Tage, und die Menge an Zeit der Handhabung der Tiere können zwischen verschiedenen Labors zu variieren; Allerdings sollten diese im Einklang zwischen den Experimenten im selben Labor sein. </li></ol> 2. Überwachung des Zyklus: Vaginal Swab Verschmieren und Färbeverfahren <ol><li> Machen 0,9% Kochsalzlösung (in destilliertem Wasser gelöst, Natriumchlorid). Befeuchten Sie ein Wattestäbchen in dieser Lösung. Tupfen Sie die Spitze mit einem Papiertuch, um Übersättigung, was zu einer unzureichenden Probennahme oder den Verlust von Zellen führen können. Halten Sie das Heck nach oben weg von der Vagina, führen Sie den Wattestäbchen in den Vaginalkanal und rollen an den Wänden, um lose Vaginalzellen erfassen. </li><li> Wenn das Tier uriniert auf dem FeldbettTonnen-Spitze, zu ersetzen durch eine neue, wie Urin Kontamination wird es für die Phasenanalyse erschweren. Seien Sie besonders vorsichtig, um Qualen des Tieres bei diesem Verfahren nicht dazu führen, weil die Belastung durch Stress den Sexualzyklus zu unterbrechen. Wenn Abtupfen, zielen darauf ab, einen schnellen Einsetzen und Herausziehen, die nicht zu tief, dass zusätzliche Stimulation des Gebärmutterhalses, die Scheinträchtigkeit induzieren kann minimieren erzielen. HINWEIS: Pseudogravidität kann als azyklische Sexualzyklus, die in der Regel dauert etwa 12 Tage, dh aufeinander folgenden Tagen der Diöstrus 25 identifiziert werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Applikatorspitze und rollen sie auf eine vorge markierten Objektträger. Drücken Sie nicht zu hart als zu viel Flüssigkeit auf dem Objektträger kann Phasenidentifikation schwer, wenn trockene machen. HINWEIS: Eine Folie kann mehrere Tage für jedes Tier enthalten, obwohl dies kann den individuellen Wünschen entsprechend durchgeführt werden. </li><li> Sicherstellen, dass die Probentransfers auf die Folie. Die Proben werden für several aufeinander folgenden Tagen auf einer Folie, um eine bessere Übersicht und identifizieren täglich Östrus-Phasen ändert. HINWEIS: Wenn möglich, ist es ideal, wenn die Menschen, Sammeln von Proben gleich bleiben für alle Tiere. </li><li> Sobald die Schiene trocken ist, beginnen die Färbeprotokoll für Phase Identifikation. Mit dem Färbekit (siehe Tabelle der Materialien), tauchen Folien 10 Mal in der Fixiermittel (hellblau), 10 Mal in Färbelösung (pink) und 5 mal in Gegenfärbelösung (lila). Rinse gleitet sanft unter fließendem Wasser. Lassen Sie Folien vollständig an der Luft trocknen, bevor Betrachtung unter dem Mikroskop. HINWEIS: Die in der Regel 4-5 Tage lang Sexualzyklus besteht aus (in dieser Reihenfolge): Brunst (E), Metöstrus (M), Diöstrus (D), und Proöstrus (P) 26. Östrus durch blaue, verhornten Zellen Metöstrus von Leukozyten und einer Kombination von verhornten und kernhaltige Zellen gekennzeichnet ist Diöstrus ähnlich in Gegenwart von Zelltypen Metöstrus außer daß sie sehr schwach sind und Proöstrus von lila-gefärbten Zuschlagkernhaltiger Zellen (Abbildung 1). Es gibt verschiedene Färbeverfahren, zusätzlich zu den oben beschriebenen, die gleichermaßen wirksam Vaginalabstrich Zytologie sind. </li><li> Die Proben werden für mindestens zwei vollständige Zyklen (~ 8-10 Tage), um die Phasen genau vor dem Experiment zu überwachen. Im Einklang mit der Tageszeit die Proben entnommen werden. Sammeln Vaginalabstrich Proben täglich während und bis zum Ende des Experiments. </li></ol> 3. Pre-Exposition <ol><li> Vor dem Beginn des Experiments wurden die Tiere vorge aussetzen Konditionierungskammern, um den Tieren zu Rahmen (Konditionierkammern) vor jedem Verhaltenstests akklimatisieren. <ol><li> Pre-setzen die Frauen zu den Klimakammern (in schalldämpfenden Boxen befindet) mit den Haus Lichter an für 20-30 Minuten pro Tag für 3 Tage vor jedem Experiment. Weisen Sie das Feld sie vorbelichteten als ihre Kammer für das Studium sind. Gründlich reinigen ter Boxen (Wände und Böden) zwischen den Sitzungen und Tiere, um Gerüche zu entfernen, da sie das Verhalten und Sexualzyklus beeinflussen. </li></ol></li></ol> 4. Tag 1: Habituation / Angstkonditionierung <ol><li> Sobald die Tiere wurden überprüft, um in der Brunst Phase ihrer Ovarialzyklen sein, beginnen die Gewöhnung / Anlage Phase des 3-Tage-Experiment. <ol><li> Nehmen Sie vor dem Ton Basis Maßnahmen des Einfrierens vor dem ersten Ton bedingten Reiz (CS) Präsentationen an jedem Tag des Experiments. Tun Sie dies durch den Kauf Prozent Einfrieren Scores während der Stimulus-abwesend Zeitintervall zu Beginn der ersten CS-alone Prozess vor dem Beginn CS (durch Division der Sekunden bewegungslos verbracht um die Dauer der Studie, multipliziert mit 100 berechnet). HINWEIS: Diese Maßnahmen können verwendet werden, um zu beurteilen und zu vergleichen Baseline Gefrierpunkt Ebenen mit denen während der Gewöhnung, Anlage, Aussterben und Rückruf werden. </li><li> Zum Aussterben Ausbildung während der Metöstrus Phase durchzuführen,bedingen die Ratten in ihren letzten Tag des Östrus. Swab und identifizieren Östrus-Phase (Schritt 2) jeden Tag vor Beginn der Versuchsprotokoll (Anlage / Untergang / Recall). Wie der Brunst Phase kann länger als einen Tag dauern, Einsatzzyklus Geschichte Länge Phasen vorherzusagen, um festzustellen, wenn die Tiere sind bereit, Training zu beginnen. </li></ol></li><li> In den Klimakammern, schließen Sie das Fuß-Schock-Gitterboden mit einer elektrischen Stimulationsgenerator. Verwenden Sie einen Reizpegel von 0,5 bis 0,6 mA als unbedingten Reiz (USA). Verwenden Sie ein 4 kHz, 80 dB Ton als konditionierter Stimulus (CS). ANMERKUNG: Diese Parameter können in Laboratorien variieren und kann für eine optimale Anlage verändert werden. <ol><li> Wenn das Einfrieren-Analyseprogramm erfordert visuellen Hinweisen (im Gegensatz zu temporal), Co-Aktivierung eines LED-Licht mit dem Ton. Lichtposition auf der Außenseite der operKammer innerhalb des Videoframes. Zu Beginn jeder Studie, aktivieren Sie die LED-Licht und bewahren Sie es bis zum Ende des th beleuchtetE-Studie. HINWEIS: Dieses Licht ist nicht durch das Tier zu sehen und nur als Marker für die Einleitung und Ende des Prozesses innerhalb der aufgenommenen Videodateien dient (zu verwenden, um Gefrierverhalten zu messen). </li></ol></li><li> Legen Sie die Tiere in den Klimakammern für 5 CS-alone-Studien der Gewöhnung. Unmittelbar nach der Gewöhnungssitzung durchführen 7 gepaart CS-US-Studien der Angstkonditionierung. Stellen Sie sicher, dass die CS-Ton dauert 30 Sekunden und coterminates mit 0,5 s US Schock. Führen Sie Prüfungen in allen Sitzungen (Gewöhnung Anlage, Aussterben und Rückruf) mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 Minuten. </li><li> Am Ende des Konditionierungssitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige und auf die Tierhaltung bis zum nächsten Tag. </li></ol> 5. Tag 2: Estradiol Vorbereitung <ol><li> Swab und Identifizierung der Östrus-Phase für alle Tiere, die Tag 1 unterzog dieses Protokolls. Bereiten Estradiol (auch als E2, 17ß-Östradiol oder bekanntebeta-Estradiol) für eine 15 &amp; mgr; g / kg Dosis subkutan mit Sesamöl oder 0,9% Kochsalzlösung als Vehikel. </li><li> Um die Menge von Estradiol zu berechnen, um für Injektionszwecke zubereiten, verwenden Sie die Körpergewichte der Tiere, die gemessen und aufgezeichnet wurden, als sie am Tag 1 des Protokolls konditioniert wurden. </li><li> Machen Sie Berechnungen, um die verabreichte Volumen von Estradiol (dh 0,2 ml) pro Ratte zu standardisieren. Da Estradiol schwer zu lösen ist aufgrund seiner Wasserunlöslichkeit und erfordert ein großes Volumen an Lösungsmittel für die geringe Dosis, wird eine Stammlösung durch Mischen von Estradiol in Sesamöl über Hitze bis gelöst. Die Lösung kann dann durch ein 0,22 um-Filter geleitet werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Fügen Sie beispielsweise ein berechnetes Volumen einer 3,000 ug Estradiol / 1 ml Sesamöl Stammlösung auf die gesamte benötigte Menge Sesamöl, um eine 15 &amp; mgr; g / kg Dosis in einem 0,2 ml Injektionsvolumen pro Tier zu erzielen. Hinweis: Alternativ können Sie auch andere Formen der Östrogen tha<html> t wasserlöslich sind und leichter zu lösen. </li></ol> 6. Tag 2: Estradiol Verwaltung / Extinction Ausbildung <ol><li> Verwalten des Estradiol subkutan. Heben Sie die lose Haut zwischen den Schulterblattes durch den Hals in einer leichten Prise und legen Sie die Spritzennadel in das Dreieck, das von den Hautfalten gebildet wird. </li><li> 30 Minuten nach der subkutanen Injektion von Estradiol, legen Sie die Tiere in den Klimakammern wieder und beginnen Aussterben Ausbildung. In dieser Extinktion Sitzung auszuführen 20 CS-alone-Studien mit jedem Versuch, die aus einem 30 sec, 4 kHz, 80 dB-Ton, mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 min dargestellt. HINWEIS: Die Wirkung von Östradiol auf Rückruf erfolgt, wenn Östradiol vor der Ausrottung Training oder unmittelbar nach dem Aussterben verabreicht. Der Effekt wird nicht beobachtet, 4 Stunden nach der Auslöschung, so empfiehlt es sich, zu injizieren zeitnah zu Beginn oder am Ende der Trainingseinheit 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Tag 3: Extinction Recall <ol><li> 24 Stunden nach dem Aussterben Ausbildung, Tupfer, die Tiere, die Tag 1 und 2 dieses Protokolls abgeschlossen. </li><li> Legen Sie die Tiere in ihren zugewiesenen Klimakammern (identisch mit Day 1 und 2). Beginnen Sie mit dem Aussterben Rückruf-Sitzung durch die Vorlage 3 CS-alone-Studien (drei Studien des Aussterbens Rückruf), die wie in Schritt 6.2 beschrieben von nur 3,80 dB CS-alone Versuche mit intertrial Abständen ähnlich zu den 20 Studien für Aussterben Training verabreicht besteht. </li><li> Nach Abschluss der Rückruf Sitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige. </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Erwerben Verhaltensdaten durch Video und mit Computer-Software analysieren. HINWEIS: Einfrieren Partituren können auch manuell durch einen Experimentator, die blind für die medikamentöse Behandlung von Zeit Einfrieren Anfälle während der CS Präsentation der einzelnen Studie ist angerechnet werden, ausgedrückt als Prozentsatz der Zeit verbrachte Einfrieren während der Ton. Das Einfrieren istdurch vollständige Mangel an Bewegung, mit Ausnahme der Atmung während der 30 Sekunden CS-US-Studien definiert. Berechnen Prozent Einfrieren, indem man die Sekunden verbrachte Einfrieren (immobile) um 30 Sekunden (Dauer der Studie), multipliziert mit 100. </li></ol>

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Die Autoren des Manuskripts haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenlegen.

Angst Aussterben wurde ausgiebig bei männlichen Ratten mit den neuronalen Mechanismen der Vermittlung konditionierter Furcht Aussterben identifiziert und unter verschiedenen Manipulationen bewertet sucht. Relativ wenige Studien haben weiblichen Ratten oder die Rolle der Geschlechtshormone in Angst Aussterben sucht. Um die Wirkung von Östrogen auf Furchtextinktion speziell zu untersuchen, werden natürlich Radfahren weiblichen Ratten zu einem dreitägigen Verhaltensparadigma unterzogen. Dieses Verfahren besteht aus Gewöhnu...

Inherent Geschlechtsunterschiede sind in verschiedenen kognitiven Verhalten und Lernparadigmen bei Mensch und Nager beobachtet. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Frauen im Allgemeinen stärker verbalen und detailorientierten Fähigkeiten, während Männer haben eine bessere räumliche Fähigkeiten 1-3. Diese Geschlechtsunterschiede kann zum Teil auf den Einfluss der Geschlechtshormone sein. Hohe Estradiolspiegel verbessern die Leistung auf Aufgaben, in denen Frauen sind besser, aber verschlechtern Leistung auf Aufgaben, die Menschen in der Regel gut zu tun 4-6. Obwohl dieser Beweis ist überzeugend, macht die begrenzte Fähigkeit, Testumgebungen vollständige Kontrolle in Studien am Menschen es schwierig, festzustellen, ob diese Auswirkungen auf das Verhalten gezielt auf Hormone zurückzuführen. Tierexperimentelle Studien im Gegensatz dazu ermöglichen die vollständig kontrollierten Bedingungen. Obwohl die grundlegenden neuronalen Mechanismen der Angst Aussterben sind identifiziert worden und sind bei Männern untersucht, ist unklar, ob esDiese Systeme sind die gleichen bei Frauen und wie sie über die Sexualzyklus ändern. Furchtkonditionierung und das Aussterben sind weit verbreitet Verhaltensparadigmen bei Nagern und Menschen, um Studien zu Angststörungen im Zusammenhang durchzuführen. Da für Frauen haben ein höheres Risiko für Angststörungen sowie höhere Symptomdauer und Schwere 7-13, ist es kritisch, Weibchen in diesen Studien beinhalten. Die Unterrepräsentation von Frauen in dieser Studie kann auf die Herausforderungen der Östrus-Phasen-Überwachung und Bilanzierung der Auswirkungen auf das Verhalten von Sexualhormonen zurückzuführen. Labors, die untersuchen Frauen in dieser Hinsicht Begegnung Fragen, die oft nicht gemeldet oder nicht in den Verfahren zu ihrer Studien beschrieben tun. Anzeichen dafür, bei Nagern lässt vermuten, dass Geschlechtsunterschiede in der Angst Aussterben durch Gonadenhormone 14-18 moduliert. In Furchtkonditionierung werden Tiere darauf trainiert, einen bestimmten Reiz zu fürchten. Nach einer Anzahl von unverstärktem Präsentationender Reiz, die Tiere lernen, nicht das Stichwort, einen Prozess namens Aussterben fürchten. Wie gut das Tier lernt und konsolidiert die Erinnerung an das Lernen diese Aufgabe während einer Extinktion Recall Test gegeben einige Zeit nach dem Aussterben Training beobachten. Weniger Angst Expression während Aussterben Rückruf weist eine gute Auslöschung Gedächtniskonsolidierung. Neue Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass Östrogen kann die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu modulieren und zu verbessern Aussterben Rückruf. Insbesondere weiblichen Ratten, die in Proöstrus erlöschen, wird die Phase des Zyklus, in dem die zirkulierenden Östrogenspiegel Spitze, zeigen eine verbesserte Beibehaltung der vom Aussterben Speicher. Im Gegensatz dazu, Frauen, die in der Nieder Östrogen Metöstrus Phasenanzeige relativ schlechte Aussterben Rückruf gelöscht werden, die mit exogenen Estradiol Verwaltung vor oder unmittelbar nach dem Erlöschen Ausbildung 15,16 verbessert werden kann. Die neuronalen Mechanismen des Aussterbens Gedächtniskonsolidierung (inkluding die Rolle der Geschlechtshormone) bei Frauen sind nicht klar. Bei Labortieren kann die Rolle der Hormone mit invasive chirurgische Entfernung Verfahren wie die Kastration und Ovariektomie untersucht werden. Nach Erholung von der Operation, Gonadenhormone oft exogen während der Durchführung einer Verhaltensaufgabe 19 manipuliert. Dieser Ansatz hat wichtige Informationen über Geschlechtshormone zur Verfügung gestellt und ist nützlich, da es für die gut kontrollierte Manipulationen der Geschlechtshormone (in Bezug auf Timing und Dosis) 20-23. Dieser Ansatz ist jedoch nicht beurteilen, den Einfluss der natürlich auftretenden Schwankungen, die für die Östrus-Zyklus auftritt, noch stellen sie &quot;normal&quot; Tieren, wodurch die Translations Potential Humanstudien einschränkend. Es ist gut dokumentiert, dass weibliche Sexualhormon Ebenen Höhepunkt und Niedergang in bestimmten Phasen des Zyklus, und Östrogen-Rezeptor-Expression Änderungen innerhalb des Zyklus,und nach Entfernung der Eierstöcke 24. Daher besteht die Notwendigkeit, Studien über Frauen mit intakten Keimdrüsen zu führen und zu verfeinern, experimentelle Designs, um die Auswirkungen der hohen und niedrigen Östrogen-Staaten können auf Frauen während ihrer gesamten Lebensdauer haben sicher zu studieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Wirkung von Östrogen auf die neurobiologische Systeme in Angst Aussterben beteiligt. Es wird beschrieben, wie: 1) sorgfältig den Sexualzyklus zu überwachen, 2) vorzubereiten wirksamen Dosen von Estradiol zur systemischen Verabreichung, und 3) folgen einem Verhaltens Paradigma, das Furchtkonditionierung, Aussterben umfasst, und erinnern in natürlich Radfahren weiblichen Ratten. Dieses Protokoll kann mit anderen pharmakologischen Manipulationen und zellulären und molekularen Werkzeugen geändert werden, um Studien zu unterstützen, um geschlechtsspezifische Unterschiede, die in Klima beobachtet fürchten Löschverhalten besser zu verstehen. Man beachte, dass die nachstehend beschriebenen Verfahren sind auch in unserem Labor verwendet werden, und es gibt eine Anzahl von Variationen dieser Verfahren in in der Literatur.

<table><tbody><tr><td>Angst-Konditionierungskammer</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schalldämpfende Box</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>In Sesamöl zur subkutanen Injektion</td></tr><tr><td>Sesamöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tauchen Sie schnell ein Fleck</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-Zoll, steril</td></tr><tr><td>0,9 % Kochsalzlösung</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Natriumchlorid mit</td></tr><tr><td>Selectfrost Objektträgern</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>1:256 mit Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>Luer-Lok Spitze 1ml Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadeln Exelint</td><td>International, Co.</td><td>26402</td><td>26-Gauge</td></tr></tbody></table>

protokoll zur untersuchung extinction konditionierter furcht in natürlich radfahren weiblichen ratten

Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Extinction konditionierter Furcht wurde ausgiebig bei männlichen Nagetieren untersucht. Kürzlich gab es eine zunehmende Anzahl von Studien, die zeigen, dass neuronale Mechanismen einiger Verhaltens Aufgaben und Antwortverhalten bei Frauen und Männern unterschiedlich sind. Mit Frauen in Forschungsstudien kann eine Herausforderung wegen der Veränderung der Geschlechtshormone während ihres Sexualzyklus darstellen. Dieses Protokoll beschreibt gut etablierten Verfahren, die nützlich bei der Untersuchung der Rolle von Östrogen in Angst Aussterben Gedächtniskonsolidierung bei weiblichen Ratten sind. Phase des Zyklus und exogenen Östrogengabe vor dem Aussterben Training kann Aussterben Abruf 24 Stunden später zu beeinflussen. Die vaginale Abstrichtechnik zur Östrus hier beschriebenen Phasenidentifikation unterstützt die Untersuchung und Behandlung der natürlich Radfahren Gonadenhormone. Die Verwendung dieses Grundnagetiermodell kann weiter abzugrenzen, die Mechanismen, durch die Östrogen kann Angst Aussterben Speicher zu modulierenFrauen.

In diesem Furchtextinktion Rückruf-Protokoll wurde Prozent Einfrieren als Indikator für die Furcht gemessen. Tiere, die gut ausgelöscht und behielt die Erinnerung an die Auslöschung Ausbildung ausgestellt geringe Angst am letzten Tag des Verhaltenstests während Aussterben Rückruf. Männlichen und weiblichen Ratten nicht signifikant in konditionierter Furcht Ausdruck in der Anlage, vom Aussterben unterscheiden, und erinnern Phasen (Abbildung 2). Allerdings wird ein Geschlechtsunterschied deutlich, wenn di...

Gonadenhormone wie Östrogen modulieren die Gedächtnisbildung in einer Reihe von experimentellen Paradigmen, einschließlich des Angst-Extinktionsgedächtnisses. Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden zur Untersuchung des Einflusses von Gonadenhormonen speziell während der Extinktion bei natürlich zyklischen Weibchen, einschließlich der Überwachung des Östruszyklus und der exogenen Östrogenverabreichung.

Protokoll zur Untersuchung Extinction konditionierter Furcht in natürlich Radfahren weiblichen Ratten

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen von Gonadenhormonen auf das Angstauslöschungsverhalten bei Frauen während niedriger und hoher hormoneller Zustände des Esra-Zyklus und die Rolle von Östradiol bei exogener Verabreichung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Esra-Zyklus erwachsener weiblicher Ratten überwacht und vor dem Versuch identifiziert wird, in welcher Phase sie sich befinden. Als nächstes werden die Tiere, die sich in der Brunstphase befinden, in die ihnen zugewiesenen Kammern gebracht, um dort zu leben und Angst zu konditionieren.Am nächsten Tag, wenn sich die Tiere in der Brunst befinden, werden die Weibchen mit Östradiol oder Vehikel injiziert und durchlaufen ein Angstauslöschungstraining. Am dritten Tag werden die Tiere schließlich wieder in dieselbe Kammer gebracht, um die Erinnerung an die Aussterbesitzung vom Vortag zu testen. Letztendlich ermöglicht der Vaginalabstrich zur Identifizierung von EST-Methoden den Forschern, die natürlichen Schwankungen der Gonadenhormone zu manipulieren, um ihren Einfluss auf das Gedächtnis der Angstauslöschung zu untersuchen.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Geschlechtsunterschiede zu beantworten, wie z.B. sind die Prozesse der Angstauslöschung bei Männern und Frauen unterschiedlich? Und wenn ja, was sind die hormonellen und neurobiologischen Mechanismen, die diesen Unterschieden begegnen? Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es dazu beitragen kann, die Erforschung der weiblichen Welt bei der Angstauslöschung zu fördern, indem Methoden dazu ausgetauscht werden.Forscher, die neu in diesen Methoden sind, haben oft Schwierigkeiten, den Eser-Zyklus zuverlässig zu überwachen, da das Verfahren zeitaufwändig sein kann und stark von der richtigen Technik abhängt. Die Implikationen dieser Studien können zu geschlechtsspezifischen Behandlungsoptionen für Angst- und Angststörungen beitragen. Dies kann wichtig sein, da Frauen doppelt so häufig wie Männer an diesen Psychopathologien erkranken.Lisa Man, Postdoc im Labor sowie Care Covert. Eine wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor zeigt das Verfahren zur Entnahme von Proben zur Überwachung des Brunstzyklus. Nachdem Sie eine 0,9%ige Kochsalzlösung hergestellt haben, tauchen Sie einen Applikator mit Wattespitze in die Flüssigkeit und tupfen Sie mit einem Papiertuch die Spitze der überschüssigen Lösung ab, halten Sie den Schwanz einer Ratte nach oben und achten Sie darauf, keinen Stress zu verursachen.Führen Sie das Wattestäbchen vorsichtig nicht zu tief in den Vaginalkanal ein und rollen Sie es um die Wände, um lose Vaginalzellen einzufangen, bevor Sie schnell vorgehen. Entfernen Sie die Spitze, ohne zu viel Flüssigkeit zu übertragen, und rollen Sie die Applikatorspitze vorsichtig auf einen vorbeschrifteten Objektträger, um sicherzustellen, dass die Probe auf den Objektträger übertragen wird. Sammeln Sie Proben für mindestens zwei vollständige Zyklen und übertragen Sie mehrere aufeinanderfolgende Tage auf einen Objektträger, um die täglichen EST-Extras besser verfolgen und identifizieren zu können.Sobald die Objektträger trocken sind, tauchen Sie sie 10 Mal in Fixiermittel und dann 10 Mal in Färbelösung. Und zum Schluss fünfmal in die Gegenfleckenlösung. Vorsichtig mit Wasser abspülen.Lassen Sie die Objektträger vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie sie vor Beginn des Konditionierungsexperiments unter einem Mikroskop betrachten, und setzen Sie die Weibchen drei Tage lang 20 bis 30 Minuten pro Tag bei eingeschaltetem Hauslicht den Konditionierungskammern aus, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können. Weisen Sie die Box, in der sie vorbelichtet wurden, als Kammer für die Studie zu. Reinigen Sie die Boxen zwischen den Sitzungen und den Tieren gründlich, um Gerüche zu entfernen, da diese das Verhalten und den EST-Stresszyklus beeinträchtigen können.Sobald überprüft wurde, dass sich die Tiere in der Brunstphase des EST-Extrazyklus befinden, beginnen Sie mit der Gewöhnungskonditionierungsphase. Nehmen Sie Pret-Tone-Basismessungen des Einfrierens vor dem ersten Tonbedingungsreiz vor, indem Sie die Sekunden messen, in denen das Tier während des Stimulus ein Handy verbringt. Berechnen Sie ohne Zeitintervall den prozentualen Einfrierungswert, indem Sie die Sekunde der Unbeweglichkeit durch die Dauer des Versuchs dividieren.Um ein Extinktionstraining während der ME-Östrusphase durchzuführen, konditionieren Sie die Ratten an ihrem letzten Tag der ESTRO, wie durch Abstrich bestimmt. Setzen Sie die Tiere in die Konditionierungskammer und führen Sie einen CS-Alleingewöhnungsversuch durch. Induzieren Sie einen CS-Ton für 30 Sekunden.Nachdem Sie durchschnittlich drei Minuten vor dem nächsten Versuch gewartet haben, wiederholen Sie den CS-Einzelversuch viermal für insgesamt fünf Versuche, bevor Sie mit der Konditionierung beginnen. Verbinden Sie den Fußschockgitterboden mit einem elektrischen Stimulationsgenerator. Verwenden Sie einen Stimulationspegel von 0,5 bis 0,6 Milliampere als unkonditionierten Stimulus oder US und einen Ton von vier Kilohertz 80 Dezibel als CS unmittelbar nach der Gewöhnungssitzung.Beginnen Sie gepaarte CS-US-Versuche zur Angstkonditionierung, indem Sie einen 32. CS-Ton präsentieren, gefolgt von einem 0,5-sekündigen US-Schock, der durch ein etwa dreiminütiges Intervall zwischen den Versuchen unterbrochen wird. Wiederholen Sie den gepaarten Versuch am Ende der Konditionssitzung noch sechs weitere Male. Bringen Sie die Tiere bis zum nächsten Tag des zweiten Tages in ihre häuslichen Käfige und in die Tiereinrichtung zurück.Nach dem Abstrich und der Identifizierung der ME-Östrusphase für alle Tiere, die den ersten Tag des Protokolls durchlaufen haben, bereiten Sie genügend Östradiol in Sesamöl oder 0,9 % Kochsalzlösung für jedes Tier vor, um eine Dosis von 15 Mikrogramm pro Kilogramm zu erhalten, um das Hormon subkutan zu verabreichen. Heben Sie die lose Haut zwischen den Schulterblättern am Hals in einem sanften Kneifen an und führen Sie die Spritze in das Dreieck ein, das durch die Hautfalten gebildet wird. 30 Minuten, nachdem die Tiere ihre Injektionen erhalten haben, legen Sie sie in die Konditionierungskammern und beginnen Sie mit dem Extinktionstraining, indem Sie allein 20 CS durchführen.Die Versuche bestanden jeweils aus einem 32. Ton von vier Kilohertz und 80 Dezibel mit einem Abstand von etwa drei Minuten zwischen den Versuchen 24 Stunden später. Am dritten Tag werden die Tiere, die die Sitzungen an den Tagen eins und zwei abgeschlossen haben, abgestrichen, nachdem sie in die ihnen zugewiesenen Konditionierungskammern gebracht wurden. Beginnen Sie die Extinktionsrückrufsitzung, indem Sie nach Abschluss der Extinktionssitzung drei Cs-Versuche allein mit einem Abstand von etwa drei Minuten zwischen den Versuchen durchführen, bringen Sie die Tiere in ihre Heimatkäfige zurück und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll in diesem Angstauslöschungsprotokoll.Tiere, die gut auslöschten und die Erinnerung an das Extinktionstraining behielten, zeigten am letzten Tag der Verhaltenstests während des Extinktionsrückrufs eine geringe Angst. Wie hier gezeigt, unterscheiden sich männliche und weibliche Ratten nicht signifikant in der konditionierten Angstexpression. Während jeder Phase wird ein Geschlechtsunterschied deutlich, wenn die Tiere getrennt als Phasengruppen mit hohem und niedrigem Östrogen-ES analysiert werden.Dieses Diagramm zeigt die Wirkung der Östrophase auf das Angst-Extinktionsgedächtnis, weibliche Ratten, die während der Phase mit niedrigem Östrogengehalt des EST-Extrazyklus einem Extinktionstraining unterzogen wurden. Erinnern Sie sich nicht an das Extinktionsgedächtnis am dritten Tag sowie an diejenigen, die mit PROEs trainiert wurden. Wenn Metri-Weibchen jedoch vor der Extinktion subkutan mit einer Dosis von 15 Mikrogramm pro Kilogramm Östradiol injiziert werden, scheint die Lernkonsolidierung des Angst-Extinktionsgedächtnisses verbessert zu sein, wie das niedrige Einfrieren während des Extinktions-Recalls zeigt.Daher deuten diese Daten darauf hin, dass gonadale Hormone die Erinnerung an die Angstauslöschung modulieren und auch geschlechtsspezifische Unterschiede im konditionierten Angstauslöschungsverhalten vermitteln können. Zusätzliche Eingriffe wie Kanülenoperationen und Immunhistochemie können in Verbindung mit der hier beschriebenen Methode durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Wo wirkt Östradiol im Gehirn, um Angst, Extinktion und Gedächtniskonsolidierung zu modulieren, und wie verändert Östradiol die neuronale Aktivität in diesen Regionen? Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie man natürliches Recycling weiblicher Ratten und den Einfluss von Östradiol auf eine klare Ex-Ausdehnung untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Tiermodelle der Rückfall, als Wiedereinsetzung Verfahren bekannt ist, wurden intensiv auf die Rolle von Stress in Rückfall in Drogen sucht Studie verwendet. Hier berichten wir über ein Verfahren zur Induktion der Wiedereinsetzung von Kokain suchen in Laborratten über akute Expositionen zu mild, intermittierenden elektrischen Fußschock.

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

Konditionierten Furcht kann durch eine inhibitorische Prozess namens Extinktion vermindert werden, kann aber wieder auftauchen unter Bedingungen wie im Verlauf der Zeit oder durch Einwirkung von Stress. Unser Protokoll stellt eine neuartige Methode zur Verhinderung Angst Rückgewinnung durch Einführen Extinktion während der Rückverfestigung Fenster (die Umlagerung Phase eines reaktivierten Memory).

Extinction Training Während der Rückverfestigung Fenster Verhindert Recovery-of Fear

Quelle: Childs, J. E., et al. Vagusnervstimulation als Werkzeug zur Induktion von Plastizität in Bahnen, die für das Extinktionslernen relevant sind. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Methode der Vagusnervstimulation (VNS) in einem Rattenmodell, um das Einfrierverhalten zu reduzieren. Angstkonditionierte Ratten erhalten VNS während der erneuten Schallexposition, was zu einem verringerten Einfrieren führt und sein therapeutisches Potenzial offenbart.

Vagusnervstimulation im Rattenmodell zur Reduzierung des Einfrierverhaltens

Im folgenden Experiment beschreiben wir ein Protokoll für die Spurenangstkonditionierung bei Mäusen. Diese Art des assoziativen Speicher eine Spur, die die Zeit und die neutralen Reiz unbedingten Reiz trennt.

Trace Angstkonditionierung bei Mäusen

Vagusnervstimulation (VNS) hat sich als Instrument zur zielgerichteten synaptischen Plastizität im Vorderhirn zu veranlassen, eine Reihe von Verhaltensweisen ändern entstanden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Umsetzung VNS, um die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu erleichtern.

Vagusnervstimulation als Instrument zur Plastizität in Pathways Relevant für Extinction Learning herbei

Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik für Stress erhöhter Angst lernen (SEFL), einem präklinischen Modell der posttraumatischen Belastungsstörung bei Ratten und Mäusen Experimente erforderlich. Das Modell nutzt Aspekte der Angst Pawlowsche Konditionierung und als Index der erhöhte Angst bei Nagetieren einfrieren.

Stress verstärkt Angst lernen, ein stabiles Nagetier Modell der posttraumatischen Belastungsstörung

Wir beschreiben ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten Übertraining und Angstinkubation erzeugt. Dieses Protokoll beinhaltet eine einzige Trainingseinheit mit 25 Ton-Schock-Paarungen (d. h. Übertraining) und einen Vergleich der konditionierten Gefrierreaktionen während der Kontext- und Cue-Tests 48 h (kurzfristig) und 6 Wochen (langfristig) nach dem Training.

Angst-Inkubation mit einem erweiterten Angst-Konditionierungsprotokoll für Ratten

Defensive Verhaltensreaktionen sind abhängig von Bedrohungsintensität, Nähe und Kontext der Exposition. Basierend auf diesen Faktoren haben wir ein klassisches Konditionierungsparadigma entwickelt, das klare Übergänge zwischen konditioniertem Einfrieren und Flugverhalten innerhalb einzelner Subjekte hervorruft. Dieses Modell ist entscheidend für das Verständnis der Pathologien, die an Angstzuständen, Panik und posttraumatischen Belastungsstörungen beteiligt sind.

Ein neuartiges Pavlovian Fear Conditioning Paradigma zur Untersuchung von Einfrieren und Flugverhalten

Um das Flugverhalten in einem ängstlichen Kontext zu untersuchen, führen wir ein modifiziertes Angstkonditionierungsprotokoll ein. Dieses Protokoll stellt sicher, dass Mäuse während der Signalpräsentation in der Angstkonditionierung konsistent Flugverhalten zeigen.

Modifizierte Angstkonditionierung zur Induktion von Fluchtverhalten bei Mäusen

Das beobachtende Angstparadigma bewertet das stellvertretende Einfrieren bei Nagetieren als Modell für affektive Empathie. Bei diesem Verfahren werden Beobachter-Nagetiere Artgenossen ausgesetzt, die aversive Fußschocks erhalten, um empathische Erstarrungsreaktionen hervorzurufen. Durch den Einsatz von Angstbeobachtungstests können Forscher die neuronalen Mechanismen untersuchen, die der affektiven Empathie zugrunde liegen.

Beobachtende Angst als Modell affektiver Empathie bei Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie die Extinktion konditionierter Furcht bei weiblichen Ratten untersuchen, indem Sie den Estrous-Zyklus überwachen und Estradiol verabreichen. Diese Methode erlaubt die Analyse hormoneller Einflüsse auf das Gedächtnis.

Protokoll zur Untersuchung Extinction konditionierter Furcht in natürlich Radfahren weiblichen Ratten

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