Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Gewinnung von primären murinen, mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns oder MBX. Dies wird erreicht, indem zunächst die meningenfreien Vorderhirne adulter Mäuse isoliert und dann homogenisiert werden. Im zweiten Schritt wird das Gewebehomogenat durch enzymatischen Aufschluss weiterverarbeitet.

Im letzten Schritt werden die Endothelzellen dann durch Dichte, Gradient und Zentrifugation getrennt und für die Zellkultur plattiert. Letztendlich kann die Immunfluoreszenzfärbung der isolierten Zellen für die CD 31-Expression verwendet werden, um die Reinheit der MB mech-Kultur zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden, wie der Verwendung von immortalisierten Gehirn- und Endothelzelllinien, besteht darin, dass die mit Primärzellen erzielten Ergebnisse eine bessere Übertragbarkeit auf die in vivo-Situation bieten.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranken-Suche zu beantworten, zum Beispiel, welche Signalwege am Denken von Immunzellen beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von neurovaskulären, infektiösen, entzündlichen oder degenerativen Erkrankungen des Zentralnervensystems. Denn eine Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke ist entscheidend am Erreger solcher Krankheiten beteiligt.

Dieses Verfahren wird von Lisa Eeping, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Nach der Isolierung der Gehirne von zehn acht bis zwölf Wochen alten C 57 BL lagern sechs Mäuse das Gewebe in fünf Millilitern sterilem PBS. Verwenden Sie als Nächstes eine Pinzette, um die Hirnstämme, das Kleinhirn und die Thalami zu entfernen, und rollen Sie dann jedes Gehirn vorsichtig auf sterilem Löschpapier.

Um die Hirnhäute zu entfernen, poolen Sie das Gehirn in einem 50-Milliliter-Falkenröhrchen und fügen Sie 13,5 Milliliter DM em hinzu, dann zerkleinern Sie das Gewebe zuerst mit einer 25-Milliliter-Pipette und dann mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis das Medium milchig wird. Verdauen Sie das Gewebe in Kollagenase und DNA bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 180 U/min. Nach einer Stunde geben Sie 10 Milliliter DM em in die Gewebesuspension und zentrifugieren die Zellen 10 Minuten lang bei 1000 G und vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, das lose Pellet nicht zu stören, und verwenden Sie dann eine 25-Milliliter-Pipette, um das Pellet etwa 25 Mal in 25 Milliliter B-S-A-D-M-E-M zu häuten. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, verwenden Sie eine Glaspipette mit großem Durchmesser, um die milchige obere Myelinschicht zu entfernen. Entfernen Sie dann die BSA-Schicht mit einem normalen PE oder einer Pipette.

Resuspendieren Sie das Pellet in neun Millilitern DM em und fügen Sie dann einen Milliliter Kollagenase-Scheibenraum und 0,1 Milliliter DNA zu den Zellen hinzu. Die Lösung bei 37 Grad Celsius auf dem Orbitalschüttler bei 180 U/min verdauen. Während des Aufschlusses wird in einer Ultrazentrifuge ein Perca-Dichtegradient aufgebaut.

Nach einer Stunde fügen Sie der verdauten Zellsuspension 10 Milliliter DM E em hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und drehen Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie in zwei Millilitern DM E em die Zellsuspension vorsichtig auf den Pro-Anruf-Gradienten und trennen Sie dann die Zellen durch Zentrifugation. Nach der Trennung können die Zellen als trübe Grenzfläche sichtbar sein. Tauchen Sie die sterile Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30 Grad in die Grenzfläche ein und sammeln Sie etwa 12 Milliliter der Lösung.

Die Grenzfläche ist oft nicht sichtbar, um so viele Zellen mit möglichst wenig Kontamination zu erhalten. Ein kleiner Teil der Grenzfläche sollte abgesaugt werden. Darüber hinaus sollte die Spitze der sterilen Nadel vorsichtig und kontinuierlich zu jedem Teil der Grenzfläche bewegt werden. Übertragen Sie die Zellen in einen neuen 50-Milliliter-Falcon, der fünf Milliliter DM em enthält, und dann, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, reus, suspendieren Sie den Gaumen in 0,2 Milliliter Endothelzellmedium pro Quadratzentimeter Oberfläche einer Zellkulturplatte.

Entfernen Sie anschließend die Beschichtungslösung von beschichteten Zellkulturplatten und spülen Sie jede Vertiefung in zwei aufeinanderfolgenden Waschschritten mit sterilem PBS aus. Halten Sie schließlich die Zellkulturen in Endothelzellmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem sterilen Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage unmittelbar nach der Isolierung.

Maus-BM e und kontaminierende Zellen bilden Konglomerate, die in der Zellkultur schwimmend beobachtet werden können. Die Behandlung mit Mycin führt zur Selektion von muriner BMAX, da kontaminierende Zellen viel anfälliger für reine Mycin-vermittelte Zytotoxizität sind und das nicht betroffene BM E beginnt, sich bis zum fünften Tag an die vier mit Fibronektin beschichteten Zellkulturplatten an das Kollagen zu binden, die BME proliferieren auf eine Dichte von etwa 80 bis 90% und bilden eine Monoschicht aus dicht gepackten, longitudinal ausgerichtete und nicht überlappende kontaktgehemmte Zellen, die durch puram Mycin-Selektion durch ihr typisches spindelförmiges Aussehen gekennzeichnet sind, Es wird eine hohe Reinheit von bis zu 99%muriner BMAX erreicht, wie der Endothelzellmarker CD 31 bestätigt. Die BM E bilden dicht verschlossene Monoschichten, die durch Tight-Junction-Proteine miteinander verbunden sind.

Nach sieben bis acht Tagen Kultivierung bilden diese Zellschichten stabile Werte für den elektrischen Widerstand zwischen 20 und 30 Ohm mal Quadratzentimeter und eine stattliche Kapazität. Zu diesem Zeitpunkt können funktionelle Assays wie Zellmigrationsexperimente oder Permeabilitätstests mit Evans-Blau oder Dextran durchgeführt werden. Diese Technik kann in vier bis fünf Stunden nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Andere Methoden wie Migrationsassays, Permeabilitätsexperimente oder elektrophysiologische Messungen können durchgeführt werden, um visionäre Fragen zu beantworten, z.B. wie sich der Transport von Immunzellen unter bestimmten experimentellen Bedingungen verändert?

Oder wie sind Eisenkanäle an der Regulation der Blut-Hirn-Schranke beteiligt? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Urin und mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns durch mechanische Homogenisierung, Enzymatik, Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden.