Name: Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung primärer muriner Gehirn-mikrovaskulärer Endothelzellen für Blut-Hirn-Schranken-Forschung. Diese Methode liefert hochreine Kulturen für funktionelle Assays und physiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, Cells-in-Motion-Exzellenzcluster (EXC 1003 - CIM), Universität Münster (SB und SGM) und von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 SB und SGM). Wir danken Heike Blum für die hervorragenden Abbildungen.

Gemäß dem deutschen Recht des Tierschutzes und dirigierte Alle Tierversuche wurden von den lokalen Behörden (&quot;;; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz Recklinghausen, Deutschland LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW&quot;) zugelassen. 1. Allgemeine Anmerkungen für Mouse Experimente <ol><li> Führen Sie alle Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen Institutional Animal Care und Use Committee. </li><li> Halten Sie die Mäuse unter keimfreien Bedingungen und es ihnen ermöglichen, den Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum haben. </li><li> Verwenden Alter und Geschlecht abgestimmt Mäusen der experimentellen Gruppen, weil biologischen Eigenschaften können mit dem Alter und Geschlecht variieren. </li><li> Wann immer möglich versuchen, zu reduzieren, zu verfeinern oder ersetzen Tierversuche. </li></ol> 2. Herstellung des Percoll Gradient <ol><li> Mischungs 19 ml 1x PBS mit 1 ml 10-fach PBS, 1 ml FCS und 10 ml Percoll. </li><li> Führen steGiften Filtration in ein Glasrohr (Durchmesser der Filterporen: 0,2 um). Danach speichern die Lösung bei 4 ° C. </li></ol> 3. Herstellung von Endothel Zellmedium und Beschichtung von Zellkulturplatten <ol><li> Endothelzellmedium: <ol><li> Herstellung von 500 ml Medium (. Ca. 20%) 400 ml mischen DMEM-Medium (. Ca. 80%) mit 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 &amp; mgr; g / ml; ca. 0,05%), 0,5 ml Heparin (100 &amp; mgr; l / ml;. ca. 0,1%) und 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. ca. 0,1%). Pyrumycin fügen nur in den ersten 2 Tagen Kultur verwendete Zellkulturmedium. </li><li> Zuführen Sterilfiltration in ein Glasrohr (Durchmesser der Filterporen: 0,2 um). Danach speichern die Lösung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Beschichtung von Zellkulturplatten: <ol><li> 1 ml der Beschichtungslösung, eine Lösung aus 500 &amp; mgr; l ddH 2 O, 400 ul Kollagen IV (0,4 mg / ml) und 100 ul Fibronectin (0,1 mg / ml). </li><li> Decken Sie die ganze Oberfläche des EACh Vertiefung der Zellkulturplatte mit der Beschichtungslösung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung von murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (MBMEC) <ol><li> Opfern 10 erwachsenen Mäusen (8. - 12. Wochen alten C57BL / 6), durch zervikale Dislokation. Anschließend isolieren die Maus-Gehirne und Speicher in 5 ml PBS (Caveat: Arbeits steril). </li><li> Entfernen Gehirn stammt, Kleinhirne und thalami mit einer Pinzette. Trennen Hirnhäute durch vorsichtiges Aufrollen die Gehirne auf einem sterilen Löschpapier. Sammeln Sie die resultierende Hirnhäute freien Vorderhirne. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne in ein 50 ml Falcon-Röhrchen mit 13,5 ml DMEM gefüllt. </li><li> Hackfleisch das Gewebe zuerst mit einer 25 ml Pipette und dann mit einer 10 ml Pipette bis das Medium wird milchig. </li><li> Dann verdauen das Gewebe mit einer Mischung aus 0,6 ml Kollagenase CLS2 (10 mg / ml in DMEM) und 0,2 ml DNAse (1 mg / ml in PBS) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) für 1 h bei 37 ° C auf einem Orbital schüttelnr bei 180 rpm. </li><li> 10 ml DMEM zur Gewebesuspension zugegeben und zentrifugiert, die Zellen bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen (Caveat: Pellet wird leicht zu verlieren) </li><li> Um das Myelin bei 1.000 × g für 20 min bei 4 ° C entfernt, das Pellet mit einer 25 ml Pipette in 25 ml BSA-DMEM (20% w / v) (ca. 25 Mal), und zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie die obere Myelinschicht (milchig) mit einem gebrochenen Glaspasteurpipette mit größerem Durchmesser, und dann werfen Sie die BSA-Schicht mit einer normalen Pasteurpipette. </li><li> Das Pellet in 9 ml DMEM und 1 ml Kollagenase / Dispase (Endkonzentration 1 mg / ml) und 0,1 ml DNAse. Verdauen die Lösung für 1 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler bei 180 rpm (Einschränkung: verwenden Sie nicht die Pipette resuspendieren - Zellen können verloren gehen). </li><li> Während der Verdauung, zentrifugieren Sie das Percoll Lösung bei 3.000 × g für 1 h Einrichten des Dichtegradienten mit einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C, mit einer Beschleunigung, wiThout Bremse. </li><li> 10 ml DMEM zu der verdauten Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1000 g für 10 min bei 4 ° C. Dann den Überstand verwerfen und das Pellet in 2 ml DMEM. </li><li> Fügen die resuspendierten Zellen vorsichtig auf der Oberseite des Percoll-Gradienten und Zentrifuge bei 700 × g für 10 min bei 4 ° C ohne Beschleunigung und Bremse. Anmerkung: Die Zellen als Wolke in der Interphase sichtbar sind. </li><li> Nehmen ca. 12 ml der Zwischenphase mit Zellen mit einer langen sterilen Nadel und legen Sie sie in eine neue 50 ml Falcon mit 5 ml DMEM. </li><li> Zentrifugieren der Zellen erneut bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Anschließend das Pellet in endothelialen Zellmedium (Verwendung ca. 0,2 ml Medium pro 1 cm 2 Oberfläche der Zellkulturplatte). </li><li> Entfernen Beschichtungslösung aus beschichteten Zellkulturplatten (siehe Schritt 3.2) und spülen Sie jedes gut mit sterilem PBS in zwei aufeinander folgenden Waschschritte. </li><li> Pflegen Zellkulturen in EndothelzellenZellmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem sterilen Inkubator. Ändern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Split-Zellen bei 90% Konfluenz. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Blut-Hirn-Schrankenstörung ist ein Markenzeichen von verschiedenen schädlichen ZNS-Erkrankungen, zB ein Ausfall der BBB bei Multipler Sklerose ausgiebig erleichtert die CNS Invasion durch autoreaktive Immunzellen und ermöglicht die Begegnung und Zerstörung der Oligodendrozyten. Bei ischämischen Schlaganfall die Störung der BHS und die anschließende Bildung von Hirnödem sind kritische Faktoren, die sekundäre Infarktwachstum und die Gesamtüberlebenszeit der Patienten 6 zu beeinflussen. Darüber hinaus kann durch Veränderungen der BBB in abgelegenen Gebieten fokalen ischämischen Läsionen sind in der Lage, weit verbreiteten funktionellen Veränderungen des Gehirns induzieren. Allerdings sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt 5. Im Gegensatz dazu die hohe Dichte und Vielfalt der Efflux-Transporter in der funktionellen BMECs reduziert die Konzentration von nützlichen Medikamente wie Chemotherapeutika für die Hirnmalignome oder Antibiotika für Infektionskrankheiten. Daher kann ein tieferes Verständnis der Blut-Hirn-barrier Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erforderlich ist, um pharmakologische Mittel, die in der Lage, spezifisch die Sperrfunktion in der favorisierten Richtung 21 zu entwickeln. Zuverlässig in vitro-Modellen der BHS sind unverzichtbare Werkzeuge, um die Regulationsmechanismen auf BBB studieren. Viele verewigt Gehirn endothelialen Zelllinien wurden eingerichtet und als in vitro-BBB-Modelle 22 eingesetzt. Diese Zelllinien bieten gewisse Vorteile gegenüber Primär BMECs da sie schneller wachsen und bestimmte BBB Eigenschaften halten über mehrere Passagen. Jedoch kann Endothelzelllinien nicht vollständig ersetzen Primärzellen als wichtige Eigenschaften verändert werden, die mit der Übertragbarkeit der Versuchsergebnisse auf die in vivo-Situation zu vermischen. Zum Beispiel die murine Hirn Endothelzelllinie bEnd.5 drückt nur geringe diskontinuierlich verteilten tight junction-Proteine, was zu hohen Paraczellulären Permeabilität 23. BEnd.3, ein weiteres häufig verwendeten murinen Gehirn Endothelzelllinie zeigt dichte und kontinuierliche verteilt tight junctions, eine hohe transendotheliale Widerstand, mehrere Effluxtransporter und niedrige parazellulären Permeabilität. Allerdings bEnd.3 Zellschichten im Vergleich zu Primär BMECs fehlt eine echte Diskriminierung in Bezug auf die Permeation von bestimmten transzellulären und parazellulären Substraten 24. In Zubereitungen von primären Zellkulturen, können kontaminierenden Zellen signifikant mit der Gültigkeit der experimentellen Befunde stören. In dem beschriebenen Protokoll wird pyrumicin als selektives Agens verwendet für Endothelzellen hohe Reinheit zu erreichen. Trotzdem ist eine regelmäßige Kontrolle der Qualität der Zellkultur zwangsläufig erforderlich, um für eine zuverlässige Experimenten zu gewährleisten. Es gibt mehrere Verfahren für die Qualitätskontrolle, neben typischen morphologischen Eigenschaften von Endothelzellen (siehe 1A), der transendothelial Widerstand gemessen werden kann oder die Expression des endothelialen Zellmarker, wie CD31 (siehe 1B) und von Willebrand-Faktor (vWF) kann ausgewertet werden. Die Zahl der Gehirn-Endothelzellen aus einer Mausgehirn isoliert ist relativ gering und für mehrere Versuche zu diesem Zweck eine Zellkultur, haben die Gehirne von mehreren Mäusen gepoolt werden. In unserer Erfahrung, müssen mindestens 10 Mäuse für einen Versuch, die abhängig von den Ressourcen der jeweiligen Tiereinrichtung ein begrenzender Faktor sein könnte verwendet werden. Um Bias oder Störfaktoren zu vermeiden, sollte nur Mäuse mit einer identischen genetischen und ökologischen Hintergrund gebündelt. Im Gegensatz dazu Rinder- und Schweinehirn Endothelzellen Präparate bieten eine große Anzahl von Gehirnendothelzellen in einem Gehirn. Doch neben der unkomplizierten Zucht und Gehäuse, der breite und ständig wachsenden Repertoire an verfügbaren transgenen Mäusen macht primären murinen BMECs als idealeModell zur Blut-Hirn-Schrankenfunktion zu untersuchen. Mehrere wichtige Erkenntnisse über die Funktionen der BBB und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wurden aus Studien mit 2D Gewebekultursystemen kommen. Kürzlich, 3D-Kultursysteme entwickelt worden 25, wobei Endothelzellen in eine Collagenmatrix damit sie Lumen und Rohrnetze bilden gelegt. Diese neue Zellkultursysteme erlauben eine noch genauere Reproduktion des Gefäßprozessen im intakten Organismus in vivo. Die Einbindung weiterer Zellen der NVU in 3D-Zellkultursystemen, wie Perizyten und Astrozyten könnte revolutionieren die in vitro-Studium der Blut-Hirn-Schrankenfunktion; ersten Modelle wurden erst kürzlich entwickelt 26. Es gibt einige Empfehlungen für die Problembehandlung. Zunächst sterilen Arbeits ist wesentlich für die Qualität des Endothelzellenkultur. Zweitens sollte pyrumycin nur für Zelle hinzugefügt werdenin den ersten 2 Tagen Kultivierung verwendete Kulturmedium kann mehr Anwendung erhöht MBMEC Zelltod und geringer Qualität Barrierefunktion führen. Drittens sollte die in diesem Protokoll angewendet Enzyme gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet und gespeichert werden; ansonsten ihre ordnungsgemäße Funktion beeinträchtigt werden könnte. Darüber hinaus könnte die Beschichtung von Zellkulturplatten geändert, wenn Endothelzellen nicht zu befestigen. Konzentrationen von Fibronektin und Kollagen könnte verändert werden oder andere Matrixproteine ​​können zu der Beschichtungslösung zugegeben werden. Schließlich, Alter, Geschlecht, Jahreszeit des Jahres und Umweltbedingungen innerhalb der Tierhaltung sind wichtige Faktoren, die die Qualität MBMEC Isolation und Vergleichbarkeit der Versuche beeinflussen könnten. Es sollte sichergestellt werden, dass die Bedingungen vergleichbar unabhängigen Experimenten sind. Das beschriebene Protokoll sollte als Grundneuroimmunologischen Methode murine BMECs isolieren berücksichtigt werden. Die isolierten Zellen u sein könnteSED für eine Vielzahl von Anwendungen, weitere Einblicke in BBB Funktion, wie Migrationsassays, Gen- und Proteinexpressionsstudien elektro Auswertungen oder Permeabilität Experimenten zu gewinnen. Wie oben erwähnt, können 3D-Zellkultursysteme von BMECs neue Möglichkeiten, um die komplexen Mechanismen in der Regulation der BBB in Zusammenhang mit der NVU beteiligt Studie liefern. Daher wird die Isolierung von primären Endothelzellen eine unschätzbare Technik im Bereich der BBB Forschung in Zukunft so bleiben.

<html> Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) bilden Monoschichten, die ein integraler Teil der hochspezialisierten Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​sind. BMECs durch junctional Proteine ​​an einen Basalmembran befestigt verschaltet. Zusammen mit Perizyten, glatte Muskelzellen, Astrozyten Ende Füße und zirkulierenden Blutzellen bauen sie die sogenannte neurovaskulären Einheit (NVU) 1. Gegen den bisherigen Vorstellung von einer undurchlässigen Barriere zwischen Blut und zentralen Nervensystems (ZNS), die NVU ein dynamisches, hoch spezifische und geregelte Schnittstelle, die den Übergang von Fluiden, Moleküle und Zellen zwischen zerebralen Blutgefäße und des ZNS 2 steuert . Eine Dysfunktion oder Dysregulation des NVU kann initiieren und / oder dazu beitragen, eine Vielzahl von neurovaskulären, infektiöse, entzündliche oder degenerative Erkrankungen des ZNS, wie beispielsweise Schlaganfall, HIV-Enzephalopathie, multiple Sklerose, Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson 3-6. _content &quot;&gt; Die BMEC Monoschicht dicht mit einem Junction-Komplex, der aus dicht verschlossen (TJ) und Adhärenzverbindungen (AJ) 7. Der hohe elektrische Widerstand und die Niederparazelluläre Permeabilität der BBB hauptsächlich auf TJ Proteinen 8. Die TJs sind Komplexe, die durch den Transmembranproteine ​​der claudin und Occludin-Familie, die das Zytoskelett der Endothelzellen durch Adaptermoleküle gebunden sind, gebildet wie die zonulaoccludens (ZO) Proteine ​​ZO1-3 4. Adhärenzverbindungen werden hauptsächlich durch das integrale Membranprotein zusammengebaut Gefäßendothel (VE) -cadherin, das mit dem Zytoskelett via catenins 8 verbunden ist. Die dichte Abdichtung des BBB verhindert den freien Austausch von Substraten und Zellen zwischen Blut und Liquor. Ausnahmen von dieser Regel sind lipophile, kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht &lt;400 Da, die Lage, die BBB von Lipid-vermittelte Diffusion 9 überqueren sind. Der Durchgang der größeren und / oderhydrophile Moleküle, wie Glucose, Aminosäuren, Peptide, Proteine ​​und viele Arzneimittel ist für stark gesteuerte transzellulären Transportsysteme 10, die in fünf Hauptkategorien eingeteilt werden können beschränkt: trägervermittelten Transport, Ionentransport, aktive Ausflusstransport, Rezeptor-vermittelte Transport und Caveolae-vermittelten Transport 4. Diese Transportsysteme unterstützen die Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS, die für eine genaue Signalerzeugung, Transduktion und Integration notwendig ist. Außerdem sind BMECs Lage, den Übergang von unterschiedlichen Molekülen aktiv zu steuern, indem die Expression einer Vielzahl von Ectoenzyme. Diese Enzyme sind an der Zelloberfläche lokalisiert und ändern spezifischen endogenen und exogenen Substraten zu behindern oder Zulassen des Übergangs des BBB 11. Während das ZNS wurde als Immunprivilegierten Organ für eine langfris Zeit betrachtet, deuten neuere Erkenntnisse eine eher dynamische und dicht geregelten System der Immun surveillance des ZNS. Die BMECs kritisch bei der Regulation der Immunzelltransmigration beteiligt. Durch die Expression der Selektine auf ihrer Oberfläche Lymphozyten selektiv veranlaßt, locker an das Endothel zu befestigen. Die Sekretion von Chemokinen, die mit spezifischen Rezeptoren auf Leukozyten stoßen führt zu der Expression oder Konformationsänderungen von Leukozyten-Integrine, wie LFA-1 (Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen-1) und VLA-4 (sehr späte Antigen-4). Die Integrine vermitteln eine feste Adhäsion durch Bindung ihrer endothelialen Gegenrezeptoren, zB VCAM-I (vascular cell adhesion molecule), ICAM-I (interzelluläres Adhäsionsmolekül) ermöglicht die Transmigration in das Hirnparenchym zwischen oder über BMECs des BBB 12-14. Diese und andere Befunde unterstreichen die aktive Rolle des Endothels selbst bei der Regulierung der Immunzellmigration. Weiterhin BMECs als Teil der NVU sind an der Regulation der Hirndurchblutung li beteiligtum lokale neuronale metabolischen Anforderungen nked. Auf Astrozyten Stimulations Endothelzellen vasoaktiven Substanzen wie Stickstoffmonoxid führt zur Entspannung der glatten Gefäßmuskelzellen 15. Angiogenese und Neurogenese in den Entwicklungs sowie im erwachsenen Gehirn Show parallel Strukturierung und Entwicklung und teilen viele Eigenschaften der Verordnung 1, 4. Endothelzellen werden kritisch in diesen Prozessen 16, 17 beteiligt. Zusammenfassend BMECs liefern wichtige Funktionen, um eine richtige Entwicklung und das Funktionieren des ZNS zu rechtfertigen. BBB Dysfunktion ist vielen schweren neurologischen Störungen verbunden. Jedoch haben nur wenige Ziele auf der Gehirngefäß Schnittstelle für eine spezifische und effiziente Behandlung 18 identifiziert. In vitro Modellen vereinfacht wurden verwendet, um die Mechanismen in der Funktion und Regulation von komplexen physiologischen Systeme für eine lo beteiligt verstehenng Zeit. Die Isolierung der durch diese Handschrift und der in-vitro-Studie von murinen BMECs beschrieben, angesichts der Vielzahl von spezifischen Maus-Knockout-Stämme, könnte ein weiteres Verständnis der BBB Funktion und Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eröffnen neue therapeutische Wege zu schaffen.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Rinderserumalbumin</td></tr><tr><td>Kollagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Hohe relative Proteaseaktivität</td></tr><tr><td>Kollagenase-Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Kollagenase aus V. alginolyticus, Dispase aus B. polymyxa</td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>Aus Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkom-Basalmembran</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &de; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Desoxyribonuklease I aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fötales Kälberserum (auch fötales Rinderserum genannt)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Antikoagulans</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Aus Plasma gewonnenes Serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Sollte nur in den ersten 2 Tagen der Kultur verwendet werden</td></tr></tbody></table>

isolierung von primären murinen gehirn mikrovaskulären endothelzellen

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Die Blut-Hirn-Schranke wird ultrastrukturell durch eine Monoschicht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) des Gehirns zusammengesetzt, die durch einen Verbindungskomplex aus engen und adhärenten Verbindungen miteinander verbunden sind. Zusammen mit anderen Zelltypen wie Astrozyten oder Perizyten bilden sie die Neurovaskuläre Einheit (NVU), die spezifisch den Austausch von Flüssigkeiten, Molekülen und Zellen zwischen dem peripheren Blut und dem ZNS reguliert. Durch dieses komplexe und dynamische System sind BMECs an verschiedenen Prozessen beteiligt, die die Homöostase des ZNS aufrechterhalten. Eine Dysfunktion der BHS wird als wesentlicher Schritt in der Pathogenese vieler schwerer ZNS-Erkrankungen beobachtet. Spezifische und zielgerichtete Therapien sind jedoch sehr begrenzt, da die zugrundeliegenden Mechanismen noch lange nicht verstanden sind. 
Tier- und In-vitro-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um ein tieferes Verständnis komplexer physiologischer und pathophysiologischer Prozesse zu erlangen. Durch Reduktion und Vereinfachung ist es möglich, die Untersuchung auf das interessierende Thema zu fokussieren und eine Vielzahl von Störfaktoren auszuschließen. Allerdings sind auch in Modellsystemen die Vergleichbarkeit und Übertragbarkeit reduziert, was bei der Bewertung berücksichtigt werden muss. Die gängigsten Tiermodelle basieren unter anderem auf Mäusen, vor allem aufgrund der stetig wachsenden Möglichkeiten der Methodik. In vitro Studien an isolierten murinen BMECs könnten eine eingehende Analyse ihrer Eigenschaften und der Blut-Hirn-Schranke unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ermöglichen. Weitere Einblicke in die komplexen Mechanismen an der BHS bieten möglicherweise die Grundlage für neue Therapiestrategien.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen von Mäusen durch eine Abfolge von physikalischen und chemischen Reinigungsschritten. Besondere Überlegungen zur Reinheit und Kultivierung von MBMECs sowie zur Qualitätskontrolle, mögliche Anwendungen und Grenzen werden diskutiert.

Unmittelbar nach der Isolierung, murine BMECs und kontaminierenden Zellen zu bilden Konglomerate schwebend in dem Zellkulturmedium (1A, Tag 0). Die Behandlung mit pyrumycin führt zu einer Auswahl von Maus BMECs da sie hohe Effluxtransporter wie P-Glykoprotein, was zu einer relativen Resistenz gegen Toxine exprimieren. Kontaminierenden Zellen sind viel anfälliger für Zytotoxizität 19 pyrumycin. Während des Prozesses der pyrumicin Auswahl kontaminierenden Zellen geben apoptotischen oder nekrotischen Zelltod, während MBMECs beginnen, um das Kollagen IV / Fibronektin beschichtete Zellkulturplatten (1A, Tag 1 und Tag 2) zu befestigen. Bis Tag 5 werden die MBMECs vermehren zu einer Dichte von ca.. 80 bis 90%. Sie werden durch die typische spindelförmiges Aussehen aufweist. Bei Konfluenz werden, bilden sie eine Monoschicht aus dicht gepackten, in Längsrichtung ausgerichteten und nicht-überlappenden Kontakt inhibierten Zellen (1A, Tag 5). Durchpyrumicin Auswahl, eine hohe Reinheit von bis zu 99% MBMEC erreicht wird, wie durch die endotheliale Zellmarker CD31 nachgewiesen (PECAM1; 1B). Die MBMECs bilden dicht versiegelten Monoschichten von Tight Junction-Proteinen verbunden. Nach 7-8 Tagen Kultur bauen die endothelialen Zellschichten bis stabile Werte für den elektrischen Widerstand (Erreichen typische Werte zwischen 20 - 30 Ω x cm 2). Und Kapazität (1C) Zu diesem Zeitpunkt, funktionelle Assays wie zell- Migrationsversuche 3, 20,21 und Durchlässigkeitstests, zB mit Evans Blau oder Dextran, durchgeführt werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500"> Abbildung 1. morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Murine BMECs. (A) Repräsentative Zeitverlauf der kultivierten BMECs durch Übertragungslichtmikro angesehenskopie über 5 Tage. Maßstab gilt für alle Bilder. (B) Immunfluoreszenzfärbung für die endotheliale Zellmarker CD31 an Tag 5. CD31 (grün) und DAPI (blau). (C) Zellen wurden für 5 Tage vorkultiviert und dann in einem automatisierten System für die übertragene Analyse der biophysikalischen Eigenschaften (Widerstand und Kapazität). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Gewinnung von primären murinen, mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns oder MBX. Dies wird erreicht, indem zunächst die meningenfreien Vorderhirne adulter Mäuse isoliert und dann homogenisiert werden. Im zweiten Schritt wird das Gewebehomogenat durch enzymatischen Aufschluss weiterverarbeitet.Im letzten Schritt werden die Endothelzellen dann durch Dichte, Gradient und Zentrifugation getrennt und für die Zellkultur plattiert. Letztendlich kann die Immunfluoreszenzfärbung der isolierten Zellen für die CD 31-Expression verwendet werden, um die Reinheit der MB mech-Kultur zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden, wie der Verwendung von immortalisierten Gehirn- und Endothelzelllinien, besteht darin, dass die mit Primärzellen erzielten Ergebnisse eine bessere Übertragbarkeit auf die in vivo-Situation bieten.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranken-Suche zu beantworten, zum Beispiel, welche Signalwege am Denken von Immunzellen beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von neurovaskulären, infektiösen, entzündlichen oder degenerativen Erkrankungen des Zentralnervensystems. Denn eine Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke ist entscheidend am Erreger solcher Krankheiten beteiligt.Dieses Verfahren wird von Lisa Eeping, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Nach der Isolierung der Gehirne von zehn acht bis zwölf Wochen alten C 57 BL lagern sechs Mäuse das Gewebe in fünf Millilitern sterilem PBS. Verwenden Sie als Nächstes eine Pinzette, um die Hirnstämme, das Kleinhirn und die Thalami zu entfernen, und rollen Sie dann jedes Gehirn vorsichtig auf sterilem Löschpapier.Um die Hirnhäute zu entfernen, poolen Sie das Gehirn in einem 50-Milliliter-Falkenröhrchen und fügen Sie 13,5 Milliliter DM em hinzu, dann zerkleinern Sie das Gewebe zuerst mit einer 25-Milliliter-Pipette und dann mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis das Medium milchig wird. Verdauen Sie das Gewebe in Kollagenase und DNA bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 180 U/min. Nach einer Stunde geben Sie 10 Milliliter DM em in die Gewebesuspension und zentrifugieren die Zellen 10 Minuten lang bei 1000 G und vier Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, das lose Pellet nicht zu stören, und verwenden Sie dann eine 25-Milliliter-Pipette, um das Pellet etwa 25 Mal in 25 Milliliter B-S-A-D-M-E-M zu häuten. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, verwenden Sie eine Glaspipette mit großem Durchmesser, um die milchige obere Myelinschicht zu entfernen. Entfernen Sie dann die BSA-Schicht mit einem normalen PE oder einer Pipette.Resuspendieren Sie das Pellet in neun Millilitern DM em und fügen Sie dann einen Milliliter Kollagenase-Scheibenraum und 0,1 Milliliter DNA zu den Zellen hinzu. Die Lösung bei 37 Grad Celsius auf dem Orbitalschüttler bei 180 U/min verdauen. Während des Aufschlusses wird in einer Ultrazentrifuge ein Perca-Dichtegradient aufgebaut.Nach einer Stunde fügen Sie der verdauten Zellsuspension 10 Milliliter DM E em hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und drehen Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie in zwei Millilitern DM E em die Zellsuspension vorsichtig auf den Pro-Anruf-Gradienten und trennen Sie dann die Zellen durch Zentrifugation. Nach der Trennung können die Zellen als trübe Grenzfläche sichtbar sein. Tauchen Sie die sterile Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30 Grad in die Grenzfläche ein und sammeln Sie etwa 12 Milliliter der Lösung.Die Grenzfläche ist oft nicht sichtbar, um so viele Zellen mit möglichst wenig Kontamination zu erhalten. Ein kleiner Teil der Grenzfläche sollte abgesaugt werden. Darüber hinaus sollte die Spitze der sterilen Nadel vorsichtig und kontinuierlich zu jedem Teil der Grenzfläche bewegt werden. Übertragen Sie die Zellen in einen neuen 50-Milliliter-Falcon, der fünf Milliliter DM em enthält, und dann, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, reus, suspendieren Sie den Gaumen in 0,2 Milliliter Endothelzellmedium pro Quadratzentimeter Oberfläche einer Zellkulturplatte.Entfernen Sie anschließend die Beschichtungslösung von beschichteten Zellkulturplatten und spülen Sie jede Vertiefung in zwei aufeinanderfolgenden Waschschritten mit sterilem PBS aus. Halten Sie schließlich die Zellkulturen in Endothelzellmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem sterilen Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage unmittelbar nach der Isolierung.Maus-BM e und kontaminierende Zellen bilden Konglomerate, die in der Zellkultur schwimmend beobachtet werden können. Die Behandlung mit Mycin führt zur Selektion von muriner BMAX, da kontaminierende Zellen viel anfälliger für reine Mycin-vermittelte Zytotoxizität sind und das nicht betroffene BM E beginnt, sich bis zum fünften Tag an die vier mit Fibronektin beschichteten Zellkulturplatten an das Kollagen zu binden, die BME proliferieren auf eine Dichte von etwa 80 bis 90% und bilden eine Monoschicht aus dicht gepackten, longitudinal ausgerichtete und nicht überlappende kontaktgehemmte Zellen, die durch puram Mycin-Selektion durch ihr typisches spindelförmiges Aussehen gekennzeichnet sind, Es wird eine hohe Reinheit von bis zu 99%muriner BMAX erreicht, wie der Endothelzellmarker CD 31 bestätigt. Die BM E bilden dicht verschlossene Monoschichten, die durch Tight-Junction-Proteine miteinander verbunden sind.Nach sieben bis acht Tagen Kultivierung bilden diese Zellschichten stabile Werte für den elektrischen Widerstand zwischen 20 und 30 Ohm mal Quadratzentimeter und eine stattliche Kapazität. Zu diesem Zeitpunkt können funktionelle Assays wie Zellmigrationsexperimente oder Permeabilitätstests mit Evans-Blau oder Dextran durchgeführt werden. Diese Technik kann in vier bis fünf Stunden nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Andere Methoden wie Migrationsassays, Permeabilitätsexperimente oder elektrophysiologische Messungen können durchgeführt werden, um visionäre Fragen zu beantworten, z.B. wie sich der Transport von Immunzellen unter bestimmten experimentellen Bedingungen verändert?Oder wie sind Eisenkanäle an der Regulation der Blut-Hirn-Schranke beteiligt? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Urin und mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns durch mechanische Homogenisierung, Enzymatik, Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen.

Isolierung und Kultivierung von primären Hirnperizyten: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen

Dieses Video zeigt die Isolierung intakter Gefäße aus dem Gehirn einer Maus, die zusammen mit Neuronen und Gliazellen die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bilden. Die isolierten Gefäße können als In-vitro-Modell verwendet werden, um ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns zu untersuchen.

Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Reinigung des Gefäßkompartiments des Mäusegehirns ermöglicht. Zu den isolierten Hirngefäßen gehören Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden und von einer durchgehenden Basallamina umgeben sind, Perizyten, vaskuläre glatte Muskelzellen sowie perivaskuläre Astrogliamembranen.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Ein Protokoll wird für die Isolierung und Primärkultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) aus neonatalem Maus-Hirngewebe vorgestellt, um ein robustes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schrankfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erstellen.

Isolierung und Kultur mikrovaskulärer Endothelzellen im Maushirn

Erfahren Sie die Isolierung primärer muriner Gehirn-mikrovaskulärer Endothelzellen für Blut-Hirn-Schranken-Forschung. Diese Methode liefert hochreine Kulturen für funktionelle Assays und physiologische Studien.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

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