FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse
24. Dezember 2014
FIM ist ein neuartiger, kostengünstiger Imaging-System entwickelt, um kleine, bewegliche Objekte, wie C. verfolgen elegans, Planarien oder Drosophila-Larven. Die begleitende FIMTrack Programm wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Datenanalyse zu liefern. Zusammen bieten diese Tools ermöglichen Hochdurchsatz-Analyse von Verhaltensmerkmalen.
Das übergeordnete Ziel der folgenden Methodik ist es, die Fortbewegung von Drosophila Melan Gaster-Larven zu visualisieren und zu quantifizieren, um ein Hochdurchsatz-Screening unter freien Bedingungen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem eine Tracking-Oberfläche auf dem FIM-Setup erstellt und die frustrierte interne Totalreflexion für die indirekte Beleuchtung verwendet wird. Anschließend werden Larven verschiedener Genotypen auf die Oberfläche gesetzt und das Krabbelverhalten als Reaktion auf einen Wärmegradienten aufgezeichnet.
Die Videos werden dann vom FIM Track analysiert. Software und erhaltene Daten werden verwendet, um Diagramme zu erstellen, die Unterschiede in den Larven- und Fortbewegungsmustern beschreiben. Die Ergebnisse zeigen, dass präzise, hochdurchsatzfähige, flexible und einfach zu handhabende Quantifizierungen von Larven.
Die Fortbewegung kann auf der Grundlage der FIM-Bildgebungstechnik und des zugehörigen FIM-Track-Programms erfolgen. Der Hauptvorteil dieser bildgebenden Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Auf- oder Durchlicht besteht darin, dass nur Tiere sichtbar sind, die die Oberfläche berühren, was zu einem hervorragenden Vordergrundkontrast im Hintergrund ohne störende Artefakte führt, obwohl diese Methode einen Einblick in die Biologie der Oph-Lava geben kann. Es kann auch verwendet werden, um das Laufverhalten von Fliegen und die Fortbewegung anderer Monoorganismen wie Meereseleganz, Plenäre oder sogar das Wurzelwachstum von Pflanzen zu untersuchen.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um andere davon zu überzeugen, dass eine komplexe Technologie einfach zu bedienen ist. Der erste Schritt besteht darin, eine feuchte Kriechfläche für das FITR-basierte Bildgebungsverfahren (FIM) zu erstellen. Um dies zu tun, eine 0,8%ige Schnecke in Lebensmittelqualität in deionisiertem Reinstwasser.
Gießen Sie die heiße Schnecke auf eine Acrylglasplatte. Rühren Sie die Schnecke nach dem Kochen nicht und gießen Sie ständig. Um Blasenbildung bei dieser Temperatur zu vermeiden, sollte eine zwei Millimeter dicke Platte erstellt werden.
Verwenden Sie die restliche Schneckenlösung, um Standard-Petrischalen von sechs Zentimetern zu füllen. Diese werden verwendet, um die Larven vor dem Versuch zu sortieren, zu reinigen und zu gewöhnen. Schneiden Sie dann etwa zwei Zentimeter vom Umfang der Schneckenplatte ab, um eine glatte quadratische Oberfläche für die Aufzeichnung zu erhalten.
Übergeben Sie die Schneckenplatte direkt nach dem Abkühlen in das FIM-Setup. Durch leichtes Schieben der Schnecke über den Rand der Acrylglasplatte sollte die Schnecke an Ort und Stelle gleiten. Sie sind nun bereit für die Bildgebungsvorbereitung, um eine aversive Schneckenbarriere in die Kriechfläche einzubauen.
Kochen Sie eine 2,5%ige Schnecke in Lebensmittelqualität mit drei molaren NACL in deionisiertem Reinstwasser. Schneiden Sie anschließend eine zwei Zentimeter breite Kerbe, die das Sichtfeld umgibt, in die zuvor gegossene Kriechfläche. Wenn Sie fertig sind, füllen Sie die Kerbe mit einer Salzschnecke, die 0,1 bis 0,3 Zentimeter höher als die Spurfläche ist.
Bereiten Sie als Nächstes das Wärmegradientengerät vor. Das Gerät ist eine Aluminiumplatte, die mit einer isolierenden Oberfläche bedeckt und an beiden Enden mit Wasser aus Pumpen durchblutet ist. Um die Temperaturregelung zu ermöglichen, schalten Sie das Wärmegradientengerät eine Stunde vor dem Gebrauch ein und platzieren Sie es über dem Setup, damit es die gewünschte Temperatur erreichen kann.
Diese Zeit kann für weitere Vorbereitungen genutzt werden. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie die Kriechschnecke mit einer Salzbarriere in die Einrichtung. Platzieren Sie die Kühlerplatte über der Schnecke und stellen Sie den Abstand zwischen Platte und Kriechfläche auf zwei Millimeter ein.
Stellen Sie einen linearen Gradienten von 34 Grad Celsius bis 18 Grad Celsius ein, indem Sie die Temperatur der Wasserkreisläufe auf ein Grad Celsius und 45 Grad Celsius einstellen, was für dieses Gerät geeignet ist. Lassen Sie die Kriechfläche 20 Minuten lang im Gradienten ausbalancieren. Bevor Sie fortfahren, testen Sie den Temperaturgradienten mit einem TER, um die Fliegen vorzubereiten, holen Sie sie aus einem 25 Grad Celsius heißen Inkubator und tropfen Sie ein wenig Wasser in die Kulturfläschchen, um das späte Drittel der Sternlarvenbewegung anzutreiben.
Sammeln Sie als Nächstes die größten Larven mit einem kleinen Pinsel zwei bis fünf Minuten vor der Aufnahme von den Wänden des Fläschchens und übertragen Sie genügend Larven für ein Video in eine Petrischale, die zuvor vorbereitet wurde. Nachdem der Temperaturgradient festgestellt wurde, richten Sie die Aufzeichnungssoftware ein. Geben Sie die Anzahl der Frames pro Video an.
Definieren Sie den Speicherpfad und richten Sie ihn für die sofortige Aufzeichnung innerhalb von 20 Sekunden ein. Nachdem Sie die Larven auf die Krabbelfläche gelegt haben, um mit dem Abbild einer der Larven zu beginnen, stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um einen guten Kontrast zu erhalten. Wenn Sie fertig sind, heben Sie die Heizkörperplatte leicht an und platzieren Sie die Larven bei 34 Grad Celsius, zwei Zentimeter von der Salzbarriere entfernt.
Senken Sie die Kühlerplatte wieder ab und beginnen Sie die Aufnahme im Dunkeln, um die Tiere nicht zu stören. Entfernen Sie nach der Aufnahme die Larven, reinigen Sie sie und befeuchten Sie die Oberfläche. Um die Ausbreitung von NACL zu vermeiden, berühren Sie die Salzschnecke während der Arbeit nicht, da die Oberfläche immer feucht gehalten werden muss, vermeiden Sie übermäßige Feuchtigkeit, die als Lichthöfe oder Tropfen gesehen werden kann, die die Larven umgeben.
Lassen Sie bei Aufzeichnungen und gestörter Nachführung die Schneckenoberfläche ein bis zwei Minuten lang ausgleichen, bevor Sie fortfahren. Speichern Sie in dieser Zeit die gesammelten Bilder und sammeln Sie neue Tiere. Um sich auf das nächste Video vorzubereiten, steuern Sie den Temperaturgradienten mit einem TER alle fünf Videos und passen Sie das Temperaturgerät bei Bedarf an.
Um mit der Verfolgung der Fortbewegung zu beginnen, passen Sie die Tracking-Parameter mit der Vorschauoption an. Passen Sie Millimeter pro Pixel je nach Kamera und Sichtfeld an. Passen Sie als Nächstes die Bilder pro Sekunde basierend auf den Kameraeinstellungen an und verwenden Sie das Feedback im Vorschaufenster, um die Helligkeitsschwellen so anzupassen, dass alle Tiere korrekt erkannt werden.
Passen Sie als Nächstes die Schwellenwerte für die Größe der Larvenfläche an, einzelne Tiere werden durch gelbe Kreise hervorgehoben, kollidierende Larven werden rot hervorgehoben und die Fläche jedes Tieres wird blau angezeigt. Starten Sie die Verfolgung, indem Sie über die Schaltfläche unten rechts nach der Tracking-Sitzung ein Bild mit Larvenspuren und eine CSV-Datei mit den berechneten Fortbewegungs- und Haltungsmerkmalen im Bildverzeichnis speichern. Verwenden Sie abschließend das FIM-Ergebnisviewer-Modul, um die Nachverfolgungsergebnisse zu überprüfen und manuell anzupassen.
Definieren Sie die Kriechrichtung in Bezug auf den Wärmegradienten, um die Daten basierend auf diesem Stimulus auszuwerten. In der hier gezeigten Larvendarstellung sind zwischen diesen Punkten der Kopf- und Schwanzpunkt markiert. Mit einem Radius kann eine beliebige ungerade Anzahl von Spine-Punkten eingestellt werden.
Zusätzlich werden der Schwerpunkt und der Biegewinkel des Hauptkörpers berechnet. Hier sind FI-Bildgebungs- und Tracking-Ergebnisse von verschiedenen Kameras zu sehen. Die Bilder links zeigen drei Larven, die auf einem 10 mal 10 Zentimeter großen Tracking-Tisch kriechen.
Rechts ist der Massenverlauf und die Fläche einer einzelnen Larve dargestellt. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt an, zu dem das beschnittene Bild durch das Auftragen entstanden ist. Ein Wärmereiz wird hier als verschiedenfarbige Trajektorien dargestellt, die über die F-Spur berechnet werden.
Diese hochauflösenden Anwendungsbilder einer dritten, zweiten und ersten in Sternlarven wurden mit einem Makroobjektiv aufgenommen. Auch andere Organismen wie das Meer können gut abgebildet werden. Einmal gemeistert, können etwa hundert Labore pro Stunde und für jedes Tracking-Setup analysiert werden.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, immer unter den gleichen Bedingungen aufzunehmen. Andere Methoden wie die optogenetische Stimulation oder der in vivo Nachweis neuronaler Aktivität könnten in den Aufbau einbezogen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einfach es sein kann, die ulare Fortbewegung effizient zu analysieren.
Übersicht
Das FIM-Abbildungssystem dient der Verfolgung kleiner beweglicher Organismen wie Drosophila-Larven und ermöglicht die hochdurchsatzfähige Analyse des Verhaltens. Das Programm FIMTrack erleichtert eine effiziente Datenauswertung und erlaubt es Forschenden, Bewegungsmuster wirksam zu quantifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensanalyse
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Das FIM-System nutzt die frustrierte totale innere Reflexion zur indirekten Beleuchtung.
- Es bietet einen hervorragenden Kontrast, da nur Organismen, die mit der Erfassungsoberfläche in Kontakt stehen, sichtbar gemacht werden.
- Diese Methode kann auf verschiedene Organismen angewandt werden, einschließlich C. elegans und Planarien.
- Visuelle Demonstrationen sind entscheidend, um die einfache Handhabung des Systems zu veranschaulichen.
Zweck der Studie
- Die Fortbewegung von Drosophila-Larven sichtbar machen und quantifizieren.
- Die Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings unter frei beweglichen Bedingungen ermöglichen.
- Verhaltensreaktionen auf Umweltreize, wie Temperaturgradienten, analysieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer feuchten Kriechoberfläche mit lebensmittelechtem Agar.
- Einrichtung eines Temperaturgradienten für die Versuchsbedingungen.
- Aufzeichnung der Larvenbewegung mittels des FIM-Imaging-Setups.
- Analyse der aufgezeichneten Videos mit der Software FIMTrack zur Quantifizierung von Lokomotionsmustern.
Hauptergebnisse
- Das FIM-System ermöglicht eine präzise Verfolgung der Larvenlokomotion.
- Mithilfe des Systems ist eine Hochdurchsatzanalyse mit minimalen Artefakten erreichbar.
- Die gewonnenen Daten können signifikante Unterschiede in den Lokomotionsmustern zwischen Genotypen aufzeigen.
- Die Methode lässt sich anpassen, um verschiedene Organismen und Verhaltensweisen zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Die FIM-Bildgebungstechnik bietet eine kostengünstige Lösung für die Verhaltensanalyse.
- Sie weist deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Bildgebungsmethoden auf.
- Das System ist benutzerfreundlich und fördert so seine Einführung in Forschungsumgebungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Hochdurchsatz-Analyse des Verhaltens von Modellorganismen unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Stadien, indem sie eine quantitative Bewertung der phänotypischen Reaktionen auf genetische oder umweltbedingte Störungen ermöglicht. Der FIM-Bildgebungs- und FIMTrack-Arbeitsablauf bietet eine kostengünstige, reproduzierbare Plattform für die Phänotypisierung der Fortbewegung, verringert die Variabilität in Verhaltensassays und erhöht die statistische Aussagekraft bei Entdeckungsscreenings. Dieser Ansatz verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem er den Genotyp mit messbaren verhaltensbezogenen Ausgaben in einem skalierbaren Format verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch quantitative Messung der Larvenlokomotion als funktionellen Endpunkt neuronaler Netzwerkaktivität.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem er eine hochkontrastive Bildgebung bereitstellt, die Artefakte minimiert und die Detektionszuverlässigkeit unter frei beweglichen Bedingungen verbessert.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert das phänotypische Screening über verschiedene Genotypen hinweg und ermöglicht eine frühe Unterscheidung verhaltensbezogener Unterschiede, die auf eine Zielstrukturenbindung oder eine Modulation von Signalwegen hindeuten können.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte CSV-Ausgaben mit Bewegungs- und Haltungsmerkmalen, die eine automatisierte Datenverarbeitung und einen Vergleich zwischen Experimenten ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Analyse von bis zu 100 Larven pro Stunde pro Trackingsystem und unterstützt damit mittelhochdurchsatzfähige Screening-Kampagnen in der Entdeckungsbiologie.
- Plattformnutzung: Die Open-Source-Architektur erlaubt die Anpassung für andere kleine Organismen (z. B. C. elegans, Planarien) und Reize jenseits von Temperaturgradienten, wodurch die langfristige Nutzbarkeit erhöht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung von neuromotorischen Phänotypen, die Aspekte neurologischer Erkrankungen modellieren können, und unterstützt die präklinische Validierung.
- Mechanistische Entwederung: Ermöglicht die Berechnung biomechanischer Parameter (z. B. Schwerpunkt, Körperbeugewinkel), um die mechanistischen Zusammenhänge zwischen genetischer Manipulation und motorischer Ausgabe zu klären.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Objektive, quantifizierbare Ergebnisse helfen dabei, Zielstrukturen basierend auf der Schwere und Konsistenz des Verhaltensphänotyps über Wiederholungen hinweg zu priorisieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das FIM/FIMTrack-System ist in den Entdeckungsprozess von der Zielvalidierung bis zur Leitstrukturidentifizierung integriert, wobei die Verhaltensphänotypisierung die Verbindungsscreening und die mechanistische Nachverfolgung beeinflusst.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung von Bewegungsmustern als Reaktion auf Reize und ermöglicht so die Aufklärung von Signalwegen und die Bestätigung von Zielstrukturen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte, die für die Standardisierung von Assays und die Bestätigung von Hits in phänotypischen Screenings unerlässlich sind.
- Analysen: Die Ergebnisse umfassen Metriken zu Trajektorien, Flächen und Biegungen, die statistische Vergleiche zwischen Bedingungen und Genotypen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet larvale Verhaltensphänotypen mit konservierten neurogenen Mechanismen und unterstützt die Übertragung auf komplexere Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das modulare, quelloffene Design ermöglicht den Einsatz über verschiedene Teams und Modellsysteme hinweg mit minimalem Schulungsaufwand.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem das Rauschen in Verhaltensassays verringert und die Signalermittlung verbessert wird.
- Operationaler Wert: Standardisierte Oberflächenpräparation und Tracking-Parameter verbessern die Reproduzierbarkeit zwischen Anwendern und Standorten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, hochauflösende phänotypische Daten zur Target-Modulation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch objektive, skalierbare Verhaltensendpunkte, die die Ausscheidung in späteren Stadien aufgrund fehlender Wirksamkeit verringern.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Verhaltensneurowissenschaft und in der grundlegenden Bildverarbeitung, um die Verfolgungsparameter zu optimieren und die Bewegungsmerkmale zu interpretieren.
- Hängt von einer konsistenten Oberflächenvorbereitung (Agarkonzentration, Feuchtigkeitskontrolle) und der Stabilität des Temperaturgradienten für verlässliche Ergebnisse ab.
- Setzt eine Übereinstimmung zwischen verschiedenen Forschungsteams hinsichtlich der Schwellenwerte für die Merkmalsextraktion (z. B. Larvenfläche, Helligkeit) voraus, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Modelle (z. B. Zebrafischembryonen, adulte Fliegen) erfordert möglicherweise Anpassungen der Oberfläche und der Beleuchtung.
- Praktische Einschränkung: Die Leistung kann bei hochgradig durchsichtigen oder nicht den Untergrund berührenden Organismen nachlassen, sofern die Bildaufnahmeparameter nicht angepasst werden.
