Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, sensorische Axonwachstumsphänotypen in sich entwickelnden fötalen Mäusen effektiv zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst Tre a Tau laxy Reportermäuse richtig gezüchtet und genotypisiert werden, so dass in einem zweiten Schritt nachgeschaltete Färbeassays durchgeführt werden können. Die Mausembryonen werden fixiert und gefärbt, um die Visualisierung der sensorischen Axonprojektionen im gesamten Tier zu ermöglichen.

Anschließend werden die Embryonen dehydriert und gereinigt, um die tief liegenden Axonvorsprünge, die sonst nicht sichtbar wären, vollständig sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methoden ein wirksames Mittel sind, um embryonale nozizeptive Axonwachstumsphänotypen schnell zu beurteilen. Unter Verwendung des Track a Tau Lae-Reporters kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des sensorischen Axonwachstums zu beantworten, indem sie es Forschern ermöglicht, ihr interessierendes Gen auf den Spur eines tlac Z-Hintergrunds zu kreuzen und nach Veränderungen der phänotypen des sensorischen Axonwachstums zu suchen.

Die Implikationen unserer Technik erstrecken sich auf die Therapie in dem Sinne, dass Wissenschaftler unsere Technik verwenden können, um zu testen, ob bekannte angeborene Mutationen sensorische Axonwachstumsphänotypen verursachen können. Um mit der euthanasierten zeitgesteuerten Schwangerschaft Weibchen durch Zervixdislokation zu beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben, fahren Sie fort, embryonale E 16 bis E 18 Embryonen von zeitlich begrenzten Schwangerschaftsfrauen zu präparieren und dann die Embryonen einzeln in die Vertiefungen einer Sechs-Vertiefungs-Schale zu legen, die mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS gefüllt ist. Nach dem Spülen der Embryonen in kaltem PBS entfernen Sie einen kleinen Teil der Amnionmembran des Embryos und legen Sie ihn in eine vorbereitete Proteinase-K-Lösung aus dem DNA-Aufreinigungskit oder der anschließenden Genotypisierung.

Wenn die Amnionmembran verloren geht, entfernen Sie alternativ einen kleinen Teil der Spitze des Embryoschwanzes und legen Sie ihn in Proteinase-K-Lösung. Als nächstes stechen Sie mit Insektenstiften in die Haut rund um den Embryo und bohren Sie etwa 100 Löcher pro Seite. Entfernen Sie das PBS und geben Sie langsam frisches 2%Paraform-Aldehyd oder PFA pH 7,4 in die Vertiefung, nachdem Sie es zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius leicht geschüttelt haben.

Spülen Sie die Embryonen zweimal in PBS und lagern Sie sie in PBS bei vier Grad Celsius bis zur Färbung Für die Genotypisierung. Tauchen Sie die Amnionmembranen oder Embryoschwänze gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Proteinase-K-Gemisch. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 56 Grad Celsius.

Nach der Extraktion der DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-Aufreinigungskits verwenden Sie 0,5 Mikroliter der insgesamt 200 Mikroliter der gereinigten genomischen DNA-Lösung, um eine PCR-Reaktion vorzubereiten, wie im Textprotokoll beschrieben, und fahren Sie dann mit der Ausführung des PCR-Programms fort, wie dort beschrieben. Führen Sie die PCR-Proben nach der PCR 20 Minuten lang auf einem 2%-Aros-Gel bei 100 Volt in einem Extra-Acetat-EDTA-Puffer durch. Fügen Sie eine Spur mit einer DNA-Leiter hinzu, um die Fragmentlängen zu beurteilen und das Gel mit Routineprotokollen zu färben.

Analysieren Sie Embryonen auf das Vorhandensein von Wildtyp, verfolgen Sie a, verfolgen Sie a tau lae und zurück null Allele. Um die Embryonen zu färben. Verwenden Sie ein handelsübliches Kit für laxe Färbungen mit den hier beschriebenen Modifikationen.

Tauchen Sie die Embryonen zu Beginn mindestens eine Stunde lang in Puffer A und schütteln Sie ihn leicht bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Embryonen dann direkt für mindestens 15 Minuten in Puffer B und schütteln Sie ihn vorsichtig bei Raumtemperatur. Als nächstes verdünnen Sie eine 40 Milligramm pro Milliliter xale Stammlösung in eine vorwarme Lösung auf Gewebebasis in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter.

Und geben Sie fünf Milliliter der resultierenden Mischung in ein Szintillationsfläschchen aus Glas. Übertragen Sie die Embryonen in das Glasszintillationsfläschchen, das die Mischung auf Xalgewebebasis enthält. Den Deckel mit Perfil verschließen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Überprüfung auf das Vorhandensein von blauem Fleck. Dann fixieren Sie die Embryonen mit frischem 4%PFA pH 7,4. Schütteln Sie die Embryonen vorsichtig vier Stunden lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie sie zweimal in kaltem PBS spülen, um das Gewebe zu dehydrieren, legen Sie die Embryonen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Mischung aus 50 % Methanol und PBS und schütteln Sie sie im Glas.

Dörren Sie weiter bei Raumtemperatur und schütteln Sie sie in Glasfeilen in 75 % Methanol für 30 Minuten, gefolgt von 90 % Methanol für 30 Minuten. Zum Schluss zweimal 30 Minuten lang in 100% Methanol dehydrieren. Tauchen Sie dann die Embryonen 15 Minuten lang in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 100 % Methanol und 100 % Benzoylalkohol und Benzoylbenzoat oder BABB.

Achten Sie darauf, Glas zu verwenden, da der BABB im letzten Schritt Kunststoff auflöst. Tauchen Sie die Embryonen in 100%BABB, um das Gewebe vollständig zu reinigen und die X-Cal-Färbung im geklärten Embryo zu visualisieren oder die Bildgebung zu mounten, stabilisieren Sie den in 100%BABB eingetauchten Embryo in den entsprechenden Winkeln für die Fotografie, falls erforderlich, mit einer Metallzange. Beleuchten Sie mit einer Kombination aus Auf- und Unterlicht.

Lichtquellen. Nehmen Sie Bilder mit einem Präpariermikroskop auf, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Nehmen Sie mehrere Hellfeldbelichtungen in fünf aufeinanderfolgenden Fokusebenen auf.

0,5 Millimeter Abstand entlang der Z-Achse. Belichtungszeiten und Blendenstufen können je nach Beleuchtung und Kameraspezifikationen variieren und müssen für jedes Setup optimiert werden. Verwenden Sie eine Standard-Bildbearbeitungssoftware, um Overlay-Bilder zu verarbeiten und Fotomontagen zu erstellen.

Die Genotypen von tracken a tal lai homozygoten zurück null und verfolgen a tal lai heterozygote zurück. Snu-Embryonen können durch die Standard-PCR-Genotypisierung eindeutig bestimmt werden. Die ALS-Färbung zeigt detaillierte subkutane periphere axonale Dornen in den Embryonen, Axonvorsprünge aus Trigeminusganglien sowie Rumpf und Kopf sind im ungeklärten Embryo zu sehen.

Hier zeigt die Ex-GS-Färbung detaillierte periphere axonale Dorne in Projektionen von Spinalwurzelganglien in der Mitte des Torsos vor und nach der Clearung mit BABB in Embryonen, die vollständig ohne Track A-Signalweg sind, aber die konstitutiv aktivierte Kinase tragen. BRAF-Mutation unter Kontrolle des neuronenspezifischen Nestes. Im Promotor entwickelte sich die Morphologie der peripheren Projektionen der Nozizeptoren nahezu normal.

Dies zeigt eine entscheidende Funktion für den BRAF-Signalweg beim peripheren Axonwachstum und zeigt, dass die überlebens- und axonwachstumsfördernden Funktionen des Spur-A-Signalwegs getrennt werden können, wobei der genetische Hintergrund der hinteren Null den Verlust des Spur-A-abhängigen Überlebenswegs ersetzt. Es ist wichtig, die Embryonen nicht zu stark zu fixieren, da dies die enzymatische Aktivität der Beta-Glakaten beeinträchtigen könnte. Denken Sie auch daran, dass BABB ein sehr gefährliches Material ist und Sie bei der Arbeit damit immer eine angemessene Belüftung verwenden und geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen sollten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie schlaff gefärbte Axone beim intakten Tier effektiv verarbeiten, färben und visualisieren können.