Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

Makrophagen sind die Schlüsselzellen, die an der Pathogenität des Wirts beteiligt sind. Makrophagen weisen eine phänotypische und funktionelle Diversität auf, die durch Proteomanalyse analysiert und nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel wird beschrieben, wie eine 2D-Elektrophorese von Primärkulturen menschlicher Makrophagen durchgeführt wird, die in den M1- oder M2-Phänotyp differenziert sind.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Phänotyp der humanen proinflammatorischen M1- und antiinflammatorischen M-Makrophagen-Untergruppen durch 2D-Differenz in der Gelelektrophorese zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteine, die aus primären M1- und M-Zwei-Makrophagenkulturen extrahiert wurden, mit Sinusfarbstoffen markiert werden. Im zweiten Schritt werden die Proteine miteinander vermischt und eine ISO-Elektrofokussierung durch Rehydratisierung an den Proben durchgeführt.

In der nächsten zweiten Dimension wird die Elektrophorese mit einem mobilisierten pH-Gradienten oder IPG-Streifen im Dunkeln durchgeführt, und dann werden die Gele mit dem Differential-in-Gel-Elektrophorese-Scanner gescannt. Abschließend wird eine Analyse der nummerierten Bilder durchgeführt, um die Unterschiede in den polypen peptischen Flecken zwischen M1 und M zwei Makrophagen-Untergruppen zu erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der klassischen Todi-Gelelektrophorese besteht darin, dass diese Technik empfindlicher ist und nur fünf Mikrogramm Proteine benötigt, was für Proben, die von menschlichen Patienten gewonnen werden, sehr wichtig ist.

Mario Bove, ein Doktorand, Olivia Beza und Magac-Techniker aus meinem Labor werden das Verfahren demonstrieren. Um Primärkulturen von Monozyten abgeleiteten Makrophagen vorzubereiten, beginnen Sie mit der Verdünnung von 25 Millilitern Buffy Coat in 25 Millilitern PBS. Laden Sie dann das verdünnte Blut vorsichtig auf einen Trenngradienten und zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 1600 g und Raumtemperatur, wenn sich die Zellen fertig gedreht haben. Sammeln Sie die Monozyten an der Grenzschicht, gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Waschungen der geernteten Zellen in 10 Millilitern PBS mit einem Gehalt von 0,1 % EDTA nach dem dritten Waschen.

Schleudern Sie die Zellen noch einmal in PBS allein herunter und resuspendieren Sie das Pellet dann in fünf Millilitern RPMI 1640 Medium ohne Serumsamen. Die Zellen in 35-Millimeter-Schalen mit einer Dichte von eins mal 10 zu den sechs Zellen pro Schale, und dann nach einer 90-minütigen Sedimentation im Inkubator den Überstand verwerfen und die anhaftenden Monozyten dreimal mit einem Milliliter PBS waschen. Als nächstes werden die Zellen sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in 10 Milliliter frischem Medium mit 10 Vol.-% pro Volumen Humanserum kultiviert.

Um dann entzündungshemmende M two-Makrophagen zu erhalten, ergänzen Sie einige der Kulturen mit 15 Nanogramm pro Milliliter IL vier am sechsten Tag der Kultur, um am Tag 12 proinflammatorische Makrophagen zu erhalten. Behandeln Sie die anderen Kulturen differenzierter Makrophagen vier Stunden lang mit 100 Nanogramm pro Milliliter LPS, um die Makrophagen-Untergruppen für die 2D-Elektrophorese zu isolieren. Waschen Sie anschließend die interessierende Kultur dreimal mit 25 millimolaren Tris und lösen Sie dann die Zellen von den Böden der Platten mit Chaps-Extraktionspuffer.

Als nächstes geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schnüren sie bei vier Grad Celsius. Nach fünf Minuten werden die Zellen in 100-Mikroliter-Aliquoten bis zur Proteinkonzentrationsanalyse für die ISO-Elektrofokussierung der Makrophagen-Untergruppen in eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius überführt. Zuerst werden die Proben auf neun Mikroliter Aliquote eingestellt und dann die Zelllösungen mit Lysepuffer reduziert, der mit zwei Millimolaren TCEP bei 37 Grad Celsius ergänzt wird.

Nach einer Stunde werden die Extrakte mit S SI drei und S SI fünf bei 37 Grad Celsius inkubiert und die Reaktion nach 30 Minuten durch Zugabe eines gleichen Volumens Probenpuffers gestoppt. Erstellen Sie dann zwei separate Mischungen aus gleichen Volumina von S, SI, drei markierten M1-Proteinen, mit SCI, fünf markierten M-Proteinen, zwei Proteinen. Als nächstes rehydrieren Sie einen IPG-Streifen mit 450 Mikrolitern der markierten gemischten Proben in einem Chaps-Extraktionspuffer auf einem isoelektrischen Fokussierzellensystem für 24 Stunden, ohne Strom anzulegen.

Am nächsten Tag beginnen Sie die Fokussierung bei 300 Volt für drei Stunden, richten dann einen Gradienten auf 1000 Volt für sechs Stunden ein, gefolgt von zwei 8.000 Volt Gradienten für jeweils drei Stunden, um eine Elektrophorese der zweiten Dimension durchzuführen und die IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffer zu inkubieren. Nach 10 Minuten die Streifen auf 12,5%-Seitengele übertragen und mit niedrigschmelzendem Aroma versiegeln. Verwenden Sie dann ein edin dsic-System bei einer konstanten Spannung von 70 Volt, um die Elektrophorese bei 20 Grad Celsius über Nacht durchzuführen, gefolgt von einem 300-Volt-Lauf, bis die Brom-Phenolblau-Front den Boden des Gels erreicht, um Bilder der Gele aufzunehmen.

Platzieren Sie sie zwischen den beiden Glasplatten mit niedriger Fluoreszenz eines Differential- und Gelelektrophorese-Imager-Scanners und scannen Sie die Gele bei Anregungsemissionswellenlängen von 5 32, 5 80 Nanometern für drei und 6 33 6 70 Nanometern für fünf, um Bilder mit einer Pixelgröße von 100 Mikrometer zu erhalten. Analysieren Sie die mit der entsprechenden Software und berechnen und normalisieren Sie dann die Spot-Volumina in jedem Bild, indem Sie ein normalisiertes Spot-Volumen als Anteil am Gesamtwert jedes im Gel detektierten Spots zuweisen. Analysieren Sie die Unterschiede in den Protein-Spot-Volumina für jeden Makrophagentyp, indem Sie den normalisierten Spot-Volumenwert zwischen den beiden Makrophagengruppen vergleichen, wobei der Unterschied zwischen den Spot-Volumina signifikant ist, wenn die Änderung 1,5-fach ist.

In diesem Experiment. Die 2D-Proteinmuster der beiden Subtypen der Makrophagen M1 proinflammatorisch und M zwei entzündungshemmend wurden durch 2D-Differential bestimmt. Bei der Gelelektrophorese wurde das gleiche Muster von Proteinen entweder für M1 oder M zwei unabhängig von den verwendeten Cyanfarbstoffen beobachtet.

Interessanterweise ergab die bioinformatische Analyse des Gels, dass 20 Bereiche mit Flecken vorhanden waren, wobei Zu- und Abnahmen zwischen den Spot-Volumina quantifiziert wurden, wie sie durch die gelben, blauen und grünen Färbepunkte visualisiert wurden, die als signifikant differentiell ausprägend angesehen wurden, wenn die Faltenänderung des normalisierten Spot-Volumens größer als 1,5 mit einem P-Wert von weniger als 0,05 war. Im Anschluss an dieses CHE können Methoden wie quantitative und Massenspektrometrie oder zusätzliche proteomische Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Art von Proteinen zwischen den beiden Makrophagen-Untergruppen als Reaktion auf verschiedene Stimuli unterschiedlich exprimiert werden.