Name: Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie die 2D-DIGE-Proteomanalyse von M1- und M2-Makrophagen für Immunforschung. Diese hochsensitive Methode erfordert nur fünf Mikrogramm Protein und ermöglicht präzise Unterschiede zwischen pro- und anti-inflammatorischen Zelltypen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von Inserm. Marion Bouvet ist Stipendiatin des französischen Ministeriums für Forschung und Technologie. Annie Turkieh ist Stipendiatin des RP7 der Europäischen Union HOMAGE (305507).

Das Protokoll folgt den Richtlinien unserer Institutionen menschlichen Forschungsethikkommission. Buffy-Coat von gesunden menschlichen Spendern wurden aus dem regionalen Blutspendezentrum (Lille, Frankreich) erhalten. Proben aus den Buffy Coats erhalten werden als Inserm Sammlung (n ° DC2010-1209) erklärt. 1. Material und Kultur Medienvorbereitung <ol><li> Verdünnen 10x Phosphatpuffer Saline (PBS) in sterilem destilliertem Wasser, um 1x PBS erhalten. </li><li> Machen RPMI 1640 Medium mit Gentamicin (40 ug / ml) und L-Glutamin (2 mM), mit und ohne 10% gepooltem Humanserum. </li></ol> 2. Primärkulturen von Monozyten abgeleitete Makrophagen (MDM) <ol><li> Verdünnte Buffycoat (25 ml) mit 1x PBS. Sorgfältig auf einem Ficoll / Leucosep Rohr und Zentrifuge laden bei 1.600 × g für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sammeln Monozyten an der Schnittstelle in ein neues Röhrchen. Waschen 3x mit 10 ml 1 × PBS mit 0,1% EthylendiamintetraEssigsäure (EDTA) durch aufeinanderfolgende Zentrifugation bei 1.000 × g, 370 xg und 160 g für 10 min jeweils, und dann einmal in 1 × PBS allein bei 160 × g für 10 min. </li><li> Zellpellet in 5 ml RPMI-1640-Medium ohne Serum und Samen, die Zellen in 35 mm-Schalen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro Schale. </li><li> Nach der Sedimentation für 90 min im Brutschrank, den Überstand verwerfen die nicht-adhärenten Zellen enthält. Die adhärenten Zellen zu waschen, die aus Monozyten, 3 x mit je 1 ml PBS; dann 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% (v / v) Humanserum zu den zuvor serumfreie Zellen. </li><li> Nach 6 Tagen in Kultur, um alternative differenzierten Makrophagen (M2) zu erhalten, fügen rekombinantes humanes IL-4 (15 ng / ml) und für 6 Tage beibehalten. Dann behandeln differenzierten Makrophagen mit Lipopolysaccharid (100 ng / ml) am Tag 12 für 4 h auf M1 Makrophagen zu erhalten. </li></ol> 3. Extraktion von M1 und M2 Makrophagen Proteine ​​für 2D-Elektrophorese <ol><li> Wash macrophAlter dreimal mit 25 mM Tris, pH 7,4, und Schrott in Puffer, enthaltend 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M Thioharnstoff und 7 M Harnstoff. </li><li> Lyse-Zellen unter Verwendung eines Mischers für 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 5 min in Eis und bei -20 ° C. </li><li> Bestimmen Proteinkonzentration unter Verwendung eines kommerziellen Bradford-Reagenz. Speichern 100 ul Aliquots der Proteine ​​bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Isoelektrofokussierung HINWEIS: Führen Sie alle Markierungsverfahren in der Dunkelheit. <ol><li> Verringern 5 ug jeder Probe (M1 und M2 Makrophagen) mit 2 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) für 1 h auf 9 &amp; mgr; l mit Lysepuffer eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Hinzufügen Cyanin 3 (Cy3) bis M1 und M2 Extrakt Sulfhydryl-reaktive Farbstoffextrakt in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein. Hinzufügen Cyanin 5 (Cy5) bis M1 und M2 Extrakte in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein und inkubierenfür 30 min bei 37 ° C. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens von Probenpuffer, 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3-markierten M1 Proben mit Cy5-markierten M2 Proben in einer Hand und Cy3-markierten M2 Proben mit Cy5-markierten M1 Proben in einer anderen Hand. </li><li> Rehydrieren einen immobilisierten pH-Gradienten (IPG) -Streifen (240 mM, pH 3-10 linearen Gradienten) mit 450 ul der markierten gemischten Proben in Puffer, enthaltend 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS auf einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) Zellsystem 24 h ohne irgendeine Strom. </li><li> Fokussieren bei 300 Volt (V) für 3 Stunden und dann mit einem Gradienten bis 1000 V für 6 h mit einem Gradienten bis 8000 V für 3 Stunden und schließlich bei 8000 V für 3 Stunden. </li></ol> 5. Zweite Dimension HINWEIS: Führen Sie alle Elektrophorese Verfahren in der Dunkelheit. <ol><li> Inkubieren Sie die IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffers enthaltening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M Harnstoff, 2% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 30% (v / v) Glycerin für 10 min. </li><li> Übertragen die äquilibrierte IPG-Streifen für die zweite Dimension (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)) auf 12,5% PAGE-Gelen und Dichtung mit niedrigschmelzendem Agarose. </li><li> Durchführung der Elektrophorese bei 20 ° C unter Verwendung eines Ettan-Daltsix System bei einer konstanten Spannung von 70 V über Nacht mit 300 V, gefolgt, bis die Bromphenolblau-Front den Boden des Gels erreicht. </li></ol> 6. Image Acquisition und bioinformatische Analyse <ol><li> Scan Gele zwischen den beiden Niederfluoreszenzglasplatten gegossen mit einem DIGE Imager Scanner Anregungs- / Emissionswellenlängen von 532/580 nm und 633/670 nm Cy3 für Cy5, um Bilder mit einer Pixelgröße von 100 &amp; mgr; m zu ergeben. </li><li> Führen Sie die Bildanalyse mit kommerzieller Software wie vorher beschrieben 12. </li><li> Berechnen und normalisieren Spotvolumina in jedem Bild. Vergeben Sie einen normalisierten Spotvolumen als Requisitortion des Gesamtwerts jedes Spots detektiert im Gel. </li><li> Analysieren der Unterschiede im Proteinspotvolumen für jede Art von Makrophagen durch Vergleichen der normalisierten Punktvolumenwert zwischen den beiden Gruppen (M1 und M2). Betrachten Sie den Unterschied zwischen den Spotvolumina signifikant zu sein, wenn die Änderung 1,5 fache (p &lt;0,05, one-way ANOVA-Analyse). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
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<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
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<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Es gibt keine erklärten Interessenkonflikte.

Das hier beschriebene Protokoll Details eines Verfahrens, um die Auswirkungen verschiedener Stimuli der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (anti-inflammatorische) analysieren. Primärkulturen von M1 und M2 Makrophagen wurden aus der Differenzierung der Monozyten, erhalten wie zuvor veröffentlichten 7. Das Verfahren von 2D DIGE Gelelektrophorese erfordert spezielle Materialien und Ausrüstung, wie IEF-Zelle für Isoelektrofokussierung, low-Fluoreszenzpla...

Makrophagen sind heterogen und Kunststoff-Zellen, die in der Lage, verschiedene funktionelle Phänotypen zu erwerben sind. In vivo werden diese Zellen auf eine Vielzahl von Mikroumwelt signalssuch mikrobielle Produkte, Cytokine, etc. 1 In vitro. Die pro-inflammatorischen Phänotyps (M1) von Makrophagen durch Lipopolysaccharid (LPS) und dem anti-inflammatorischen Phänotyps (M2) durch einige Cytokine, wie Interleukin-4 (IL-4) induziert werden. Darüber hinaus können Makrophagen aus einem aktivierten M1 bis M2 Phänotyp zu wechseln, und umgekehrt, auf spezifische Signale 2. Abhängig von der Phänotyp wird Makrophagen verschiedene Funktionen haben. M1 Makrophagen sind Zellen, die pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNF-α) zu erzeugen, um Mikroorganismen oder Tumorzellen 3 töten. Im Gegensatz dazu M2 Makrophagen verhindern, dass diese Entzündungsreaktion wie bei der Wundheilung und Fibrose durch die Herstellung anti inflammatory Faktoren wie TGF-β 3,4. Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden Spendern wurden durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie zuvor beschrieben 5 wird eine von Boyum 6 angepaßt isoliert. Makrophagen in Kultur kann nach 6 Tagen Primärkultur 7 in M1 oder M2-Phänotyp unterschieden werden. Analyse der Proteinexpression oder Proteinveränderungen zwischen den beiden Subtypen von Makrophagen unter verschiedenen gesteuerten Reize, wie Host Pathogenität oder mikrobielle Toxine, hilfreich sein, um die Funktionalität der pro- und anti-inflammatorischen Makrophagen zu entschlüsseln. Proteomics sind einzigartige Werkzeuge zur direkten Überwachung von Proteinen, die spezifisch nach oben oder in der menschlichen kultivierten Makrophagen unter verschiedenen Stimuli herunterreguliert sind. Fluoreszierende Farbstoffe haben einige der Einschränkungen der 2D-Gelelektrophorese, wie niedrige Empfindlichkeit und Bildanalyse 8 gelöst &lt;<html> / Sup&gt;. Die Farbstoffe reagieren mit Cystein-Reste haben die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu denen der Reaktion mit Lysinresten 9 erhöht. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Nützlichkeit DIGE Sättigungs Markierung für die Analyse von Proben knapp 10 gegenüber dem klassischen silbergefärbten 2D-Elektrophorese 11. Diese Technologie ist hilfreich bei der schnellen Analyse von Proteinmodifikationen zwischen den zwei Subtypen von Makrophagen oder zwischen unbehandelten und behandelten Makrophagen aus dem gleichen Subtyp. Die Vorteile dieser Technik sind Proteomik, die Zugang zu den Informationen der Proteingröße und post-translationalen Modifikationen durch Analyse der 2D-Gel-12. Es sollte berücksichtigt werden, dass dies nicht ein hoher Durchsatz-Technik entnommen werden, wodurch die Anzahl der Proben, die analysiert werden können. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays, die auf Massenspektrometrie als prüft kürzlich 13 kann dies zu verbessern. _content &quot;&gt; Hier präsentieren wir, wie man 2D DIGE Analyse aus der Proteinextraktion von kultivierten Makrophagen durch die Prozesse der Elektrophorese Isoelektrofokussierung durchzuführen, und SDS-PAGE sowie Informationen über den Nutzen einer angemessenen 2D-Software.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Humanserum</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1.077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 6-Well-Platte PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Forschung Organische Stoffe</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Zylinder</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-Reaktivfarbstoff</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG-Streifen 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean IEF-Zelle</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Ettan-Daltsix System</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Nichtlineare Dynamik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tuben</td><td>beliebiger Lieferant</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>Ur&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D-Reinigung</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Dim&eacute; Thylformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodendochte</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomik von makrophagen durch 2d-elektrophorese

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Das Ziel des hier beschriebenen zweidimensionalen (2D) Elektrophoreseprotokolls ist es, zu zeigen, wie der Phänotyp von menschlichen kultivierten Makrophagen analysiert werden kann. Die Schlüsselrolle von Makrophagen wurde bei verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie entzündlichen, immunologischen und infektiösen Krankheiten gezeigt. In diesem Protokoll verwenden wir Primärkulturen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die in den Phänotyp M1 (pro-inflammatorisch) oder M2 (entzündungshemmend) unterschieden werden können. Dieses in vitro Modell ist zuverlässig für die Untersuchung der biologischen Aktivitäten von M1- und M2-Makrophagen und auch für einen proteomischen Ansatz. Proteomische Techniken sind nützlich, um den Phänotyp und das Verhalten von M1- und M2-Makrophagen während der Pathogenität des Wirts zu vergleichen. Die 2D-Gelelektrophorese ist eine leistungsstarke Proteomtechnik zur gleichzeitigen Kartierung einer großen Anzahl von Proteinen oder Polypeptiden. Wir beschreiben das Protokoll der 2D-Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen, das als 2D-Differential-Gelelektrophorese (DIGE) bezeichnet wird. Die M1- und M2-Makrophagenproteine werden vor der Trennung durch isoelektrische Fokussierung entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in der ersten Dimension und ihrer Molekülmasse in der zweiten Dimension mit Cyaninfarbstoffen markiert. Getrennte Protein- oder Polypeptid-Spots werden dann verwendet, um Unterschiede in der Protein- oder Polypeptid-Expression zu erkennen. Die hier beschriebenen proteomischen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Makrophagenproteinveränderungen, die mit verschiedenen Erkrankungen wie Wirtspathogenität oder mikrobiellen Toxinen verbunden sind.

Um entsprechende Differenz Proteomanalyse durchzuführen, sollte die Verarbeitung von zu analysierenden Proben überprüft werden. Im dargestellten Beispiel ist die Zellkulturqualität von Makrophagen für die morphologische und molekulare Aspekte erforderlich, wie zuvor veröffentlicht 5. Die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und die Homogenität der Kultur wurde durch Phasenmikroskopie verfolgt. Figur 1 zeigt ein Beispiel von primären Kulturen von M1 und M2 ...

Makrophagen sind die Schlüsselzellen, die an der Pathogenität des Wirts beteiligt sind. Makrophagen weisen eine phänotypische und funktionelle Diversität auf, die durch Proteomanalyse analysiert und nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel wird beschrieben, wie eine 2D-Elektrophorese von Primärkulturen menschlicher Makrophagen durchgeführt wird, die in den M1- oder M2-Phänotyp differenziert sind.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Phänotyp der humanen proinflammatorischen M1- und antiinflammatorischen M-Makrophagen-Untergruppen durch 2D-Differenz in der Gelelektrophorese zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteine, die aus primären M1- und M-Zwei-Makrophagenkulturen extrahiert wurden, mit Sinusfarbstoffen markiert werden. Im zweiten Schritt werden die Proteine miteinander vermischt und eine ISO-Elektrofokussierung durch Rehydratisierung an den Proben durchgeführt.In der nächsten zweiten Dimension wird die Elektrophorese mit einem mobilisierten pH-Gradienten oder IPG-Streifen im Dunkeln durchgeführt, und dann werden die Gele mit dem Differential-in-Gel-Elektrophorese-Scanner gescannt. Abschließend wird eine Analyse der nummerierten Bilder durchgeführt, um die Unterschiede in den polypen peptischen Flecken zwischen M1 und M zwei Makrophagen-Untergruppen zu erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der klassischen Todi-Gelelektrophorese besteht darin, dass diese Technik empfindlicher ist und nur fünf Mikrogramm Proteine benötigt, was für Proben, die von menschlichen Patienten gewonnen werden, sehr wichtig ist.Mario Bove, ein Doktorand, Olivia Beza und Magac-Techniker aus meinem Labor werden das Verfahren demonstrieren. Um Primärkulturen von Monozyten abgeleiteten Makrophagen vorzubereiten, beginnen Sie mit der Verdünnung von 25 Millilitern Buffy Coat in 25 Millilitern PBS. Laden Sie dann das verdünnte Blut vorsichtig auf einen Trenngradienten und zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 1600 g und Raumtemperatur, wenn sich die Zellen fertig gedreht haben. Sammeln Sie die Monozyten an der Grenzschicht, gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Waschungen der geernteten Zellen in 10 Millilitern PBS mit einem Gehalt von 0,1 % EDTA nach dem dritten Waschen.Schleudern Sie die Zellen noch einmal in PBS allein herunter und resuspendieren Sie das Pellet dann in fünf Millilitern RPMI 1640 Medium ohne Serumsamen. Die Zellen in 35-Millimeter-Schalen mit einer Dichte von eins mal 10 zu den sechs Zellen pro Schale, und dann nach einer 90-minütigen Sedimentation im Inkubator den Überstand verwerfen und die anhaftenden Monozyten dreimal mit einem Milliliter PBS waschen. Als nächstes werden die Zellen sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in 10 Milliliter frischem Medium mit 10 Vol.-% pro Volumen Humanserum kultiviert.Um dann entzündungshemmende M two-Makrophagen zu erhalten, ergänzen Sie einige der Kulturen mit 15 Nanogramm pro Milliliter IL vier am sechsten Tag der Kultur, um am Tag 12 proinflammatorische Makrophagen zu erhalten. Behandeln Sie die anderen Kulturen differenzierter Makrophagen vier Stunden lang mit 100 Nanogramm pro Milliliter LPS, um die Makrophagen-Untergruppen für die 2D-Elektrophorese zu isolieren. Waschen Sie anschließend die interessierende Kultur dreimal mit 25 millimolaren Tris und lösen Sie dann die Zellen von den Böden der Platten mit Chaps-Extraktionspuffer.Als nächstes geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schnüren sie bei vier Grad Celsius. Nach fünf Minuten werden die Zellen in 100-Mikroliter-Aliquoten bis zur Proteinkonzentrationsanalyse für die ISO-Elektrofokussierung der Makrophagen-Untergruppen in eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius überführt. Zuerst werden die Proben auf neun Mikroliter Aliquote eingestellt und dann die Zelllösungen mit Lysepuffer reduziert, der mit zwei Millimolaren TCEP bei 37 Grad Celsius ergänzt wird.Nach einer Stunde werden die Extrakte mit S SI drei und S SI fünf bei 37 Grad Celsius inkubiert und die Reaktion nach 30 Minuten durch Zugabe eines gleichen Volumens Probenpuffers gestoppt. Erstellen Sie dann zwei separate Mischungen aus gleichen Volumina von S, SI, drei markierten M1-Proteinen, mit SCI, fünf markierten M-Proteinen, zwei Proteinen. Als nächstes rehydrieren Sie einen IPG-Streifen mit 450 Mikrolitern der markierten gemischten Proben in einem Chaps-Extraktionspuffer auf einem isoelektrischen Fokussierzellensystem für 24 Stunden, ohne Strom anzulegen.Am nächsten Tag beginnen Sie die Fokussierung bei 300 Volt für drei Stunden, richten dann einen Gradienten auf 1000 Volt für sechs Stunden ein, gefolgt von zwei 8.000 Volt Gradienten für jeweils drei Stunden, um eine Elektrophorese der zweiten Dimension durchzuführen und die IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffer zu inkubieren. Nach 10 Minuten die Streifen auf 12,5%-Seitengele übertragen und mit niedrigschmelzendem Aroma versiegeln. Verwenden Sie dann ein edin dsic-System bei einer konstanten Spannung von 70 Volt, um die Elektrophorese bei 20 Grad Celsius über Nacht durchzuführen, gefolgt von einem 300-Volt-Lauf, bis die Brom-Phenolblau-Front den Boden des Gels erreicht, um Bilder der Gele aufzunehmen.Platzieren Sie sie zwischen den beiden Glasplatten mit niedriger Fluoreszenz eines Differential- und Gelelektrophorese-Imager-Scanners und scannen Sie die Gele bei Anregungsemissionswellenlängen von 5 32, 5 80 Nanometern für drei und 6 33 6 70 Nanometern für fünf, um Bilder mit einer Pixelgröße von 100 Mikrometer zu erhalten. Analysieren Sie die mit der entsprechenden Software und berechnen und normalisieren Sie dann die Spot-Volumina in jedem Bild, indem Sie ein normalisiertes Spot-Volumen als Anteil am Gesamtwert jedes im Gel detektierten Spots zuweisen. Analysieren Sie die Unterschiede in den Protein-Spot-Volumina für jeden Makrophagentyp, indem Sie den normalisierten Spot-Volumenwert zwischen den beiden Makrophagengruppen vergleichen, wobei der Unterschied zwischen den Spot-Volumina signifikant ist, wenn die Änderung 1,5-fach ist.In diesem Experiment. Die 2D-Proteinmuster der beiden Subtypen der Makrophagen M1 proinflammatorisch und M zwei entzündungshemmend wurden durch 2D-Differential bestimmt. Bei der Gelelektrophorese wurde das gleiche Muster von Proteinen entweder für M1 oder M zwei unabhängig von den verwendeten Cyanfarbstoffen beobachtet.Interessanterweise ergab die bioinformatische Analyse des Gels, dass 20 Bereiche mit Flecken vorhanden waren, wobei Zu- und Abnahmen zwischen den Spot-Volumina quantifiziert wurden, wie sie durch die gelben, blauen und grünen Färbepunkte visualisiert wurden, die als signifikant differentiell ausprägend angesehen wurden, wenn die Faltenänderung des normalisierten Spot-Volumens größer als 1,5 mit einem P-Wert von weniger als 0,05 war. Im Anschluss an dieses CHE können Methoden wie quantitative und Massenspektrometrie oder zusätzliche proteomische Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Art von Proteinen zwischen den beiden Makrophagen-Untergruppen als Reaktion auf verschiedene Stimuli unterschiedlich exprimiert werden.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ganzzell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie an eukaryotischen Zellen. Hier veranschaulichen wir die Genauigkeit dieser Technik, indem wir die multiplen Aktivierungszustände von Makrophagen als Reaktion auf ihre Mikroumgebung analysieren.

Ganzzell MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine genaue und schnelle Methode, um verschiedene Arten der Makrophagen-Aktivierung Analysieren

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Erfahren Sie die 2D-DIGE-Proteomanalyse von M1- und M2-Makrophagen für Immunforschung. Diese hochsensitive Methode erfordert nur fünf Mikrogramm Protein und ermöglicht präzise Unterschiede zwischen pro- und anti-inflammatorischen Zelltypen.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

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