Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, synaptische Parameter, einschließlich der Synapsengröße, der Fragmentierung und der relativen Dichte von Proteinen in der postsynaptischen Membran, objektiv zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der interessierende Muskel von den Versuchstieren seziert wird. Als nächstes wird der präparierte Muskel kryogeschnitten und die Schnitte werden mit Immunfärbung für die Fluoreszenzmikroskopie versehen.

Dann werden auf Phos Bilder von neuromuskulären Verbindungen aus den verschiedenen Behandlungsgruppen objektiv beprobt und die relative Intensität der Färbung für synaptische Spezialisierungen quantifiziert. Letztlich werden durch die konfokale Mikroskopie reproduzierbare quantitative Messungen der Auswirkungen einer Behandlung oder genetischen Veränderung auf die strukturelle Organisation des neuromuskulären Übergangs gewonnen. Nun, diese Methode bietet standardisierte objektive Protokolle mit konfokaler Mikroskopie, um Veränderungen in der Struktur der neuromuskulären Verbindung in Mausmodellen von Erkrankungen wie Myasthenia gravis und Motoneuron-Krankheit zu bewerten.

Im Allgemeinen kann es für Menschen, die diese Methode ausprobieren, schwierig sein, da die unvoreingenommene und objektive Probenahme von NPLS am konfokalen Mikroskop eine Planung erfordert. Die Analyse von NPLS muss auf konsistente und reproduzierbare Weise durchgeführt werden, wobei die Variabilität zwischen den nplate-Parametern von Tier zu Tier dies erschweren kann. Nach der Isolierung der Kryosektion und der Immunfluoreszenzfärbung verblinden die neuromuskulären Verbindungen der Maus oder NJS gemäß dem Textprotokoll die Objektträger, indem sie jeden Objektträger mit einer Zufallszahl markieren, die nur einem zweiten Forscher bekannt bleibt, bis die Quantifizierung der NMJ-Parameter abgeschlossen ist. Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie ein TRIT-C-Filterset, um ihn unter Weitfeldbeleuchtung zu betrachten.

Bewegen Sie sich schrittweise von links nach rechts und zurück durch die Felder, bis eine Endplatte im Feld erscheint, bei der die konfokale Lochblende auf 1,0 Airy eingestellt ist, und optimieren Sie mit geringer Laserleistung die Verstärkungs- und Offset-Pegel für trit C red BGT auf der abzubildenden Endplatte. Optimieren Sie anschließend mit dem 488-Nanometer-Laser die angepasste C-Fluoreszenz, die Synaptophysin darstellt, und sammeln Sie dann einen Z-Stapel der Endplatte mit einem Intervall von 0,7 Mikrometern zwischen den einzelnen optischen Scheiben. Speichern Sie die Bilder unter einem Dateinamen, der das Datum der Imaging-Sitzung, den Codenamen der Folie und die Nummer der Endplatte enthält.

Wiederholen Sie das soeben gezeigte Probenahme- und Bildgebungsverfahren, bis 20 Endplatten vom Objektträger oder der Probe entnommen wurden. Wiederholen Sie dann den Vorgang für die verbleibenden codierten Objektträger unter denselben konfokalen Einstellungen. Nehmen Sie einige Bilder von der Steuerfolie auf.

Verwenden Sie Image J Freeware, um einen Zack zu öffnen und in einem Fluoreszenzkanal ein maximales Projektionsbild vorzubereiten. Speichern Sie die Projektionen als TIF-Dateien mit dem Dateinamen, einschließlich des Bildsitzungsdatums, des Probencodes, der Stirnplattennummer und des Fluoreszenzkanals. Verwenden Sie nun Bild J, um die Z-Projektion zu öffnen.

Wählen Sie den Acetylcholinrezeptor oder einen CHR-Bildkanal aus und wählen Sie den Bildtyp acht Bit, um das farbige 24-Bit-RGB-Bild mit dem Polygon-Werkzeug in ein Acht-Bit-Graustufenbild auf dem Bildschirm umzuwandeln. Zeichnen Sie im roten BGT-Fleckenkanal einen groben Umriss um die interessierende Endplatte, wobei Flecken, die nicht von der interessierenden Endplatte stammen, ausgeschlossen werden. Wählen Sie "Schwellenwert für Bildanpassung" aus, um einen minimalen Intensitätsschwellenwert auf das Bild anzuwenden.

Passen Sie den Schwellenwert an, um die mit A CHR gefärbten Teile zu isolieren und das umgebende Hintergrundsignal als Unterschwelle auszuschließen. Öffnen Sie dann ein zweites Fenster mit dem originalen Volltonbild zum Vergleich. Um die Schwellenwerteinstellungen zu bestätigen, während der Polygonumriss noch vorhanden ist, wählen Sie im Popup-Menü Analysieren, Partikel analysieren aus.

Geben Sie den Größenbereich in Pixelanzahl als 50 bis unendlich an, wodurch die Auswahl winziger Artefakte, die durch elektrisches Rauschen entstehen, vermieden wird. Klicken Sie im Fotomultiplikator auf Partikel analysieren, um ein Fenster mit einer Liste diskreter Überschreitungsschwellenwerte und deren Fluoreszenzintensitätswerte zu erzeugen, die so nummeriert sind, wie sie im Binärbild erscheinen. Kopieren Sie diese Daten in eine beschriftete Tabelle, um die gesamte Stirnplattenfläche zu messen.

Wählen Sie innerhalb des Polygons Messung analysieren aus, kopieren Sie die Daten für A-CHR-Flächen und -Intensitäten und fügen Sie sie in eine Tabelle mit beschrifteten Spalten ein. Wechseln Sie zum Synaptophysin-Kanal. Bereiten Sie ein maximales Projektionsbild vor.

Wählen Sie einen Interessenbereich aus, und legen Sie den minimalen Intensitätsschwellenwert wie gerade gezeigt fest. Um den Überlappungsbereich zu messen, führen Sie die folgenden Schritte aus. Öffnen Sie die Originaldatei, die die Bilder mit den beiden Kanälen enthält, und wählen Sie Bildstapel aus.

Stapeln Sie es in Bilder, um es in zwei separate Bilder aufzuteilen. Wählen Sie mit dem Colokalisierungs-Plugin image J die Option Plugin-Kolokalisierung aus und geben Sie die zuvor aufgezeichneten Schwellenwerte für die Kanäle A CHR und Nerven in das entsprechende Kanalabfragefeld ein. Das Ergebnis ist ein überlappendes Bild in weißen Pixeln.

Konvertieren Sie das neu erstellte Überlappungsbild in ein Graustufenformat und wenden Sie einen Schwellenwert auf den Maximalwert an, der nur die weißen Pixel auswählt, die dem Überlappungsbereich der beiden vorherigen Kanäle entsprechen. Notieren Sie in der Tabelle den resultierenden Flächenwert der Kolokalisierung, der den Überlappungsbereich in Pixeln darstellt, und bereiten Sie eine Tabelle mit Daten vor. Stichprobenmittelwerte berechnen und zeichnen Standardabweichungen und Standardfehler als Histogramme oder Streudiagramme.

Plotten und plattieren Sie A-CHR-Bereiche als Streudiagramme oder Häufigkeitshistogramme, um vor statistischen Tests zu bestimmen, ob die Daten normalverteilt sind. Öffnen Sie nach der Vorbereitung der Immunfluoreszenzfärbung und der Bildgebung von transversalen Muskelfaserschnitten, wie im Textprotokoll beschrieben, eine Originalbilddatei und wählen Sie beim Betrachten des A-CHR-Kanals Bildstapel in Bilder aus, um die Kanäle zu teilen. Wählen Sie den Bildtyp acht Bit, um das Acht-Bit-Graustufenformat auf den Bildschirm zu konvertieren. Tun Sie dies für beide Fluoreszenzkanäle.

Bildstapel auswählen stapelt Bilder zum Stapeln und öffnet einen neuen Stapel aus zwei zuvor getrennten Acht-Bit-Bildern, wodurch mit dem Polygonwerkzeug zwischen den beiden Fluoreszenzkanälen innerhalb eines einzigen Fensters gewechselt werden kann. Ziehen Sie eine Linie eng um die Grenze der A-CHR-Färbung, und wählen Sie Maß analysieren, um die durchschnittliche Intensität für A-CHR innerhalb des eingeschlossenen Bereichs zu messen. Kopieren Sie diesen Wert in eine beschriftete Tabelle, während Sie den Polygonumriss beibehalten.

Wechseln Sie zum zweiten Fluoreszenzkanal und wählen Sie Messung analysieren. Dies ergibt die durchschnittliche Färbung für das Protein von Interesse innerhalb des synaptischen Bereichs, der durch die A-CHR-Färbung definiert ist. Wählen Sie einen Bereich, der von sichtbaren Flecken der Endplatte entfernt ist.

Wählen Sie dann Messung analysieren aus, um die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität zu messen. Wiederholen Sie die Messung für die anderen Fluoreszenzkanäle und kopieren Sie die Hintergrundwerte in die Tabelle mit den Fluoreszenzwerten. Subtrahieren Sie die durchschnittlichen Hintergrundwerte von den Endplattenwerten, um die korrigierten Intensitäten für A CHR und das interessierende Protein an jeder Endplatte zu erhalten.

Teilen Sie schließlich die korrigierten nplate-Intensitätswerte für das interessierende Protein durch die korrigierte BGT-Fluoreszenzintensität, um die hier gezeigten Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zu erhalten. Die Fluoreszenzintensität sowohl für A CHR als auch für Synaptophysin steigt an der Grenze zwischen dem synaptischen und dem synaptischen Teil der motorischen Endplatte stark an. Für solche Bilder wird ein minimaler Schwellenwert den A-CHR-reichen oder synaptophysinreichen Bereich der Endplatte leicht isolieren.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, kann die Färbung der Endplatte für Synaptophysin bei gealterten Mäusen und in einigen Krankheitsstadien weniger intensiv sein. Die Kanten eines CHR-Clusters können verschwommen erscheinen, und es kann ein höheres Maß an zusätzlichen synaptischen Autofluoreszenz-Streudiagrammen geben, die einen beträchtlichen Bereich im A-CHR-reichen Bereich zwischen den Endplatten des vorderen Muskels tibials einer einzelnen Maus zeigen. Nichtsdestotrotz war die durchschnittliche A-CHR-Fläche, basierend auf 15 bis 20 auf Gesichtsendplattenbildern, bei sieben Beispielmäusen ähnlich. In Querschnitten erscheint die Endplatten-achr typischerweise als Sichelform, aber diese Form ist oft unregelmäßig, wie hier dargestellt.

Eine Hintergrundfluoreszenz mit geringer Intensität, wie hier auf dem Synaptophysinkanal gezeigt, zeigt normalerweise, ob ein Patch mit A-CHR-Färbung eine einzelne Endplatte oder zwei separate Endplatten darstellt, die sich auf benachbarten Muskelfasern befinden. Darüber hinaus sind viele synaptische Proteine wie Rapson, Moschus und Beta-Distro-Glykan mit einem CHR an der nplate colokalisiert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die Experimentatoren während der Probenahme und Analyse von nplate-Bildern blind für Behandlungs- und Genotypgruppen bleiben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man konfokale Fluoreszenzbilder von neuromuskulären Verbindungen sammelt, probenimmt und analysiert. Letztendlich sollen die Forscher in der Lage sein, verschiedene strukturelle Parameter des nplate zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen und Genotypen konsistent und objektiv zu vergleichen.