Name: Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Methode zur schnellen Fraktionierung von Vollblut in DNA, RNA, Plasma und PBMCs mittels Zentrifugation und Filtration. Dieses Protokoll ermöglicht Hochdurchsatzanalysen in nicht-klinischen Umgebungen.

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Wir danken Henriette Mair-Meijers für die unschätzbare Liebe zum Detail und die Stunden, die sie in die Bearbeitung der Blutentnahmen investiert haben. Wir sind dankbar für die Grafikdesign-Expertise von Natalie Jameson Kiesling. Wir danken auch für die Zustimmung der hier genannten Hersteller (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)), die Verwendung ihrer Produkte wie beschrieben zu veröffentlichen. Diese Arbeit wurde großzügig von den National Institutes of Health mit den Preisnummern DA022720, RC1MH088283 und DA022720-05-S1 finanziert.

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<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
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<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
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<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
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<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
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<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
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<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
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<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Wir haben eine schlanke Protokoll, das bereits erfolgreich angewendet wurde, um mehr als 1.600 Vollblut-Proben in der Detroit Neighborhood Health Study bearbeiten beschrieben. Obwohl viele dieser Verfahren sind in der vorhandenen Literatur zur Verfügung, unsere Schritt-für-Schritt-Zusammenstellung, einschließlich der genauen zeitlichen Änderungen zwischen jedem Schritt, spiegelt eine optimierte effizientes Protokoll erfolgreich produziert eine Vielzahl von biologischen Proben mit einer Vielzahl von Downstream-Anwendunge...

Mehrere Studien haben Unterschiede in der Genexpression, DNA-Methylierung und Zell-Untergruppe im Blut bei Menschen mit und ohne geistige (oder anderen) Erkrankungen 1-4 gekennzeichnet. Diese Studien haben jedoch in klinischen Settings, in denen krankheitsassoziierten Unterschiede können aufgrund des allgemein schwerer Natur der Krankheiten, für die Patienten, die Behandlung vergrößert werden erhalten. Aufgrund der Fortschritte in der "Omics" Ansätze hat die letzten zehn Jahre eine Explosion von Interesse an biologischen Proben aus Community und / oder epidemiologische Einstellungen 5-7, um populationsbasierte Schätzungen der Prävalenz der Krankheit geben und ein umfassenderes Bild des Gesehenen Umweltfaktoren dieser geistigen und / oder körperlichen Krankheiten. Eine der größten Herausforderungen in dieser Hinsicht ist die Voraussetzung für eine schnelle Verarbeitung der gesammelten Proben. Abbau von mononuklearen Zellen, Schlüssel Immunsystem Komponenten, die frequentl sindy verwendet werden, um beurteilen die Gesundheit einer Person, beginnt unmittelbar nach Blutentnahme mit einer signifikanten Abnahme der Wiederaufnahme nach 2 Stunden der Sammlung 8-10. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen wir Ihnen ein optimiertes Protokoll, bei dem mehrere Komponenten von menschlichem Vollblut gleichzeitig von Proben in den Häusern von Themen, die in einem großen Stadtgebiet erhalten wurde, isoliert. Das Protokoll ist nach unserer Zusammenstellung und Modifikation der aktuellen Techniken, einschließlich der Speicherung aller "extra" Fraktionen bei Zukunftstechniken ermöglichen eine weitere Isolierung der Basis / Analysen. Alternative Verfahren oder Kits können anstelle der hier beschriebenen einzelnen Methoden diejenigen umrissen eingesetzt werden haben sich als zuverlässige und effiziente Einrichtung zum Verarbeiten von Proben in einem Hochdurchsatz-Art sein. Hochwertige Fraktionen (PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Blut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung und alle Test-ready Proben produzierten verfügbar innerhalb von 2 Tagen (Abbildung 1 sein). Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effiziente Verarbeitung von Proben aus Community-Wohnung, erwachsenen Einwohner der Stadt von Detroit für die Prüfung in der Detroit Neighborhood Health Study gesammelt aktivieren (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), eine bevölkerungsbezogene Studie über die sozialen und biologischen Determinanten der posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD) und anderen psychischen Erkrankungen. Die Prävalenz von PTSD in Detroit mehr als zweimal der nationale Durchschnitt 11,12. Identifizierung von biologischen Determinanten von PTBS in dieser Population kann helfen, geeignete pharmakologische und / oder kognitiv-verhaltenstherapeutische Maßnahmen, um diejenigen, die an der Krankheit zu unterstützen entwickeln, sowohl in diesem städtischen Bevölkerung und in anderen Hochrisikogruppen (zB der Rückkehr Kriegsveteranen). Unser Labor, die zuvor an der Wayne State University in Detroit, Michigan, wurde für die Verarbeitung basierend auf unserem Know-how im Umgang mit frischen Gewebeproben von einer Vielzahl abgeleitet gewähltvon Quellen, um die Notwendigkeit, die Bearbeitung der Proben innerhalb von 2 Stunden der Sammlung zu beginnen, und unsere Nähe zu den Sammelstellen. Mit dieser einzigartigen Gelegenheit, bei der Hand, war es unser Ziel, um die Verarbeitung für höchste Ausbeute von DNA, RNA, Serum und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von jeder Probe (insgesamt N = 1.639 Proben über 5 Wellen der Probenentnahme) zu optimieren. Die hier beschriebenen Verfahren können gleichzeitig in einer nicht-klinischen Umfeld durchgeführt werden, wodurch Ausgangsmaterial (siehe Tabelle 1 für die Durchschnittserträge) für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Microarray, epigenetischen, Echtzeit-RT-PCR und Durchflusszytometrie analysiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> Abbildung 1. Gesamtarbeitsablauf. Die hier dargestellte Gesamtprozess umfasst die Logistik der Gewinnung der Blutproben von der Identifizierung zustimmenden particnehmer in die Blutabnahme selbst. Hochwertige, Fraktionen (periphere mononukleäre Blutzellen; PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Vollblut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung produziert werden und alle Test-ready Proben können innerhalb von 2 Tagen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus sind die durch dieses Verfahren hergestellten Fraktionen geeignet für Langzeitspeicherung, wenn die Proben nicht sofort getestet werden. Der gesamte Zeitachse hier skizzierten konnte an einem einzigen Tag (~ 5 Stunden insgesamt) abgeschlossen sein. Allerdings würde ein solcher Tag extrem arbeitsintensiv insbesondere für einen Monteur mit umfassender Erfahrung mit den Techniken. Daher empfehlen wir, Aufteilen der Verfahren an Tag 1 zwischen mindestens zwei Techniker und Abschluss der RNA-Prozessierung am Tag 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Tag 1: DNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; Pasteurpipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviert</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, flüssiges</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau-Fleck</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter oder Zellzählgerät wie ein Mikroskop und ein Hämozytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Tag 1: PBMC-Isolierung</td></tr><tr><td>LeukoLOCK Fraktionierung & Stabilisierungs-Kit&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Tag 1: Leukozyten-RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 Zoll Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Tag 1: Leukozyten-RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Spritzen (5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>Tage 1 und 2: Denaturierende Lyselösung zur Isolierung von Leukozyten-RNA</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Tag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Tag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA</td></tr><tr><td>TRI-Reagenz</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>Tag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA</td></tr><tr><td>von Brom-3-chlorpropan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td> Tag 2: Spin-Kartuschen zur <td>Isolierung von Leukozyten-RNA</td></tr><tr><td></td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Tag 2: Leukozyten-RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>0,1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Tag 2: Leukozyten-RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>DNA-freies Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>Tag 2: DNase-Behandlung</td></tr><tr><td>RNA 6000 Leiter&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Tag 2: Bioanalysator-Analyse</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Tag 2: Bioanalysator-Analyse</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Tag 2: Bioanalysator-Analyse</td></tr><tr><td>Ethanol >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Reinstwasser&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (nukleasefrei)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (serologisch)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer (für Volumina unter 1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten (serologisch)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Kryoboxen (für 2&nbsp; ml und 5&nbsp; ml Kryoröhrchen und 1,5&nbsp; ml Mikrozentrifugenröhrchen)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglasgestell</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; ml und 0,65 Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 und 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml und 5&nbsp; ml Kryofläschchen</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 und 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT Vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 Röhrchen</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 EDTA Vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 Röhrchen</td></tr><tr><td>8,5&nbsp; ml SST Vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 Röhrchen</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Trockenbad-Inkubator mit Heizblock für Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Filtrations-/Vakuumsystem für den Einsatz in der Zellkulturhaube</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor für Mikrozentrifugenröhrchen mit aerosoldichtem Deckel</td><td>Eppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor und aerosoldichten Verschlüssen für 16 x 125&nbsp; mm Vacutainer und 15&nbsp; ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, man muss nicht gekühlt werden</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (empfohlen für die Genauigkeit kleiner Volumina) oder ein anderes spektrophotometrisches Gerät</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstofftank</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Behälter für scharfe Gegenstände</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Behälter für biologische Abfälle</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitsstufe 2&nbsp; zertifizierte Zellkulturhaube</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle fraktionierung und isolierung von vollblutkomponenten in proben aus einer gemeinschaft basierende einstellung erhalten

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Erhebung und Verarbeitung von Vollblut-Proben in einem nicht-klinischen Umfeld bietet eine einzigartige Gelegenheit, selbstständig lebenden Personen mit und ohne Vorerkrankungen zu bewerten. Schnelle Verarbeitung dieser Proben ist wichtig, um eine Verschlechterung der zellulären Schlüsselkomponenten zu vermeiden. Dazu zählen Verfahren zur gleichzeitigen Pbmc (PBMC), DNA, RNA und Serum-Isolierung aus einer einzigen Blutprobe in den Häusern der zustimmenden Teilnehmer in einem Ballungsgebiet durchgeführt, mit der Verarbeitung innerhalb von 2 h Sammlung initiiert. Wir haben diese Techniken verwendet werden, um mehr als 1.600 Blutproben ergeben konsistente, hochwertige Materialien, die später in erfolgreiche DNA-Methylierung, Genotypisierung, Genexpression verwendet worden ist und Strömungsanalysen Zytometrie verarbeiten. Einige der verwendeten Methoden sind Standard; Wenn sie jedoch in der beschriebenen Weise kombiniert werden, eine effiziente Verarbeitung von Proben von Teilnehmern populations und / oder gemeinschafts ermöglichen siebasierte Studien, die normalerweise nicht in einer klinischen Umgebung ausgewertet würde. Daher hat dieses Protokoll die Möglichkeit, Proben (und anschließend Daten), die mehr repräsentativ für die allgemeine Bevölkerung zu erhalten.

Es ist wichtig, dass das gesamte Verfahren zu produzieren hochwertiges Material für die Analyse in einer Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Genexpression über Microarray und RT-PCR-Analyse, Erkennung von epigenetischen Modifikationen und Zell-Untergruppe Variationen. Tabelle 1 zeigt die durchschnittliche Ausbeute und Qualität der Materialien, von jedem der Prozesse dar. 3 stellt ein Beispiel für die Ausgabequalität der Leukozyten RNA Isolation und Filterverarbeitung...

Wir skizzieren eine Methodik für die Verarbeitung von Vollblut, um eine Vielzahl von Komponenten für die weitere Analyse zu erhalten. Wir haben ein optimiertes Protokoll optimiert, das eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung von Vollblutproben mit hohem Durchsatz in einer nicht-klinischen Umgebung ermöglicht.

Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein optimiertes Protokoll bereitzustellen, das einen schnellen Augendurchsatz und die gleichzeitige Verarbeitung von Vollblutproben ermöglicht. In einer nichtklinischen Umgebung wird die Vacutainer-Prozessierung überlappend durchgeführt, um eine effiziente Isolierung hochwertiger Fraktionen von mononukleären D-N-A-R-N-A-Zellen des peripheren Blutes oder pbmc-Serum und Restfraktionen von Plasma und roten Blutkörperchen zu ermöglichen. Die Verarbeitung beginnt mit der Zentrifugation des Serum-Vacutainers, der Entfernung eines Aliquots aus einem Fial-haltigen Vacutainer für die DNA-Isolierung und der Zentrifugation der Fial-Röhrchen.Dann kann der Abschluss der DNA-Isolierung nach der DNA-Isolierung der Leukozyten-abgeleiteten RNA-Isolierung aus dem K zwei EDTA-Vacutainer erfolgen. Das Blut aus jedem Vacutainer wird durch einen entsprechenden Filter geleitet und mit PBS gewaschen, dann mit einem RNA-Stabilisierungsmittel behandelt, das in den Fial-haltigen Vacutainer zurückkehrt. Das restliche Plasma wird abgezogen und die mononukleäre Schicht mit PBS gewaschen.Während sich die Röhrchen drehen, werden die restlichen roten Blutkörperchen gesammelt und das abgetrennte Serum aliquotiert. Schließlich werden pbmc in Zellgefriermedium konserviert. Letztendlich können innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme qualitativ hochwertige Fraktionen von frischem Blut hergestellt werden, und alle assay-fertigen Proben können innerhalb von zwei Tagen zur Verfügung stehen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Verfahren gleichzeitig in einer nicht-klinischen Umgebung durchgeführt werden können, wodurch innerhalb von zwei Tagen Ausgangsmaterial für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen produziert wird, einschließlich epigenetischer Microarray-Echtzeit-R-T-P-C-R- und Durchflusszytometrie-Analysen. Amy Weckl, meine Laborleiterin, wird das Verfahren demonstrieren, um mit der Verarbeitung von Vollblutproben zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer, die Zentrifuge und der Wärmeblock vorbereitet sind.Dokumentieren Sie den Zeitpunkt der Vacutainer-Lieferung auf dem Probenverfolgungsbogen. Dokumentieren Sie nach Erhalt der Proben die Serumisolierung. Startzeit auf dem Probenprotokoll Beginnen Sie sofort mit der Verarbeitung, indem Sie den sieben Milliliter Serum-Vacutainer bei ausgeschalteter Bremse und Beschleunigung zentrifugieren.Mit einem schwingenden Schaufelrotor mit Aerosolkappen für 20 Minuten bei 1300 GS vier Grad Celsius, während der Serum-Vacutainer zentrifugiert wird. Dokumentieren Sie die Startzeit der DNA-Isolierung in einer BSL-Haube mit zwei Zellkulturen. Die Vakubehälter, die das Fial-Gel enthalten, werden fünfmal umgedreht und 200 Mikroliter Vollblut von der Oberseite eines der Vacutainer in jedes der beiden 20-Mikroliter-Aliquots der Protease gegeben.Lassen Sie die Protease und die Mikrozentrifugenröhrchen des Blutes in der Haube und fahren Sie mit der Zentrifugation des Rufs fort, der die Vakuumbehälter enthält. Vor der Zentrifugation. Dokumentieren Sie die Startzeit der PBMC-Isolation, die innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme liegen muss.Invertieren Sie den FI-Aufruf, der Vakuumbehälter enthält, die sich bereits in den aerosoldichten Behältern befinden, acht- bis zehnmal. Zentrifugieren Sie dann den Vacutainer mit ausgeschalteter Pause und Beschleunigung für 30 Minuten bei 1600 Gs 22 Grad Celsius. Kehren Sie zu den DNA-Isolationsproben in die Haube zurück und fügen Sie 200 Mikroliter Puffer al zu jedem der Protease- und Blutmikrozentrifugenröhrchen hinzu.Verschließen Sie die Schläuche und entfernen Sie sie von der Haube. Wirbeln Sie sie dann 15 Sekunden lang ein. Nach dem Vortexen sofort blitzen, die Samples schleudern.Fahren Sie mit der DNA-Isolierung fort, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, bis die DNA aus der Spalte auf Ellucian angedeutet wird. Die DNA aus den beiden Säulen pro Teilnehmer wurde gepoolt, um eine Gesamtausbeute von 800 Mikrolitern pro Teilnehmer zu erzielen. Dokumentieren Sie den Zeitpunkt des Beginns der Leukozyten-RNA-Isolierung.Durchstechen Sie das Gummiseptum des K two EDTA Vacutainers mit einem Transferdorn. Bewahren Sie den Mantel und den Schraubverschluss für die spätere Verwendung nach dem Zusammenbau des K two EDTA-Röhrensystems auf. Verwenden Sie das Ende eines Metallspatels, um die Nadel sicher zu lösen, und führen Sie die Nadel in ein leeres 10-Milliliter-Blutentnahmeröhrchen ein.Drehen Sie die Anordnung der K-zwei EDTA-Vacutainer-Filterauffangröhrchen um, um die Einrichtung abzuschließen. Entnehmen Sie nach der Filtration und einer PBS-Wäsche drei Milliliter des RNA-Stabilisierungsmittels mit einer neuen 10-Milliliter-Spritze. Spülen Sie den Filter und stellen Sie sicher, dass das RNA-Stabilisierungsmittel anhaftet. Lösen Sie dann die Spritze vom Filter, ohne den Kolben zurückzuziehen.Verschließen Sie den Filtereinlass und -auslass, wobei der Mantel und der Schraubverschluss vom Transferdorn zurückgehalten werden, und lassen Sie den Filter mit dem RNA-Stabilisierungsmittel gesättigt. Lagern Sie den Filter mindestens zwei Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius, bis die RA-Isolierung abgeschlossen ist. Sobald der Vacutainer wieder in die BSL-Zwei-Haube eingesetzt wird, entfernen Sie den Stopfen und entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette 1,5 Milliliter der oberen Plasmaschicht, ohne in die Nähe der mononukleären Schicht zu kommen.Übertragen Sie das Plasma aus den beiden Vacutainern in ein Fünf-Milliliter-Kryofläschchen. Protokollieren Sie dann das gesammelte Volume. Das restliche Plasma und die mononukleäre Schicht werden mit einer serologischen Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.Geben Sie dann so viel zuvor vorbereitetes XPBS hinzu, dass das Gesamtvolumen im konischen Rohr auf 15 Milliliter ansteigt. Verschließen Sie das Rohr und drehen Sie es fünfmal um. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen mit ausgeschalteter Pause und Beschleunigung für 15 Minuten bei 300 GS 22 Grad Celsius.Kehren Sie zu den Fial mit den Vakuumbehältern in der Haube zurück und sammeln Sie die roten Blutkörperchen oder Erythrozyten. Verwenden Sie eine 15/3/2 Zoll pastöse Pipette, um die Außenseite der Fial-Gelschicht zu wirbeln und zu lösen und sie zu entfernen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Erythrozyten zu sammeln und in ein Fünf-Milliliter-Kryofläschchen zu übertragen.Protokollieren Sie dann die Lautstärke. Übergeben Sie anschließend die Plasma- und RBC-Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate und lagern Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach 24 Stunden überführen Sie die Proben in eine Kryobox und bringen sie zur Langzeitlagerung auf minus 80 Grad Celsius zurück.Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, setzen Sie das konische Rohr wieder in die Haube ein und saugen Sie die Flüssigkeit an, wobei 500 Mikroliter PBS übrig bleiben, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie ein XPBS hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter zu bringen, und resuspendieren Sie das Pellet. Verschließen Sie das Rohr vorsichtig und drehen Sie es fünfmal um.Dann zentrifugieren Sie die Probe bei ausgeschalteter Bremse und Beschleunigung für 10 Minuten bei 300 GS 22 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation aliquotieren Sie die oberste Serumschicht aus dem Vacutainer in zwei Milliliter Kryo-Fläschchen und dokumentieren das Volumen. Verwenden Sie vier Kryo-Fläschchen und aliquotieren Sie 200 Mikroliter in ein Kryo-Fläschchen.Ein 1000 Mikroliter in ein Kryo-Fläschchen zwei. Teilen Sie dann das verbleibende Volumen in die Kryofläschchen drei und vier auf. Füllen Sie die Kryo-Fläschchen in eine Kryobox um und bewahren Sie sie für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius auf.Und dokumentieren Sie die Startzeit des Gefrierschranks. Fahren Sie mit der PBMC-Isolierung fort. Wenn Sie die Proben nach der Zentrifugation in die Haube zurückführen, saugen Sie so viel Überstand wie möglich an, ohne das Pellet zu stören.Wir suspendieren das Pellet in 2,5 Millilitern PBMC. Mittel. Fügen Sie 2,5 Milliliter PBMC hinzu und gefrieren Sie Medium zwei, das DMSO und RPMI enthält.Mischen Sie das Medium auf die zuvor vorbereitete Zelllösung und wirbeln Sie die Probe vorsichtig ein. Aliquotieren Sie dann 10 Mikroliter der Zelllösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 10 Mikroliter 0,4%ige Pan Blue Stains in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals pipettieren.Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter der Mischung in eine Zellzählkammer. Schieben Sie den Objektträger und legen Sie ihn innerhalb von drei Minuten nach dem Mischen in den Zellzähler. Vergrößern Sie die Ansicht und fokussieren Sie sich auf die Zellen.Wählen Sie dann Zellen zählen, um die A-P-B-M-C-Anzahl zu erhalten. Wenn die lebensfähige PBMC-Zahl über 3 Millionen Zellen pro Milliliter liegt, aliquotiert die Probe in maximal fünf Kryofläschchen mit einer Konzentration von mindestens 3 Millionen Zellen pro Milliliter. Jedes dokumentiert die Zellzahl pro Kryofläschchen auf dem Probenprotokoll.Im begleitenden Textprotokoll erfahren Sie, wie Sie vorgehen müssen, wenn die lebensfähige PBMC-Zahl unter 3 Millionen Zellen pro Milliliter liegt. Füllen Sie schließlich die Kryo-Fläschchen in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate und stellen Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Kryo-Fläschchen nach 24 Stunden in eine Kryo-Box und stellen Sie die Box zur Langzeitlagerung in die Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks.Dokumentieren Sie die Startzeit des Gefrierschranks auf dem Probenprotokoll. Die Methoden zur Leukozyten-RNA-Isolierung und -Filterverarbeitung lieferten dieses Gelbild, das aus der Kapillarelektrophorese resultierte. Es wurden zwei unterschiedliche Banden mit minimalem Abbau hergestellt, die die ribosomale RNA von ATT s und 28 s darstellen.Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Pflege genauer Aufzeichnungen von entscheidender Bedeutung ist. Wir empfehlen, eine Datenbank zu entwickeln, in der alle Informationen über das Kryofläschchen gespeichert werden, einschließlich Volumen, Konzentration, Qualität, Barcode und Lagerort zu Beginn. Und weitere Empfehlungen zur Probenorganisation finden Sie im Textprotokoll.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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