Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein optimiertes Protokoll bereitzustellen, das einen schnellen Augendurchsatz und die gleichzeitige Verarbeitung von Vollblutproben ermöglicht. In einer nichtklinischen Umgebung wird die Vacutainer-Prozessierung überlappend durchgeführt, um eine effiziente Isolierung hochwertiger Fraktionen von mononukleären D-N-A-R-N-A-Zellen des peripheren Blutes oder pbmc-Serum und Restfraktionen von Plasma und roten Blutkörperchen zu ermöglichen. Die Verarbeitung beginnt mit der Zentrifugation des Serum-Vacutainers, der Entfernung eines Aliquots aus einem Fial-haltigen Vacutainer für die DNA-Isolierung und der Zentrifugation der Fial-Röhrchen.

Dann kann der Abschluss der DNA-Isolierung nach der DNA-Isolierung der Leukozyten-abgeleiteten RNA-Isolierung aus dem K zwei EDTA-Vacutainer erfolgen. Das Blut aus jedem Vacutainer wird durch einen entsprechenden Filter geleitet und mit PBS gewaschen, dann mit einem RNA-Stabilisierungsmittel behandelt, das in den Fial-haltigen Vacutainer zurückkehrt. Das restliche Plasma wird abgezogen und die mononukleäre Schicht mit PBS gewaschen.

Während sich die Röhrchen drehen, werden die restlichen roten Blutkörperchen gesammelt und das abgetrennte Serum aliquotiert. Schließlich werden pbmc in Zellgefriermedium konserviert. Letztendlich können innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme qualitativ hochwertige Fraktionen von frischem Blut hergestellt werden, und alle assay-fertigen Proben können innerhalb von zwei Tagen zur Verfügung stehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Verfahren gleichzeitig in einer nicht-klinischen Umgebung durchgeführt werden können, wodurch innerhalb von zwei Tagen Ausgangsmaterial für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen produziert wird, einschließlich epigenetischer Microarray-Echtzeit-R-T-P-C-R- und Durchflusszytometrie-Analysen. Amy Weckl, meine Laborleiterin, wird das Verfahren demonstrieren, um mit der Verarbeitung von Vollblutproben zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer, die Zentrifuge und der Wärmeblock vorbereitet sind.

Dokumentieren Sie den Zeitpunkt der Vacutainer-Lieferung auf dem Probenverfolgungsbogen. Dokumentieren Sie nach Erhalt der Proben die Serumisolierung. Startzeit auf dem Probenprotokoll Beginnen Sie sofort mit der Verarbeitung, indem Sie den sieben Milliliter Serum-Vacutainer bei ausgeschalteter Bremse und Beschleunigung zentrifugieren.

Mit einem schwingenden Schaufelrotor mit Aerosolkappen für 20 Minuten bei 1300 GS vier Grad Celsius, während der Serum-Vacutainer zentrifugiert wird. Dokumentieren Sie die Startzeit der DNA-Isolierung in einer BSL-Haube mit zwei Zellkulturen. Die Vakubehälter, die das Fial-Gel enthalten, werden fünfmal umgedreht und 200 Mikroliter Vollblut von der Oberseite eines der Vacutainer in jedes der beiden 20-Mikroliter-Aliquots der Protease gegeben.

Lassen Sie die Protease und die Mikrozentrifugenröhrchen des Blutes in der Haube und fahren Sie mit der Zentrifugation des Rufs fort, der die Vakuumbehälter enthält. Vor der Zentrifugation. Dokumentieren Sie die Startzeit der PBMC-Isolation, die innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme liegen muss.

Invertieren Sie den FI-Aufruf, der Vakuumbehälter enthält, die sich bereits in den aerosoldichten Behältern befinden, acht- bis zehnmal. Zentrifugieren Sie dann den Vacutainer mit ausgeschalteter Pause und Beschleunigung für 30 Minuten bei 1600 Gs 22 Grad Celsius. Kehren Sie zu den DNA-Isolationsproben in die Haube zurück und fügen Sie 200 Mikroliter Puffer al zu jedem der Protease- und Blutmikrozentrifugenröhrchen hinzu.

Verschließen Sie die Schläuche und entfernen Sie sie von der Haube. Wirbeln Sie sie dann 15 Sekunden lang ein. Nach dem Vortexen sofort blitzen, die Samples schleudern.

Fahren Sie mit der DNA-Isolierung fort, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, bis die DNA aus der Spalte auf Ellucian angedeutet wird. Die DNA aus den beiden Säulen pro Teilnehmer wurde gepoolt, um eine Gesamtausbeute von 800 Mikrolitern pro Teilnehmer zu erzielen. Dokumentieren Sie den Zeitpunkt des Beginns der Leukozyten-RNA-Isolierung.

Durchstechen Sie das Gummiseptum des K two EDTA Vacutainers mit einem Transferdorn. Bewahren Sie den Mantel und den Schraubverschluss für die spätere Verwendung nach dem Zusammenbau des K two EDTA-Röhrensystems auf. Verwenden Sie das Ende eines Metallspatels, um die Nadel sicher zu lösen, und führen Sie die Nadel in ein leeres 10-Milliliter-Blutentnahmeröhrchen ein.

Drehen Sie die Anordnung der K-zwei EDTA-Vacutainer-Filterauffangröhrchen um, um die Einrichtung abzuschließen. Entnehmen Sie nach der Filtration und einer PBS-Wäsche drei Milliliter des RNA-Stabilisierungsmittels mit einer neuen 10-Milliliter-Spritze. Spülen Sie den Filter und stellen Sie sicher, dass das RNA-Stabilisierungsmittel anhaftet. Lösen Sie dann die Spritze vom Filter, ohne den Kolben zurückzuziehen.

Verschließen Sie den Filtereinlass und -auslass, wobei der Mantel und der Schraubverschluss vom Transferdorn zurückgehalten werden, und lassen Sie den Filter mit dem RNA-Stabilisierungsmittel gesättigt. Lagern Sie den Filter mindestens zwei Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius, bis die RA-Isolierung abgeschlossen ist. Sobald der Vacutainer wieder in die BSL-Zwei-Haube eingesetzt wird, entfernen Sie den Stopfen und entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette 1,5 Milliliter der oberen Plasmaschicht, ohne in die Nähe der mononukleären Schicht zu kommen.

Übertragen Sie das Plasma aus den beiden Vacutainern in ein Fünf-Milliliter-Kryofläschchen. Protokollieren Sie dann das gesammelte Volume. Das restliche Plasma und die mononukleäre Schicht werden mit einer serologischen Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Geben Sie dann so viel zuvor vorbereitetes XPBS hinzu, dass das Gesamtvolumen im konischen Rohr auf 15 Milliliter ansteigt. Verschließen Sie das Rohr und drehen Sie es fünfmal um. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen mit ausgeschalteter Pause und Beschleunigung für 15 Minuten bei 300 GS 22 Grad Celsius.

Kehren Sie zu den Fial mit den Vakuumbehältern in der Haube zurück und sammeln Sie die roten Blutkörperchen oder Erythrozyten. Verwenden Sie eine 15/3/2 Zoll pastöse Pipette, um die Außenseite der Fial-Gelschicht zu wirbeln und zu lösen und sie zu entfernen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Erythrozyten zu sammeln und in ein Fünf-Milliliter-Kryofläschchen zu übertragen.

Protokollieren Sie dann die Lautstärke. Übergeben Sie anschließend die Plasma- und RBC-Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate und lagern Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach 24 Stunden überführen Sie die Proben in eine Kryobox und bringen sie zur Langzeitlagerung auf minus 80 Grad Celsius zurück.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, setzen Sie das konische Rohr wieder in die Haube ein und saugen Sie die Flüssigkeit an, wobei 500 Mikroliter PBS übrig bleiben, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie ein XPBS hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter zu bringen, und resuspendieren Sie das Pellet. Verschließen Sie das Rohr vorsichtig und drehen Sie es fünfmal um.

Dann zentrifugieren Sie die Probe bei ausgeschalteter Bremse und Beschleunigung für 10 Minuten bei 300 GS 22 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation aliquotieren Sie die oberste Serumschicht aus dem Vacutainer in zwei Milliliter Kryo-Fläschchen und dokumentieren das Volumen. Verwenden Sie vier Kryo-Fläschchen und aliquotieren Sie 200 Mikroliter in ein Kryo-Fläschchen.

Ein 1000 Mikroliter in ein Kryo-Fläschchen zwei. Teilen Sie dann das verbleibende Volumen in die Kryofläschchen drei und vier auf. Füllen Sie die Kryo-Fläschchen in eine Kryobox um und bewahren Sie sie für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius auf.

Und dokumentieren Sie die Startzeit des Gefrierschranks. Fahren Sie mit der PBMC-Isolierung fort. Wenn Sie die Proben nach der Zentrifugation in die Haube zurückführen, saugen Sie so viel Überstand wie möglich an, ohne das Pellet zu stören.

Wir suspendieren das Pellet in 2,5 Millilitern PBMC. Mittel. Fügen Sie 2,5 Milliliter PBMC hinzu und gefrieren Sie Medium zwei, das DMSO und RPMI enthält.

Mischen Sie das Medium auf die zuvor vorbereitete Zelllösung und wirbeln Sie die Probe vorsichtig ein. Aliquotieren Sie dann 10 Mikroliter der Zelllösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 10 Mikroliter 0,4%ige Pan Blue Stains in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals pipettieren.

Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter der Mischung in eine Zellzählkammer. Schieben Sie den Objektträger und legen Sie ihn innerhalb von drei Minuten nach dem Mischen in den Zellzähler. Vergrößern Sie die Ansicht und fokussieren Sie sich auf die Zellen.

Wählen Sie dann Zellen zählen, um die A-P-B-M-C-Anzahl zu erhalten. Wenn die lebensfähige PBMC-Zahl über 3 Millionen Zellen pro Milliliter liegt, aliquotiert die Probe in maximal fünf Kryofläschchen mit einer Konzentration von mindestens 3 Millionen Zellen pro Milliliter. Jedes dokumentiert die Zellzahl pro Kryofläschchen auf dem Probenprotokoll.

Im begleitenden Textprotokoll erfahren Sie, wie Sie vorgehen müssen, wenn die lebensfähige PBMC-Zahl unter 3 Millionen Zellen pro Milliliter liegt. Füllen Sie schließlich die Kryo-Fläschchen in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate und stellen Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Kryo-Fläschchen nach 24 Stunden in eine Kryo-Box und stellen Sie die Box zur Langzeitlagerung in die Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks.

Dokumentieren Sie die Startzeit des Gefrierschranks auf dem Probenprotokoll. Die Methoden zur Leukozyten-RNA-Isolierung und -Filterverarbeitung lieferten dieses Gelbild, das aus der Kapillarelektrophorese resultierte. Es wurden zwei unterschiedliche Banden mit minimalem Abbau hergestellt, die die ribosomale RNA von ATT s und 28 s darstellen.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Pflege genauer Aufzeichnungen von entscheidender Bedeutung ist. Wir empfehlen, eine Datenbank zu entwickeln, in der alle Informationen über das Kryofläschchen gespeichert werden, einschließlich Volumen, Konzentration, Qualität, Barcode und Lagerort zu Beginn. Und weitere Empfehlungen zur Probenorganisation finden Sie im Textprotokoll.