Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit dem Gibson-Assemblierungsansatz große, komplexe DNA-Konstrukte zu erstellen, die kurze und lange Segmente aus mehreren verschiedenen DNA-Quellen kombinieren. Zuerst wird die komplette Nukleotidsequenz der Plasmide rechnerisch entworfen und dann überlappende Primer-Sets entworfen. Als nächstes werden DNA-Templates für die Assemblierungsreaktion mittels PCR amplifiziert.

Als nächstes wird eine Aufreinigung der PCR-Produkte durchgeführt. Der letzte Schritt ist die Umwandlung der Assemblierungsreaktion der resultierenden Plasmide und die Verifizierung des Plasmidklons. Letztendlich wird die Gibson-Assemblierungsreaktion verwendet, um parallel Plasmide zu entwickeln, die flaggenmarkierte Versionen der Wildtyp- und mutierten CSTF 64-Proteine unter der transkriptionellen Regulation des humanen Elongationsfaktor-eins-Alpha-Promotors enthalten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem traditionellen DNA-Corning besteht darin, dass sie parallele, im Design ähnliche Wildtyp- und mutierte Plasmide ohne aufeinanderfolgende Corning-Schritte erzeugen kann. Entwerfen Sie eine kontinuierliche Nukleotidsequenz, um das endgültige Plasmid darzustellen. Listen Sie nun die tatsächlichen Plasmide und DNA-Fragmente auf, die als Templates in der PCR verwendet werden, um DNA-Fragmente zu bestellen, die nicht ohne weiteres verfügbar sind, wie z. B. verschiedene Kombinationen von Tags und Promotoren als ein- oder mehrere synthetische doppelsträngige DNA-Fragmente.

Als nächstes wird die kontinuierliche Nukleotidsequenz des endgültigen Konstrukts in DNA-Fragmente unterteilt, die für die PCR geeignet sind. Vergewissern Sie sich, dass die Fragmente mit verfügbaren Plasmiden und synthetischen DNA-Fragmenten übereinstimmen. Vermeiden Sie DNA-Fragmente, die kleiner als 200 Nukleotide sind.

Wählen Sie neben dem Primer-Generierungswerkzeug das Menü "Einstellungen festlegen" im Popup-Fenster "Gibson-Baugruppeneinstellungen ändern" aus. Wählen Sie die Registerkarte "Pres ändern" und dann das Menü "Konstrukt erstellen" aus, um die geteilten DNA-Fragmente sequenziell von den fünf Primzahlen bis zu den drei Primzahlen in das Primer-Generierungswerkzeug einzufügen. Öffnen Sie das Fenster Vektor eingeben oder Fragment einfügen, fügen Sie das erste DNA-Fragment ein, das die fünf Primzahlen der Vektor-DNA im schnellen A-Format darstellt, und benennen Sie dieses DNA-Fragment.

Wählen Sie den geeigneten Weg, um das DNA-Fragment zu erhalten. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Weiter. Wenn zusätzliche Nukleotide oder Restriktionsstellen an der Verbindungsstelle des endgültigen Konstrukts hinzugefügt werden müssen, öffnen Sie das Fragment zum Hinzufügen und Einfügen zum Assemblierungsfenster im vorderen oder hinteren Primer-Spacer-Bereich.

Geben Sie die zusätzlichen Nukleotide oder Restriktionsstellen nur für eines der DNA-Fragmente ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Fertig. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Fragmente, bis das Konstrukt abgeschlossen ist.

Wählen Sie das Menü "Primer anzeigen" und überprüfen Sie die Primersequenzen. Wiederholen Sie dies auch für alle Konstrukte, Vektoren, Rückgrate und Inserts oder für DNA-Fragmente, die unterschiedlich sind. Verdünnen Sie die PCR-Primer auf 10 Mikromolar in Wasser oder te Puffer.

Verdünnen Sie dann alle DNA-Templates und einzelsträngigen synthetischen DNAs für die PCRs auf ein Nanogramm pro Mikroliter in Wasser. Assemblieren Sie die PCR-Reaktionen bei Raumtemperatur, indem Sie 2,5 Mikroliter von 10 Mikromolar jedes Primers kombinieren. Ein Mikroliter des einen Nanogramms pro Mikroliter Template-DNA-Fragment 25 Mikroliter heiß.

Beginnen Sie mit dem Korrekturlesen der DNA-Polymerase und 19 Mikroliter Wasser. Mischen Sie das Röhrchen durch leichtes Schnippen und sammeln Sie die Flüssigkeitströpfchen durch kurzes Zentrifugieren. Amplifizieren Sie gleichzeitig in getrennten Röhrchen die DNA-Fragmente ähnlicher Größe gemäß den Empfehlungen für die verwendete DNA-Polymerase.

Führen Sie 25 bis 28 PCR-Zyklen durch oder bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen, die eine ausreichende DNA-Ausbeute ergeben. Lösen Sie fünf Mikroliter der PCR mit der Standard-AROS-Gelelektrophorese auf. Stellen Sie sicher, dass eine einzelne DNA-Bande, die das PCR-Produkt darstellt, sichtbar ist.

Bestimmen Sie die Größe und relative Menge der DNA-Fragmente anhand der DNA-Molekulargewichtsstandards, falls erforderlich, und wiederholen Sie die PCR, um eine ausreichende Menge an DNA-Fragmenten zu erhalten. Übertragen Sie die mit DPN vorverdauten PCRs auf 1,5 Milliliter Röhrchen und geben Sie 81 Mikroliter magnetische DNA-Aufreinigungskügelchen in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Legen Sie die Röhren für zwei Minuten auf den Magnetkollektor. Entsorgen Sie nun die klare Flüssigkeit. Zweimal mit 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol für 30 Sekunden waschen.

Anschließend werden die getrockneten Kügelchen in 10 Mikrolitern 10 millimolares Trishydrochlorid pH 8,0 resuspendiert. Nach zwei Minuten kurz drehen und dann die Röhrchen zwei Minuten lang auf dem Magnetsammler positionieren. Entfernen Sie 8,5 bis 10 Mikroliter der klaren Lösung und geben Sie sie in ein neues, voretikettiertes Röhrchen. Bestimmen Sie die Konzentration der DNA-Fragmente durch UV-Spektroskopie.

Es ist mindestens 100 Nanogramm DNA-Fragment zu verwenden, das das Vektorrückgrat oder das DNA-Fragment darstellt, das den selektiven Marker trägt. Berechnen Sie den dreifachen molaren Überschuss für die DNA-Fragmente, die als Inserts verwendet werden. Mischen Sie die berechneten Mengen an DNA-Fragmenten in einem PCR-Röhrchen.

Stellen Sie dann das Volumen auf 10 Mikroliter ein. Fügen Sie 10 Mikroliter des Gibson Assembly Master Mix hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei 50 Grad Celsius in einem PCR-Thermocycler.

Fahren Sie mit der Umwandlung des unfähigen E-coli des Montageprodukts fort oder frieren Sie die Produkte bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius ein. Befolgen Sie das Transformationsverfahren, das die chemischen oder elektrokompetenten Zellen begleitet. In der Regel werden zwei Mikroliter der Assemblierungsreaktion pro Transformationsreaktion verwendet.

Bestätigen Sie abschließend den Erfolg der DNA-Klonierung durch DNA-Sequenzierung mit spezifischen oder Standard-Primern. Analysieren Sie die Sequenzierungsdaten auf Genauigkeit. Dieses Experiment wurde entwickelt, um das Spaltungsstimulationsfaktor-Protein 64 und auch die Mutante CSTF 64 zu klonen.

Proteine fusionierten mit einem Drei-x-Flaggen-Tag unter der expressionellen Regulation des HE F1 alpha-Promotors. Ein Plasmid, das HE F1 alpha gefolgt von einem Drei-x-Flag-Tag enthielt, stand uns nicht zur Verfügung. Folgende Plasmide standen jedoch zur Verfügung.

PC DNA 3.1 M hiss HF ein alpha-haltiges Plasmid und Maus CSTF 64 Plasmide. Die gesamte Sequenz für das Konstrukt wurde mit den Nukleotid- und Textbearbeitungsanwendungen zusammengesetzt. Anschließend wurde die Sequenz in vier geeignete Stücke aufgeteilt, die den verfügbaren Plasmid-DNAs entsprachen.

Die vier DNA-Fragmente für die Assemblierungsreaktionen wurden mittels PCR amplifiziert. Die resultierenden Plasmide aus einzelnen Klonen wurden amplifiziert und durch Restriktionsenzymverdau analysiert, um sie korrekt in den pc-DNA-Vektor einzubauen. Ausgewählte Klone wurden dann durch Sequenzierung verifiziert. Sobald die Assemblierungstechnik, einschließlich des Plasmid- und Primärdesigns, beherrscht wird, kann die anschließende PCR- und Kommunikationsverifizierung innerhalb von fünf Tagen durchgeführt werden, ohne die Zeit für die primäre und synthetische DNA-Synthese und -Lieferung.