Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen auf Nervenzellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Nervenzellen entweder aus In-vitro-Kulturen oder aus primärem Nervengewebe geerntet werden. Anschließend wird eine optionale unspezifische intrazelluläre Färbung auf die Zellen aufgetragen.

Dann werden die gewünschten Oberflächenantigene sofort mit einem primären Antikörper markiert, während die gewünschten intrazellulären Antigene nach zellulärer Fixierung und Permeation markiert werden. Letztendlich können Ergebnisse durch die Verwendung einer durchflusszytometrischen Analyse zur Co-Expression der Oberflächenantigene auf spezifischen neuronalen Subpopulationen von Interesse erzielt werden, wie sie durch intrazelluläre Markierung definiert sind. Dieses Protokoll wird demonstrieren, wie aus Gewebekulturen gewonnene Nervenzellen für die Abfrage von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen mit mehrfarbiger Durchflusszytometrie vorbereitet werden können.

Zu Beginn der Ernte adhärente Nervenzellen, die in T-75-Kolben gezüchtet werden, indem die Zellen zunächst einmal vorsichtig mit fünf Millilitern magnesium- und kalziumfreiem PBS bei Raumtemperatur gewaschen werden. Dann lösen Sie die Zellen aus dem Kolben, indem Sie drei Milliliter Trypsinersatz hinzufügen, und inkubieren Sie sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Quälen Sie den enzymatischen Verdau, indem Sie sechs Milliliter Fließpuffer hinzufügen, nachdem Sie die Zellklumpen gelöst haben, indem Sie die Zellsuspension einige Male auf und ab pipettieren, und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen, um die Zellen zu isolieren.

Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge, schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur herunter und aspirieren Sie die Snat, um sie für die intrazelluläre Farbstoffmarkierung vorzubereiten. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut mit fünf Millilitern PBS plus 0,1 % BSA. Andernfalls fügen Sie fünf Milliliter Fließpuffer in Verbindung mit dem Standard-Trianblau-Färbeprotokoll hinzu.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die effektive Anzahl lebensfähiger Zellen abzuschätzen. Stellen Sie die Zellkonzentration der vorhandenen Suspension auf 1 Million lebensfähige Zellen pro Milliliter mit dem gleichen Puffer ein, der im vorherigen Schritt verwendet wurde. Diese Zellen sind nun bereit für zwei Färbeoptionen, eine Oberflächenantigen-Antikörperfärbung oder eine optionale fluoreszierende intrazelluläre Färbung mit Carboxyfluorescein, gefolgt von der bereits erwähnten Oberflächenantigenfärbung.

Um einen intrazellulären Markierungsschritt mit Carboxyfluorescein CIN-Ester-Farbstoff durchzuführen, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter CFSE-Stammlösung hinzu. Für jeden Milliliter Zellsuspension legen Sie das Röhrchen bei 200 U/min auf einen Schüttler und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang. Verhindern Sie bei Raumtemperatur Photobleichung, indem Sie die Tube vor direkter Lichteinwirkung schützen.

Schrecken Sie alle nicht reaktiven Farbstoffe ab, indem Sie fünf Volumen Serum mit Flow-Puffer hinzufügen und zum Mischen einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren. Schleudern Sie dann die Zellen fünf Minuten lang in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur herunter und aspirieren Sie den Überstand, um Reste von nicht reaktiven Farbstoffen zu entfernen. Waschen Sie das Zellpellet durch Reanimation und suspendieren Sie es mit fünf Volumina Flusspuffer.

Anschließend werden die Zellen in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur noch einmal fünf Minuten lang heruntergeschleudert, bevor das SUP-Nativmittel entsorgt wird. Zum Schluss wird das Zellpellet wieder mit einem Durchflusspuffer suspendiert, so dass die endgültige Zellkonzentration 1 Million lebensfähige Zellen pro Milliliter beträgt. Für ein Multiplex-Experiment fügen Sie der CFSC-gefärbten Zellsuspension die gleiche Anzahl von ungefärbten Zellen von Interesse aus einer anderen Versuchsbedingung hinzu.

Die Zellen sind nun bereit für die Markierung von Oberflächenantigenen mit Antikörpern, um mit der Färbung der Zelloberfläche zu beginnen. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension mit oder ohne CFSC-Markierungen in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie der Zellsuspension konjugierte Fluor-4-Antikörper in einer Menge hinzu, die zuvor durch Antikörpertitrationstests bestimmt wurde.

Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang. In Abwesenheit von Licht verdünnen Sie das Antikörpergemisch durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu mischen und in einer vorgekühlten Mikrozentrifuge mit vier Grad Celsius vier Minuten lang zu schleudern.

Aspirieren Sie das Supinat, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und wiederholen Sie diese Waschzentrifuge und Aspiration. Treten Sie noch einmal einen Schritt ein. Reus suspendiert das Zellpellet in 100 Mikrolitern einen Flusspuffer zu den zuvor gefärbten Zellen.

Geben Sie 500 Mikroliter des Fixierpuffers zu 100 Mikrolitern der Zellsuspension. Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Dunkeln. Das Formaldehyd vernetzt alle Protein- und DNA-Spezies, die sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, und liefert nicht lebensfähige Zellsuspensionen.

Verdünnen Sie die Fixiermischung, indem Sie einen Milliliter PBS hinzufügen und zum Mischen einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren. Dann schleudern Sie die fixierten Zellen in einer vorgekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für drei Minuten herunter. Aspirieren Sie das Supinat so, dass 100 Mikroliter Flüssigkeit über dem Zellpellet verbleiben, um die Zellmembran für die anschließende intrazelluläre Antigenmarkierung zu permatisieren.

Geben Sie 500 Mikroliter Permeationspuffer zu 100 Mikrolitern Zellsuspension. Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Dunkeln. Verdünnen Sie die Permeationsmischung durch Zugabe eines Milliliters PBS, pipettieren Sie einige Male vorsichtig auf und ab, um die fixierten Zellen in einer vorgekühlten Zentrifuge mit vier Grad Celsius zu mischen und drei Minuten lang herunterzuschleudern.

Aspirieren Sie die SUP-Natante vor der Inkubation vollständig. Bereiten Sie ein Arbeitsmaterial für Primärantikörper vor, indem Sie den Antikörper in einem PBS plus 0,5 %Tween 20 Puffer verdünnen. Das ist entweder mit 1 % BSA, 10 % Eselsserum oder 10 % Ziegenserum angereichert.

Anschließend wird das membrandurchlässige Zellpellet mit 100 Mikrolitern des primären Antikörper-Arbeitsmaterials resuspendiert. Stellen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur bei 200 U/min auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie es 30 Minuten lang im Dunkeln. Verdünnen Sie das Primärantikörpergemisch durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer

Pipettieren Sie einige Male vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu mischen und in einer vorgekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius vier Minuten lang zu schleudern. Aspirieren Sie das Supinat vollständig, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern des Sekundärantikörper-Arbeitsmaterials.

Wiederholen Sie die Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur für 30 Minuten. Verdünnen Sie das Sekundärantikörpergemisch im selben Schüttler durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer. Wiederholen Sie das gleiche Mischen der Röhreninversion, das Schleudern und das Entfernen des Überstands, um alle ungebundenen Antikörper zu eliminieren.

Wiederholen Sie die gleichen Schritte der Waschzentrifugation und der Entfernung des Überstands von einem Milliliter zwei weitere Male, jedoch mit frischem PBS als Waschpuffer. Stattdessen wird das Endergebnis ein sauberes Zellpellet sein, das entweder mit extrazellulären oder intrazellulären fluoreszierenden CFSC-Antikörpern oder einer beliebigen Kombination der drei Resuspendierungen markiert ist, das markierte Zellpellet in 150 Mikrolitern Flusspuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Durchflusszytometer und beginnen Sie die Analyse mit den entsprechenden Einstellungen für Laseranregung und Emissionsfilter für jede Viereretage.

Unter Verwendung der Vorwärts- und Seitenstreudaten als Leitfaden wurde in der Durchflusszytometrie-Analysesoftware eine anfängliche Vorwärts- und Seitenstreuung eingerichtet, um unspezifische Datenpunkte wie Zelltrümmer und tote Zellen auszuschließen. Als nächstes richten Sie unter Verwendung von Rohdaten aus einer ungefärbten Zellsuspension als Negativkontrolle mehrere Fluoreszenzintegrationsgates ein, die positive Emissionssignale sowohl von extrazellulären als auch von intrazellulären Antigenmarkierungen auswählen, um die Hintergrundfluoreszenz von mehrfarbigen Markierungen zu berücksichtigen. Spektrale Überlappungseffekte passen die Fluoreszenz-Gates unter Verwendung von Rohdaten von Einzelantikörper-gefärbten Kontrollen neu an.

In einem Multiplex-Faxexperiment können Carboxyfluorescein-Tags als Ausgangssignal verwendet werden, das ohne die Verwendung eines Antikörpers zwischen Zellen aus zwei verschiedenen Abstammungslinien oder experimentellen Bedingungen unterscheiden könnte. Zum Beispiel kann man in einer heterogenen Zellsuspension sofort zwischen Nervenzellen, die mit CFSC markiert sind, und nicht markierten Fibroblasten unterscheiden, indem man sich einfach das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz im grünen Kanal ansieht. Darüber hinaus kann man in Verbindung mit der CFSE-Esther-Markierung fluoreszierende Antikörper verschiedener Farben verwenden, um die differentielle Expression von Oberflächenantigenen zwischen den CFSE-markierten und unmarkierten Untergruppen innerhalb einer gemischten Probe zu bestimmen.

Zum Beispiel exprimierten SHSY-Fünf-Y-Neuroblastomzellen, die mit CFSE im grünen Fluoreszenzkanal markiert waren, hohe Spiegel des CD-24-Oberflächenantigens, aber nicht des Fibroblastenmarkers CD 54. Im Gegensatz dazu sind CFSC-negative BJ-Fibroblasten positiv für CD 54 mit niedrigeren CD 24-Spiegeln.Kombinatorisch. Die Analyse von neuronalen Oberflächenantigenen kann auch in Verbindung mit dem Antikörper-basierten Nachweis von intrazellulären Antigenen durchgeführt werden.

Die Einbeziehung von ungefärbten Proben und einfach gefärbten Kontrollen für Oberflächenantigene und intrazelluläre Antigene ist als Alternative zur primären und sekundären Antikörper-basierten Markierung von intrazellulären Antigenen, wie z. B. die hier gezeigte neuronale Markerkarte zwei, von entscheidender Bedeutung. Die nicht-kovalente Fluoreszenzmarkierung des Primärantikörpers kann vergleichbare Ergebnisse in der Co-Expressionsanalyse liefern und das Protokoll verkürzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie neuronale Zellen für die grundlegende durchflusszytometrische Analyse mit verschiedenen alternativen Markierungsansätzen und Kombinationen davon vorbereiten können.