Name: Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen in neuronalen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht Neurobiologen die Identifizierung spezifischer neuraler Subpopulationen.

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Unser Forschungsprogramm wird gefördert durch das Emmy Noether-Programm der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Förderung PR1132/3-1. Für eine weitere Unterstützung durch die Müller-Fahnenberg-Stiftung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg wird gedankt. Diese Studie wurde unter anderem durch die Exzellenzinitiative der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GSC-4, Spemann Graduate School) unterstützt.

1. Neuronale Zellernte <ol><li> Bewertung durch Mikroskop: <ol><li> Vor Beginn eines Experiments, überprüfen Sie den Status der Kultur mit Hellfeld oder Phasenkontrastmikroskopie. HINWEIS: Während primäre von Dissektionen erhalten Nervengewebe ist prinzipiell gleichermaßen zugänglich zytometrische Analyse 14,28 fließen, beachten Sie bitte, dass der Fokus des Protokolls ist auf Zellen, die aus in vitro neuronale Zellsystemen erhalten. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen 7: <ol><li> Die Schale / Kolben von adhärenten Zellen mit Mg 2+ schonend waschen / Ca 2+ freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (beispielsweise 5 ml für T75-Kolben wurden 3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platte oder 10 ml für 10 cm Schale). HINWEIS: Der PBS im gesamten Protokoll ist Mg 2+ / Ca 2+ frei. <ol><li> Für das Video beispielsweise mit einem T75-Kolben von SH-SY5Y Neuroblastomzellen bei 80% Konfluenz. Übernehmen zusätzliche Waschschritte für den Fall,erhebliche Rückstände ist in der Schale vorhanden. </li><li> Betrachten Sie Waschungen mit Serumalbumin enthaltenden PBS 48, Percoll oder Ficoll 49 Zentrifugation Steigungen und / oder handelsübliche Perlen 50,51. Entfernen von Myelin und andere Lipid oder anderen Verunreinigungen kritisch ist, insbesondere, wenn erwachsene primären Gewebequellen verwendet werden. </li></ol></li><li> Hinzufügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin Austausch an einem geeigneten Volumen, der die gesamte Fläche der Gewebekulturbehälter umfasst. HINWEIS: Sie betrachten Accutase oder andere enzymatische Verdauung Optionen. Dieser entscheidende Schritt kann sich negativ auf Oberflächen Epitop Ausdruck (siehe 7). </li><li> Die Schale / Kolben bei 37 ° C für 2 inkubieren - 5 min (in Abhängigkeit vom Zelltyp), um Zellen zu trennen. Klopfen Sie leicht die Zellkulturgefäß oder bündig mit einer serologischen Pipette, um die Zellen zu entfernen. Vermeiden Sie zu der Verdauung (da dies zu Zellverlust und Gerinnung bei späteren Schritten verursachen). </li><li> Quench das Trypsin Ersatz durch Zugabe des doppelten Volumens von Strömungspuffer (2% FBS in PBS) und sammle die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Verreiben Sie vorsichtig die Zellsuspension mit Hilfe einer Mikroliterpipette (100 - 1000 ul) oder ein 5 ml serologische Pipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 220 g für 5 min bei 25 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren Verlassen des Pellet hinter. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Strömungspuffer in Abhängigkeit von der Größe des Pellets (beispielsweise für einen konfluenten T75-Flasche von SH-SY5Y-Zellen die typische Ausbeute von mindestens 10 x 10 6 Zellen, wobei die Zellen werden in 5 ml-Fluß-Puffer) resuspendiert. HINWEIS: Wenn größere Brocken oder Gerinnungseingehalten werden, durch ein 30-Filter - um Maschenweite 100. </li></ol></li><li> Zellzählung 52: <ol><li> Übertragen einer kleinen Aliquot der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnt in einem festen Verhältnis in einem Volumen von trypan blau oder eine Alternative Lebensfähigkeit Farbstoff vor der Übertragung auf einem Hämozytometer oder automatisierte Zellzählung System. </li><li> Verdünne die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml durch Zugabe des geeigneten Strömungsvolumen Puffer oder PBS mit 0,1% BSA (wenn mit CFSE Markierungsverfahrens). HINWEIS: Propidiumiodid, 7-Aminoactinomycin, Annexin V und im Handel erhältliche fixierbar Lebensfähigkeit Assay-Kits stellen alternative Möglichkeiten, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu beurteilen. Auch Apoptose-Assays unter Verwendung von Caspase-3-Fluoreszenz wie zuvor beschrieben 53 verwendet werden. Fluorescent Kanäle durch diese Reagenzien, die die Optionen für den nachfolgenden Schritten begrenzen können, wenn in allen Proben enthalten &quot;besetzt&quot; werden. </li></ol></li></ol> 2. Intrazelluläre Farbstoffmarkierung Verwendung CFSE (Figur 3) <ol><li> Verdünne die CFSE zu einer gewünschten Ausgangskonzentration, die leicht verwendet werden kann. HINWEIS: Für diese Experimente eine Stammkonzentration von0,01 mm verwendet. Bestimmen Sie die optimale Arbeitskonzentration von CFSE empirisch. </li><li> Zugabe von 10 ul 0,01 mM CFSE-Lösung pro ml Zellen (Abschnitt 1.3.2, der Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in PBS + 0,1% BSA) für eine Endkonzentration von 0,1 uM. Vortexen gut mischen. HINWEIS: hier verwendeten CFSE Konzentrationen etwa zehnfach geringer als die, die üblicherweise in Proliferationstests angewendet, damit Zelltoxizität des Farbstoffs ist minimal. Wir haben nicht zu beobachten negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Inkubation für 5 min bei RT unter konstantem Schütteln (200 rpm). Vor Licht schützen. </li><li> Quenche die Farbstoff durch Zugabe von 5 Volumina Flusspuffer zu den Rohren. Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter. Resuspendieren der Zellen mit 5 Volumina Flusspuffer. </li><li> Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen /<html> ml. </li><li> Fügen Sie die gleiche Anzahl von ungefärbten Zellen von Interesse für die Zellsuspension gefärbt. Fahren Sie mit der Oberfläche Antigen-Färbung Protokoll (Abschnitt 3). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. Nachweis der Differenz CD-Oberflächen-Antigen-Expression zwischen zwei Zelllinien mittels CFSE Farbstoffmarkierung. SH-SY5Y Neuroblastomzellen sind bereits beschriftet mit CFSE zur späteren Identifizierung im Vergleich zum unmarkierten BJ Fibroblasten. Co-Färbung der Mischprobe (rechte Felder) mit Oberflächenmarker CD24 oder CD54 (beide konjugiert an APC) zeigt, dass Zelllinien sind leicht zu unterscheiden durch den CFSE-Färbung (Pfeile = SH-SY5Y, Pfeilspitzen = BJ Fibroblasten). Die Mehrheit der SH-SY5Y-Zellen exprimieren CD24 nicht aber CD54 (ICAM-1). Im Gegensatz dazu BJ Fibroblasten (CFSE-negativ) sind positiv für CD54, aber weitgehend negativ für CD24.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 3. Zelloberflächenfärbung <ol><li> Beschriften Sie die Röhrchen mit Proben und kritische Kontrollgruppe (siehe Tabelle 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rohr-Nr. </td><td> Beispielnamen </td><td> Antigen-Fluorophor </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ungefärbte Zellen </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Einzelbunt </td><td> CD24-APC </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Einzelbunt </td><td> TuJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Doppelbunt </td><td> CD24-APC </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TuJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Einzelbunt</td><td> Sekundäre nur: Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 L ist von Rohren in einer typischen Durchflusszytometrie Experiment einbezogen werden. Die Tabelle zeigt nur eine minimale Anzahl von Probenröhrchen für eine in diesem Video-Artikel beschriebenen Co-Färbung Experiment erforderlich. Ein ideales Experiment muss alle erforderlichen Kontrollen (negativ, positiv sowie eine Entschädigung Kontrollen) für eine genaue Interpretation der erzielten Ergebnisse umfassen. <ol start="2"><li> 100 l Zellsuspension (von Abschnitt 2.7 oder 1.3.2) zu jeder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Achten Sie darauf, ein Minimum von 0,1 x 10 6 Zellen pro 100 ul der Zellsuspension vorhanden sind. </li><li> Hinzufügen Fluorophor konjugiert Antikörper an die Probe bei einer geeigneten Verdünnung. HINWEIS: Bestimmen Sie die Arbeitslösung für jeden Antikörper vor dem Experiment. Siehe Tabelle 2 für eine Liste of neuronalen Oberflächenantigene. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antigen </td><td> Zelltyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Gliazellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Neurale Stammzellen </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Neurale Stammzellen und Gliazellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Neuronalen Zellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Neuralleiste Stammzellen </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Gliazellen </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Dopaminergen Vorläufer </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Neurale Stammzellen (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Gliazellen </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Gliazellen </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Auswahl der neuronalen Oberflächenantigene. Diese Tabelle enthält eine Liste von Oberflächenepitopen gefunden, die von verschiedenen neuronalen Zelltypen exprimiert wird, um die wachsende Gruppe von Oberflächenantigenen verwendet werden, um die neuronale Linie kenn exemplifizieren werden. Man beachte, dass diese Auswahl ist bei weitem nicht vollständig ist und die meisten von diesen Markierungen werden auch durch eine Reihe von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen exprimiert wird. Folglich werden Kombinationen mehrerer Marker erforderlich, um besser zu definieren und zu isolieren, die die angegebenen neuronalen Subsets werden. <ol start = &quot;4&quot;&gt; <li> Inkubieren für 30 min auf einem Horizontalschüttler (200 rpm) in der Dunkelheit. </li><li> Flusspuffer Wasch <ol><li> 1 ml der Pufferströmung an den Rohren. Zentrifuge bei 380 × g für 4 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer auf ein Endvolumen von 100 ul. </li><li> Verwenden Probe für die Durchflusszytometrie. Alternativ fahren Sie mit Abschnitt 4 und 5. HINWEIS: Wenn Zellen sortiert werden und wieder in Kultur nach der FACS sind (dh lebensfähige Zellsuspension ohne Fixierung oder Permeabilisierung) gelten aseptische Technik bei der Ernte, Färbung und Analyseschritte. </li></ol> 4. Fixierung und Permeabilisierung 38 <ol><li> Fixierung mit Paraformaldehyd (PFA): <ol><li> Bereiten Fixierungspuffer, der 2% PFA in PBS. <br/&gt; Anmerkung: PFA ist schädlich für Mensch und Umwelt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und entsorgen Abfälle in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften. </li><li> Gib 500 ul Fixierungspuffer auf 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln. </li></ol></li><li> PBS-Wasch: <ol><li> 1 ml PBS, um das Rohr. Zentrifuge bei 380 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen / Dekantieren des Überstandes verlassen etwa 100 ul in die Röhre. </li></ol></li><li> Permeabilisierung mit Tween-20: <ol><li> Bereiten Permeabilisierung Puffer mit 0,7% Tween-20 in PBS. </li><li> Gib 500 ul Permeabilisierung Puffer auf 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln. </li></ol></li><li> Mit PBS (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben) Waschen Sie die Zellen einmal und Überstand aus dem Röhrchen Completely, so dass nur das Pellet hinter. </li></ol> 5. Intrazelluläre Antigen Staining 38 (Figur 4) <ol><li> Herstellung von primären Antikörperlösungen: <ol><li> Verdünne die primären Antikörper in Verdünnungspuffer, der 1% Rinderserumalbumin, 10% Serum (zB normale Esel oder Ziegenserum) und 0,5% Tween-20 in PBS. HINWEIS: Wählen Sie das Serum je nach Art der Sekundärantikörper wurden angehoben, um verwendet werden. </li><li> Alternativ verwenden Zenon Fluorescein Markierung des primären Antikörpers nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Herstellung von 1 &amp; mgr; g des primären Antikörpers in PBS bei einer geeigneten Verdünnung (Gesamtvolumen ≤ 20 ul). </li><li> Mit 5 ul Zenon Fluorescein IgG Markierungsreagenz (Komponente A) zu der Antikörperlösung. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT. </li><li> Mit 5 ul Zenon Blockierungsreagenz (Komponente B) zu dem Reaktionsgemisch. </li><li> Bebrütendie Mischung für 5 min bei RT. Anwenden des Antikörpers an die Probe innerhalb von 30 min. </li></ol></li></ol></li><li> Primäre Antikörper-Färbung: <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l des primären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen. </li><li> Alternativ hinzuzufügen Zenon Fluorescein markierten Antikörper zu der Zellsuspension bei der geeigneten Verdünnung. </li><li> Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min Inkubieren auf einem Schüttler (200 rpm), vor Licht geschützt. Mit PBS Waschen Sie die Zellen einmal (wie beschrieben in Abschnitt 4.2) und Überstand aus den Röhrchen vollständig, so dass nur das Pellet hinter. </li></ol></li><li> Sekundäre Antikörper-Färbung (nicht für den Zenon Fluorescein markierten Antikörpern erforderlich): <ol><li> Verdünne die sekundären Antikörper in PBS in einer geeigneten Konzentration. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l des sekundären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen. Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min auf einem Schüttler (200 rpm) im Dunkeln inkubiert. </li></ol></li><li> Zweimal mit PBS waschen Sie die Proben (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben). </li><li> Einmal mit Fließpuffer waschen (siehe Abschnitt 3.5). </li><li> Wieder die Zellen in ungefähr 150 &amp; mgr; l Fließpuffer und von der Strömungs analysieren Cytometer. </li></ol><img alt="4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4. Co-Färbung der Oberfläche und intrazellulären Proteinen. Durchflusszytometrie Daten veranschaulicht einen Vergleich zwischen primären + Sekundärantikörperbasis gegen Zenon Fluorescein basierende intrazelluläre Färbung in Kombination mit Oberflächenfärbung. Exclusive Positivität auf der y-Achse (obere linke Quadrant) und der x-Achse (untere rechte Quadrant) zeigt Zellen, die für MAP2 und CD24, angefärbt. Nach Co-Färbung kann geteilt MAP2 und CD24 Expression in der oberen rechten Quadranten (rechte Bilder) zu sehen. Vergleich mitAlexa Fluor 488. (Oben; AF488) gegenüber Zenon Fluorescein (unten) für MAP2-Markierungsausbeuten ähnliche Ergebnisse <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 6. Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Zuführen durchflusszytometrische Analyse unmittelbar nach der Beendigung des Färbeprotokoll mit einem Durchflusszytometer mit entsprechenden Filtern zur Signalerkennung. Verwenden 488 nm blau und rot 640 nm Laser mit FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) und FL-4 (675/25) Bandpassfiltern. </li><li> Up Haupttore auf der Grundlage der nach vorn und Seitenstreuung ohne Schmutz und abgestorbene Zellen ein. </li><li> Stellen Fluoreszenz Tore für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen ≤0.5% bezogen auf den nicht markierten Proben und die Entschädigung für spektrale Überlappung mit einzelnen Bunt Kontrollen. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte bestehen.

Die hier vorgestellte Protokoll ist für neuronale Zellkulturen aus menschlichen Stammzellen gegründet, kann aber auch für andere neurale Zellquellen angewendet werden, einschließlich primärer Gewebe oder neuronalen Zelllinien. Neben embryonalen Quellen kann neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen aus den neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns 27 extrahiert werden. Außerdem Durchflusszytometrie und FACS kann genutzt werden, um zu quantifizieren, zu analysieren und zu isolieren verschiedenen Zellpopulationen ...

Durchflusszytometrie wurde ausgiebig in der Immunologie, Hämatologie und Onkologie ausgenutzt, um Zellpopulationen über Eigenstreueigenschaften, Zelloberflächen-Antigen-Expression und andere Fluoreszenzparameter 1-3 definieren. Unsere Erkenntnisse über Blutslinie Entwicklung und Krankheit sind das Ergebnis in erheblichem Maße von der kontinuierlichen Verfeinerung dieser Methode nach ihrer erstmaligen Anwendung 4,5. Bewusstsein für die quantitative und die allgemeine analytische Potenzial der Durchflusszytometrie wurde vor kurzem aufgefordert seine weitere Verbreitung in der Stammzellforschung und können ähnlich tiefgreifende Fortschritte in einem kürzeren Zeitrahmen 6 zu ermöglichen. Allerdings ist die Anwendung der Durchflusszytometrie gezielt zu analysieren und zu isolieren, neuronale Populationen solange anspruchs wahrgenommen. Im Gegensatz zu den blutbildenden Zellen, die natürlicherweise in Suspension vorhanden sind, werden neuronalen Zelltypen in der Regel durch zu komplexe Quellen, die Glia und verschiedene o umfassen können geerntetther umgebenden Zellen sowie ein dichtes Netz von Prozesstragenden Neuronen. Folglich hat noch Neurobiologie, um die Vielseitigkeit der Durchflusszytometrie auf seine vollständige Potential im täglichen Forschungsroutinen implementieren. Jedoch solange eine tragfähige Einzelzellsuspension erzeugt werden können (und Protokollen entwickelt worden und zu diesem Zweck optimiert 7), Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann als wertvoller Bestandteil des analytischen Repertoire der Neurobiologie werden 8-11. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Abbildung 1. Prinzip der Durchflusszytometrie und Komponenten von einem Durchflusszytometer Durchflusszytometer umfassen drei Hauptsysteme: Fluidtechnik, Optik und Elektronik. Eine stromlinienförmige Strömung der Zellen in Suspension wird durch die Hülle flui erreicht (von primärem Gewebe oder in vitro-Kultur hergestellt)d mittels hydrodynamischer Fokussierung, die Einschränkung der Probe zu seiner Mittelkern. Die optischen Teile sind von Lasern, die den Strom von Zellen und optische Filter, die das Signal an den entsprechenden Detektoren lenken beleuchten zusammensetzt. Die festgestellt werden, um elektronische Signale, anschließend von einem Computer verarbeitet und auf einem Monitor für die Datenanalyse und Gating visualisiert Lichtsignale umgewandelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Benutzer von durchflusszytometrischen Methoden profitieren von mindestens einem grundlegenden Verständnis der zugrunde liegenden Fundamentaldaten einschließlich Bausteine ​​eines Zytometer (für einen Überblick siehe 12,13; siehe auch Abbildung 1). Ein Laserstrahl schneidet mit einem hydrodynamisch fokussiert fluidischen Strom, der die Zellen in Suspension, die wiederum durch den Laserstrahl in &#39;Datei&#39; eine nach der anderen vorbei enthält. Die interceptiauf einer Zelle (oder einer anderen Partikel, in diesem Fall) mit den Laser-Ergebnisse bei der Streuung von Licht, das von diesem Abfragepunkt. Streulicht kann in Weiterführung der Laserrichtung (Vorwärtsstreuung, wobei die Größe der Teilchen verbunden ist), als auch senkrecht zu seiner Verschieberichtung detektiert werden (side scatter; Reflektieren des granulosity der Partikel / Zelle). Diese zuvor genannten Streueigenschaften erfordern keine spezielle Kennzeichnung, weshalb ein unmarkierter Probe (oder auch Zelltrümmer, Luftblasen, etc.) ein Signal (event) auf der bivariate Vorwärtsstreuung im Vergleich zu Seitenstreudiagramm üblicherweise zur ersten Gating verwendet zu generieren. Unter Verwendung der entsprechenden Laser und die spezifisch für die entsprechende Anregungs- und Emissionsspektren Filter kann eine Zelle für seine Positivität, Intensität oder Abwesenheit von Fluoreszenzmarkern analysiert werden. Die Mehrheit der Durchflusszytometrie-Anwendungen haben sich auf die Charakterisierung über Zelloberflächenantigene gerichtet. Im Gegensatz zu den hämatopoetischen LineagE hat die neuronalen Linie nach Oberflächen Epitop Expressionsmuster 5 blieb weniger ausführlich definiert. Ein Vorteil der Nutzung von Oberflächenantigenen ist, dass lebende Zellen unterzogen, um das Sortieren Paradigmen, wie FACS-Zelle sein. Im Gegensatz dazu intrazelluläres Antigen-Färbung erfordert Fixierung und Permeabilisierung Schritte, um die Epitop-Antikörper-Wechselwirkung vermitteln, ausschließt nachgelagerten Anwendungen, die lebensfähige Zellen erfordern. Der Hinweis, derartige Ansätze noch für zahlreiche quantitative Assays 14 sowie Downstream-Analysen von RNA und Protein-Expression 15 ermöglichen. Hämatologie, Immunologie und Onkologie haben oft zusammen verwendet mehr als ein Dutzend Marker für bestimmte Subpopulationen 16 zu definieren. Darüber hinaus können Massen Zytometrie oder CyTOF jetzt zur Analyse von bis zu 30 Parameter gleichzeitig 17,18 werden. Für neurale Stammzellen Anwendungen sowie Primärkulturen 14,19,20 die Heterogenität von Zellenvitro ist ein häufiges Phänomen 21-23. Die Zellen, die nicht die Zielgruppe von Interesse verkörpern eine potentiell verwirrenden Faktor für experimentelle Auslesen 24,25. Günstig sind die verschiedenen zellulären innerhalb einer heterogenen Zellsuspension vorliegenden Teilmengen tragen distinct (bekannt oder noch zu entschlüsseln) Antigen-Expressionsprofile, die verwendet werden können, um diese verschiedenen Populationen zu definieren. Durchflusszytometrie kann daher eine entscheidende Rolle bei der Lösung von zellulärer Heterogenität und damit zu erleichtern biomedizinische Anwendungen (in vitro-Assays, Zelltherapie) und optimieren quantitative Auslesen durch die Konzentration auf die wichtigsten Teilmenge 24,26. Verschiedene Oberflächenantigenkombinationen wurden in den letzten Jahren erkannt worden, die Quantifizierung und Isolierung von bestimmten neuronalen Zelltypen ermöglichen. Dies beinhaltet CD133 zur Anreicherung von neuralen Stammzellen 27, eine Kombination aus den CD15 / CD24 / CD29-Oberflächenantigene für die Isolierung von NSC, Differenzierungten Neurons und Neuralleistenzellen 28 oder CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 auf neuronale und gliale Teilmengen 25, unter anderen Signaturen 29,30 isolieren. Jenseits Neuronen, Glia Marker umfassen A2B5 31, CD44 25, NG2 32 und GLAST 33. Eine aktuelle Publikation hat die Mittelhirn Bodenplatte Vorläufer Marker CORIN 34,35 für dopaminerge Vorstufen in Parkinson Zelltransplantation bereichern genutzt Paradigmen 36. CD-Moleküle sind nicht nur Marker, sondern funktionell relevante Mediatoren von Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Fähigkeit einer Zelle, auf Hinweise von extrazellulären Matrixmolekülen reagieren und Wachstumsfaktoren 37. Eine Strategie, die weitere Verbesserung der Arsenal von kombinatorischen CD-Antigene zu charakterisieren neuronalen Linie Entwicklung ist es, bekannte intrazelluläre Marker verwenden, um für einen bestimmten Zelltyp von Interesse zu screenen und zu definieren CD Antigenkombinationen. Vor kurzem haben wir ausgenutzt solchen Ansatz und identifiziert CD49f - / CD200 hochkombiExpressionsMuster als neuer Ansatz zur Anreicherung von neuronalen Teilmengen von neural differenzierten induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkultursystemen 38. Hier sind und die letztere Protokoll (und optionalen Varianten davon), in der Oberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung gleichzeitig zur Definition neuronaler Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden diskutieren wir. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Abbildung 2: Flussdiagramm des Versuchsprotokoll-Optionen. Die Figur zeigt eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte im Protokoll beteiligt. Optionale Schritte (CFSE Farbstoff oder intrazelluläres Antigen Kennzeichnung) sind je nach hellgrau-Boxen angezeigt. Nach der Ernte wird es notwendig, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl von neuronalen Zellsuspensionen vor der Zelloberflächenfärbung beurteilt. Positive wiesowie negative Kontrollen müssen zusätzlich zu den Proben von Interesse sein sollte. Die Proben können durch Durchflusszytometrie analysiert und / oder in Zellsortierung Paradigmen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Während wir zuvor verwendeten primären Antikörper in Kombination mit sekundären Antikörper für die intrazelluläre Färbung 38 führen wir nun nicht kovalente Markierung des primären Antikörpers durch Fluoreszenz-Fab-Fragmente (Zenon Kennzeichnung) als geringfügige Veränderung, wodurch die Schritte der Bearbeitung der Zellen 39 verringert wird. Außerdem ist als weiteres Beispiel für das Protokoll der Vielseitigkeit, nutzen wir ein optional Kennzeichnung einer Versuchsmenge von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) vor der Oberflächenantigen-Färbung. Solche CFSE vorge Kennzeichnung ermöglicht die sofortige direkten Vergleich zweier Zelllinien oder experimentellen Bedingungen (Vs CFSE-markierten. unmarkiert) innerhalb eines einzelnen Probenröhrchen, die Verringerung Varianz oder feine Unterschiede in der Inkubationszeit und Speichern Antikörper. CFSE ist ein etablierter Fluoreszenz-Farbstoff, der üblicherweise für Zellverfolgung 40 verwendet wird, bei der Proliferation 41,42 und Strichcodes Experimenten 43,44. Schließlich, während eigentliche Sortierschritte (FACS, immunomagnetischen Zelltrennung oder Immunopanning) sind nicht Teil des Protokolls im Prinzip die hier beschriebenen Ernte und Kennzeichnungsverfahren liefern zwar Proben, ausgesetzt sind, können an die Oberfläche Antigen oder die intrazelluläre Markierung basierte Sortieranwendungen werden 15 25,28. Mit diesem Artikel wollen wir: Zusammenfassend eine tragfähige Oberflächenantigen Färbeprotokoll 25,28 fassen ein Protokoll zum Nachweis von intrazellulären Ziele sowie kombinierte Oberflächen- und intrazelluläres Antigen Analyse 38, präsentieren eine intrazelluläre Farbstoff CFSE Markierungsschritt 41,45 als experimentelle Option für comvergleichende Analysen von neuronalen Zellpopulationen, und fassen Ansätze zur zytometrische Analyse (geeignete Kontrollen 13,46, Gating-Strategie und Datendarstellung 47) fließen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/Nährstoffmischung F-12)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum, qualifiziert, von der EU zugelassen, Herkunft Südamerika (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Detergens</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenfilter mit Schraubverschluss, Express Plus 0,22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturgefäße (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturgefäße (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Kegelröhrchen (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Kegelröhrchen (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette, Glas (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (0,1–10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1–200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (100–1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (2,0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD24 APC monoklonaler Antikörper</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Arbeitsverdünnung 1:50</td></tr><tr><td>Anti-Human CD54 PE monoklonaler Antikörper</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Arbeitsverdünnung 1:50</td></tr><tr><td>Neuronaler Klasse-III-&amp;beta;-Tubulin-(Tuj1)-polyklonaler Antikörper</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Arbeitsverdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel anti Kaninchen</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Arbeitsverdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Zenon&amp;reg; Fluorescein Kaninchen-IgG-Markierungs-Kit</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Zählkammer nach Neubauer, verbessert</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Durchflusszytometer</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Orbital-Schüttler, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Sicherheitswerkbank der Klasse II, Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Inkubator, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumsystem, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette, Pipetman neo P20N (2–20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette, Pipetman neo P200N (20–200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette, Pipetman neo P1000N (100–1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry protokolle für oberflächen- und intrazelluläre antigen analysen neuronale zelltypen

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Die Durchflusszytometrie wurde ausgiebig zur Definition von Zellpopulationen in der Immunologie, Hämatologie und Onkologie eingesetzt. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung von Protokollen für die durchflusszytometrische Analyse des Clusters von Differenzierungs-Oberflächenantigenen (CD) und intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Unsere Schritt-für-Schritt-Beschreibung der methodischen Vorgehensweisen umfasst: die Ernte von neuralen in vitro-Kulturen, einen optionalen Schritt der Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Markierung, gefolgt von der Oberflächenantigenfärbung mit konjugierten Zöliakie-Antikörpern (z.B. CD24, CD54) und dem anschließenden intrazellaren Antigennachweis über Primär-/Sekundärantikörper oder fluoreszenzmarkierte Fab-Fragmente (Zenon-Markierung). Das Video zeigt die wichtigsten Schritte. Darüber hinaus werden die Prinzipien der experimentellen Planung, die Einbeziehung kritischer Kontrollen und die Grundlagen der durchflusszytometrischen Analyse (Identifizierung der Zielpopulation und Ausschluss von Debris; Gating-Strategie; Kompensation spektraler Überlappung) kurz erläutert, um Neurobiologen mit begrenzten Vorkenntnissen oder spezifischer Ausbildung in der Durchflusszytometrie in die Lage zu versetzen, ihren Nutzen zu beurteilen und diese leistungsstarke Methodik besser zu nutzen.

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt vielseitige experimentelle Ansätze (Abbildung 2). In seiner kürzesten Ausführung (Schritte 1, 3 und 6), kann es als eine Führung für einfache Färbung von Oberflächenantigenen ist. In seiner komplexeren Form kann eine Reihe von Co-Kennzeichnung Paradigmen mit einer Reihe von intrazellulären Antigenen (optional Schritte 2 und / oder 4 bis 5) fortgesetzt. Darüber hinaus ist die CFSE-...

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen und/oder intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Kritische Aspekte der Versuchsplanung, methodische Schritte und grundlegende Prinzipien der Durchflusszytometrie werden erläutert, um Neurobiologen in die Lage zu versetzen, diese leistungsstarke Technologie zu nutzen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen auf Nervenzellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Nervenzellen entweder aus In-vitro-Kulturen oder aus primärem Nervengewebe geerntet werden. Anschließend wird eine optionale unspezifische intrazelluläre Färbung auf die Zellen aufgetragen.Dann werden die gewünschten Oberflächenantigene sofort mit einem primären Antikörper markiert, während die gewünschten intrazellulären Antigene nach zellulärer Fixierung und Permeation markiert werden. Letztendlich können Ergebnisse durch die Verwendung einer durchflusszytometrischen Analyse zur Co-Expression der Oberflächenantigene auf spezifischen neuronalen Subpopulationen von Interesse erzielt werden, wie sie durch intrazelluläre Markierung definiert sind. Dieses Protokoll wird demonstrieren, wie aus Gewebekulturen gewonnene Nervenzellen für die Abfrage von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen mit mehrfarbiger Durchflusszytometrie vorbereitet werden können.Zu Beginn der Ernte adhärente Nervenzellen, die in T-75-Kolben gezüchtet werden, indem die Zellen zunächst einmal vorsichtig mit fünf Millilitern magnesium- und kalziumfreiem PBS bei Raumtemperatur gewaschen werden. Dann lösen Sie die Zellen aus dem Kolben, indem Sie drei Milliliter Trypsinersatz hinzufügen, und inkubieren Sie sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Quälen Sie den enzymatischen Verdau, indem Sie sechs Milliliter Fließpuffer hinzufügen, nachdem Sie die Zellklumpen gelöst haben, indem Sie die Zellsuspension einige Male auf und ab pipettieren, und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen, um die Zellen zu isolieren.Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge, schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur herunter und aspirieren Sie die Snat, um sie für die intrazelluläre Farbstoffmarkierung vorzubereiten. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut mit fünf Millilitern PBS plus 0,1 % BSA. Andernfalls fügen Sie fünf Milliliter Fließpuffer in Verbindung mit dem Standard-Trianblau-Färbeprotokoll hinzu.Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die effektive Anzahl lebensfähiger Zellen abzuschätzen. Stellen Sie die Zellkonzentration der vorhandenen Suspension auf 1 Million lebensfähige Zellen pro Milliliter mit dem gleichen Puffer ein, der im vorherigen Schritt verwendet wurde. Diese Zellen sind nun bereit für zwei Färbeoptionen, eine Oberflächenantigen-Antikörperfärbung oder eine optionale fluoreszierende intrazelluläre Färbung mit Carboxyfluorescein, gefolgt von der bereits erwähnten Oberflächenantigenfärbung.Um einen intrazellulären Markierungsschritt mit Carboxyfluorescein CIN-Ester-Farbstoff durchzuführen, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter CFSE-Stammlösung hinzu. Für jeden Milliliter Zellsuspension legen Sie das Röhrchen bei 200 U/min auf einen Schüttler und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang. Verhindern Sie bei Raumtemperatur Photobleichung, indem Sie die Tube vor direkter Lichteinwirkung schützen.Schrecken Sie alle nicht reaktiven Farbstoffe ab, indem Sie fünf Volumen Serum mit Flow-Puffer hinzufügen und zum Mischen einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren. Schleudern Sie dann die Zellen fünf Minuten lang in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur herunter und aspirieren Sie den Überstand, um Reste von nicht reaktiven Farbstoffen zu entfernen. Waschen Sie das Zellpellet durch Reanimation und suspendieren Sie es mit fünf Volumina Flusspuffer.Anschließend werden die Zellen in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur noch einmal fünf Minuten lang heruntergeschleudert, bevor das SUP-Nativmittel entsorgt wird. Zum Schluss wird das Zellpellet wieder mit einem Durchflusspuffer suspendiert, so dass die endgültige Zellkonzentration 1 Million lebensfähige Zellen pro Milliliter beträgt. Für ein Multiplex-Experiment fügen Sie der CFSC-gefärbten Zellsuspension die gleiche Anzahl von ungefärbten Zellen von Interesse aus einer anderen Versuchsbedingung hinzu.Die Zellen sind nun bereit für die Markierung von Oberflächenantigenen mit Antikörpern, um mit der Färbung der Zelloberfläche zu beginnen. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension mit oder ohne CFSC-Markierungen in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie der Zellsuspension konjugierte Fluor-4-Antikörper in einer Menge hinzu, die zuvor durch Antikörpertitrationstests bestimmt wurde.Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang. In Abwesenheit von Licht verdünnen Sie das Antikörpergemisch durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu mischen und in einer vorgekühlten Mikrozentrifuge mit vier Grad Celsius vier Minuten lang zu schleudern.Aspirieren Sie das Supinat, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und wiederholen Sie diese Waschzentrifuge und Aspiration. Treten Sie noch einmal einen Schritt ein. Reus suspendiert das Zellpellet in 100 Mikrolitern einen Flusspuffer zu den zuvor gefärbten Zellen.Geben Sie 500 Mikroliter des Fixierpuffers zu 100 Mikrolitern der Zellsuspension. Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Dunkeln. Das Formaldehyd vernetzt alle Protein- und DNA-Spezies, die sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, und liefert nicht lebensfähige Zellsuspensionen.Verdünnen Sie die Fixiermischung, indem Sie einen Milliliter PBS hinzufügen und zum Mischen einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren. Dann schleudern Sie die fixierten Zellen in einer vorgekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für drei Minuten herunter. Aspirieren Sie das Supinat so, dass 100 Mikroliter Flüssigkeit über dem Zellpellet verbleiben, um die Zellmembran für die anschließende intrazelluläre Antigenmarkierung zu permatisieren.Geben Sie 500 Mikroliter Permeationspuffer zu 100 Mikrolitern Zellsuspension. Stellen Sie das Röhrchen bei 100 U/min auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Dunkeln. Verdünnen Sie die Permeationsmischung durch Zugabe eines Milliliters PBS, pipettieren Sie einige Male vorsichtig auf und ab, um die fixierten Zellen in einer vorgekühlten Zentrifuge mit vier Grad Celsius zu mischen und drei Minuten lang herunterzuschleudern.Aspirieren Sie die SUP-Natante vor der Inkubation vollständig. Bereiten Sie ein Arbeitsmaterial für Primärantikörper vor, indem Sie den Antikörper in einem PBS plus 0,5 %Tween 20 Puffer verdünnen. Das ist entweder mit 1 % BSA, 10 % Eselsserum oder 10 % Ziegenserum angereichert.Anschließend wird das membrandurchlässige Zellpellet mit 100 Mikrolitern des primären Antikörper-Arbeitsmaterials resuspendiert. Stellen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur bei 200 U/min auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie es 30 Minuten lang im Dunkeln. Verdünnen Sie das Primärantikörpergemisch durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer.Pipettieren Sie einige Male vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu mischen und in einer vorgekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius vier Minuten lang zu schleudern. Aspirieren Sie das Supinat vollständig, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern des Sekundärantikörper-Arbeitsmaterials.Wiederholen Sie die Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur für 30 Minuten. Verdünnen Sie das Sekundärantikörpergemisch im selben Schüttler durch Zugabe von einem Milliliter Fließpuffer. Wiederholen Sie das gleiche Mischen der Röhreninversion, das Schleudern und das Entfernen des Überstands, um alle ungebundenen Antikörper zu eliminieren.Wiederholen Sie die gleichen Schritte der Waschzentrifugation und der Entfernung des Überstands von einem Milliliter zwei weitere Male, jedoch mit frischem PBS als Waschpuffer. Stattdessen wird das Endergebnis ein sauberes Zellpellet sein, das entweder mit extrazellulären oder intrazellulären fluoreszierenden CFSC-Antikörpern oder einer beliebigen Kombination der drei Resuspendierungen markiert ist, das markierte Zellpellet in 150 Mikrolitern Flusspuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Durchflusszytometer und beginnen Sie die Analyse mit den entsprechenden Einstellungen für Laseranregung und Emissionsfilter für jede Viereretage.Unter Verwendung der Vorwärts- und Seitenstreudaten als Leitfaden wurde in der Durchflusszytometrie-Analysesoftware eine anfängliche Vorwärts- und Seitenstreuung eingerichtet, um unspezifische Datenpunkte wie Zelltrümmer und tote Zellen auszuschließen. Als nächstes richten Sie unter Verwendung von Rohdaten aus einer ungefärbten Zellsuspension als Negativkontrolle mehrere Fluoreszenzintegrationsgates ein, die positive Emissionssignale sowohl von extrazellulären als auch von intrazellulären Antigenmarkierungen auswählen, um die Hintergrundfluoreszenz von mehrfarbigen Markierungen zu berücksichtigen. Spektrale Überlappungseffekte passen die Fluoreszenz-Gates unter Verwendung von Rohdaten von Einzelantikörper-gefärbten Kontrollen neu an.In einem Multiplex-Faxexperiment können Carboxyfluorescein-Tags als Ausgangssignal verwendet werden, das ohne die Verwendung eines Antikörpers zwischen Zellen aus zwei verschiedenen Abstammungslinien oder experimentellen Bedingungen unterscheiden könnte. Zum Beispiel kann man in einer heterogenen Zellsuspension sofort zwischen Nervenzellen, die mit CFSC markiert sind, und nicht markierten Fibroblasten unterscheiden, indem man sich einfach das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz im grünen Kanal ansieht. Darüber hinaus kann man in Verbindung mit der CFSE-Esther-Markierung fluoreszierende Antikörper verschiedener Farben verwenden, um die differentielle Expression von Oberflächenantigenen zwischen den CFSE-markierten und unmarkierten Untergruppen innerhalb einer gemischten Probe zu bestimmen.Zum Beispiel exprimierten SHSY-Fünf-Y-Neuroblastomzellen, die mit CFSE im grünen Fluoreszenzkanal markiert waren, hohe Spiegel des CD-24-Oberflächenantigens, aber nicht des Fibroblastenmarkers CD 54. Im Gegensatz dazu sind CFSC-negative BJ-Fibroblasten positiv für CD 54 mit niedrigeren CD 24-Spiegeln.Kombinatorisch. Die Analyse von neuronalen Oberflächenantigenen kann auch in Verbindung mit dem Antikörper-basierten Nachweis von intrazellulären Antigenen durchgeführt werden.Die Einbeziehung von ungefärbten Proben und einfach gefärbten Kontrollen für Oberflächenantigene und intrazelluläre Antigene ist als Alternative zur primären und sekundären Antikörper-basierten Markierung von intrazellulären Antigenen, wie z. B. die hier gezeigte neuronale Markerkarte zwei, von entscheidender Bedeutung. Die nicht-kovalente Fluoreszenzmarkierung des Primärantikörpers kann vergleichbare Ergebnisse in der Co-Expressionsanalyse liefern und das Protokoll verkürzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie neuronale Zellen für die grundlegende durchflusszytometrische Analyse mit verschiedenen alternativen Markierungsansätzen und Kombinationen davon vorbereiten können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Quelle: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-freie Generierung von neuronalen Zellen aus dem Blut. J. Vis. Exp. (2021)Das Video demonstriert ein Protokoll zur Vorbereitung von Nervenzellen, die aus reprogrammierten peripheren Blutzellen gewonnen wurden, für die Fluoreszenzmikroskopie, wobei unterschiedliche Zelltypen und Entwicklungsstadien durch Immunfluoreszenzbildgebung dargestellt werden.

Immunfluoreszenzmikroskopie von Nervenzellen, die von peripheren Blutzellen differenziert werden 

Quelle: Hidmark, A. S., et al. Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischiasnerven und Spinalwurzelganglien von einer einzelnen Maus mittels Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Dieses Video zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in Ischiasnerven der Maus und Spinalganglien (DRGs). Der Prozess umfasst die Markierung von Immunzellen mit Fluorophor- und Biotin-markierten Antikörpern, die Stabilisierung und Permeabilisierung der Zellen und die...

Analyse von Immunzellen im Nervengewebe der Maus mittels Durchflusszytometrie

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik zu verwenden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, epigenetischen Markern und/oder Proteinexpression zu sortieren.

Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Dieses Protokoll beschreibt Strategien zur Identifizierung und Anreicherung des Zellzustands in primären neuralen Stammzellkulturen adulter Mäuse durch Autofluoreszenzbildgebung unter Verwendung i) eines konfokalen Mikroskops, ii) eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers zur Durchführung einer Intensitätsbildgebung oder iii) eines Multiphotonenmikroskops zur Durchführung einer Fluoreszenzlebensdauerbildgebung.

Klassifizierung des Aktivierungszustands neuraler Stammzellen in vitro mittels Autofluoreszenz

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen in neuronalen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht Neurobiologen die Identifizierung spezifischer neuraler Subpopulationen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

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