Name: Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Charakterisierung von Stammzellen mittels High-Content-Screening für neuroprotektive Strategien. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellverhalten und Proliferation in Echtzeit.

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Die Finanzierung dieser Forschung wurde vom US Army Medical Research and Materiel Command (Förderkonto-Nr. W81XWH-11-1-0700) und dem Stem Cell Research Fund bereitgestellt. PAB und EMP waren Empfänger von Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Untergrundvorbereitung für 96-Well-Platten <ol><li> Erstellen Sie eine Karte von der 96-Lochplatte umreißt die verschiedenen Substrate und Zelltypen zu (Abbildung 1) untersucht werden. </li><li> Besorgen Sie sich die Stammlösungen von unterschiedlichen Substraten [Poly-L-Lysin, Fibronektin, Kollagen Typ I, Laminin und Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL)], ein 96-Loch-Multiwellplatte und erstellt einen Arbeitsplatz in einem sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Planen einzelner Substrate durch Verdünnen Lager in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 5 ug / ml (diese Konzentration wurde zuvor basierend auf einer Substratkonzentration abhängigen Assay für Wachstum und Vermehrung der Zellen bestimmt). Mischen mit einem Vortex vor dem Gießen in einen sterilen Behälter. </li><li> 100 l Substratlösung in jede Vertiefung nach dem 96-Loch-Karte (Abbildung 1) (a 12- oder 8-Kanal Mikropipette ist für Mikropipettieren in eine Platte mit 96 Vertiefungen). Verschließen Sie den Deckel auf die 96-Lochplatte mit einem Streifen Parafilm und über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 2. Zell Plating und Zeitraffer-Imaging HINWEIS: Maus-MSCs wurden aus dem Knochenmark von Erwachsenen C57BL / 6-Mäusen isoliert und als adhärente Zelllinie beibehalten wird. Und Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF; menschliche cDNA) unter Verwendung von lentiviralen Vektors kodiert BDNF (LV-BDNF;; MSCs wurden mit lentiviralen Vektoren, sie zu konstruieren, um dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (human cDNA BDNF) sekretieren infiziert CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). HINWEIS: Die Kulturmedien für Maus mesenchymale Stammzellen (MSCs) ist Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium, das 10% Hybridom-qualifizierte fötalem Rinderserum, 10% Pferdeserum, 2 mM L-Glutamin und 10.000 U / ml Penicillin, 10 mg / ml Streptomycin . Die fünf verschiedenen Arten von Maus-MSCs (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden bei etwa 30% Konfluenz in T75 Zellkulturflaschen ausplattiert. <ol><li> Zelle Plating <ol><li> Am folgenden Tag, nehmen Sie die Substratlösungen durch Aspiration und spülen Sie jede Vertiefung mit etwa 200 ul sterilem PBS, zweimal. Hinzufügen Zellkulturmedien (200 ul / Vertiefung) in jede Vertiefung nach dem letzten PBS spülen. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für die Gleichgewichtseinstellung eingestellt. </li><li> (Bezeichnet als konditioniertes Medium), während der 96-Well-Platte wird in den Inkubator Äquilibrieren, Ernte der Zellen durch das Sammeln des Wachstumsmediums (MSCs in T75 Kolben sollten etwa 70% konfluent Zeitpunkt der Ernte / Beschichtung sein kann) von der T75-Kolben und Speichern in einem 15 ml konischen Röhrchen unter sterilen Bedingungen (das konditionierte Medium wird im Schritt 2.1.4) verwendet werden. </li><li> In 8 ml sterilem PBS in den Kolben und schwenken Sie dann pipettieren Sie das PBS und 1 ml 0,05% Trypsin und 0,01%EDTA-Lösung, um die Zellen von der Kulturoberfläche des T75-Kolben zu lösen. Überwachen Zellablösung durch Betrachten der Kolben unter Verwendung eines Umkehrmikroskops mit Phasenkontrastoptik ausgestattet. </li><li> Wenn die Zellen abgenommen, sofort 8 ml der konditionierten Medien (in Schritt 2.1.2 gesammelt) in den Kolben. Sammeln Sie die Zellsuspension und Transfer zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 4 Minuten bei 450 · g, um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 200 &amp; mgr; l frisch und erwärmt (37 ° C) Zellkulturmedien. </li><li> Bestimmen der Anzahl der Zellen in der Zellsuspension durch Ausführen einer Trypanblau Lebendzellzahl unter Verwendung eines Hämocytometers. Platte, die Zellen in einer Dichte von etwa 300 Zellen / Vertiefung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für jede Population von Zellen. </li></ol></li><li> Zeitraffer-Imaging <ol><li> Sobald alle MSCs wurden vernickelt, OrtDie 96-Well-Platte in einen Inkubator für 2 h, damit sich die MSCs an dem Substrat zu befestigen. </li><li> Starten Sie den HCS-System und warten Sie 2 Stunden für das System ins Gleichgewicht kommen. Setzen Sie den Umgebungsregler auf 37 ° C und eine Verbindung eines Mischgases Zylinder, enthaltend 5% CO 2 in Luft zu dem HCS System Umgebungskammer Zuführen eines konstanten Luftquelle. </li><li> Entfernen Sie den 96-Well-Platte aus dem Inkubator nach 2 h Äquilibrierungsperiode und legen Sie direkt in die Zellwachstumskammer des HCS-System. Lassen Sie 30 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung aus irgendeinem wärmebedingte Ausdehnung der Platte Konto und starten Sie die Bildaufnahme und Analyse-Software, um die Platte zu konfigurieren. </li><li> Wählen Sie das 20X Ziel für die Bildgebung. Wählen Sie zwei Vertiefungen pro Bedingung [dh GFP-MSCs auf Fibronektin usw. (6 Substraten x 5 MSC Subtypen für insgesamt 30 Bedingungen x 2 Wiederholungen = 60 Bohrungen insgesamt)] für den Aufbau Zeitraffer-Bildgebung. Wählen Sie zwei Standorte für die Bildgebung mitin jede Vertiefung. </li><li> Wählen Sie die richtige Lichtwellenlängen für die Bildgebung. HINWEIS: Zwei verschiedene Wellenlängen (Phasenkontrast und GFP-Fluoreszenz) wurden für Zeitraffer-Bildgebung ausgewählt. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Well-Boden mit Laserautofokus und nehmen Sie Testbilder für mehrere Standorte und mehrere Brunnen, um eine optimierte Brennebene zu finden. </li><li> Sobald der Fokus festgelegt wurde, beginnt die Aufnahme von Bildern alle 5 min für 48 Stunden für alle 60 Bohrlöcher (120 Websites). </li><li> Feed the Zellen alle 24 Stunden durch das Entfernen der Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Entfernen 75 ul Medium aus jeder Vertiefung werden 100 ul frisches Medium zu jeder Vertiefung (äquilibrieren dieses frischem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2). </li><li> Am Ende des Zeitraffer-Experiment, entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Unter sterilen Bedingungen sammeln die konditionierten Medienproben aus jeder Vertiefung und übertragen diese Proben auf eine andere Platte mit 96 Vertiefungen. HINWEIS: Diese Proben können für die weitere Analytik eingesetzt werdenwird durch Ausführen ELISA für neurotrophe Faktoren. </li><li> Bereiten Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit kultivierten MSCs für weitere Tests, wie Ki67-Zellproliferationstest oder Propidiumiodid Live / Dead Färbeassay (Details siehe unten). </li><li> Führen Sie Zeitraffer-Imaging-Analyse für die Zellmigration / Zellverfolgung wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 Zellproliferation und Propidiumiodid Live / Dead-Assay <ol><li> Ki67 Cell Proliferation Assay (Immunzytochemie) <ol><li> Spülen der Zellkulturen mit 0,1 M Phosphat (PO 4) Puffer für eine Minute zweimal. Befestigen Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS sieben Minuten drei Mal. </li><li> Nach der letzten Spülung 100 l Blocker-Lösung (Phosphatpuffersalzlösung, 5% normalem Eselserum, 0,4% Rinderserumalbumin und 0,2% Triton X-100) in jede Vertiefung einnd Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Vorbereiten des primären Antikörpers, Kaninchen-Anti-Ki67, durch Verdünnen in Blocker-Lösung bei einem Bearbeitungsverhältnis von 1: 200. </li><li> Entfernen den Blocker-Lösung und gelten 100 ul des primären Antikörperlösung in jede Kammer. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Inkubieren der Proben bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag, nehmen Sie die Antikörperlösung und mit PBS spülen für 7 min, 3-mal. </li><li> Vorbereiten des sekundären Antikörper, Esel Anti-Kaninchen-Cy3 in Blockierungslösung bei einem Arbeitsverhältnis von 1: 500. Hinzufügen DAPI Kernfärbung auf die Sekundärantikörperlösung bei einer Verdünnung von 1: 100. Nach der Entfernung des letzten PBS spülen gelten 100 ul des sekundären Antikörper / DAPI-Lösung zu jedem Well. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 90 min. </li><li> Entfernen Sie den sekundären Antikörper / DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol></li><li> Propidium Iodid Live / Dead-Assay <ol><li> Messen Zelltod durch Propidiumjodid (PI) Ausschluss-Assay, wie unten beschrieben. </li><li> Bereiten Sie die Propidiumiodid-Färbung Lösung bei einer Konzentration von 1,5 uM in Kulturmedien. </li><li> 100 l 70% Ethanol, um eine Vertiefung der MSCs für 2 Minuten mit der Absicht, diese Zellen zu töten. Dies dient auch als eine positive Kontrolle für die PI-Färbung. Der Großteil der MSCs werden PI-gefärbte Angabe Zelltod sein. Entfernen Sie die Ethanollösung. </li><li> 100 l Propidiumiodid-Färbung Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Spüle die Zellen mit 0,1 M Phosphatpuffer für 1 min, 2 mal. Fixieren die Zellen mit 4% PFA in 0,1 M P0 4 Puffer für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und mit PBS spülen dreimal für 7 min. </li><li> Inkubieren mit DAPI-Lösung (1:50) in Blocker-Lösung 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Alle Vertiefungen mit SpülenPBS für 7 min, 3-mal. </li><li> Entfernen Sie die DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol></li></ol> 4. Automated Imaging und Multiwellenlängen Scoring Analyse <ol><li> Legen Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen (zuvor für Ki67 Immunmarkierung oder Propidiumiodid-gefärbten verarbeitet) in die HCS-System und damit die Platte für 20 Minuten ins Gleichgewicht Öffnen Sie die HCS-System-Image-Erfassung und Analyse-Software. </li><li> Wählen Sie die Einstellungen für den Erwerb 10X-Objektiv von der Kamera aus Binning bei 1 und eine Verstärkungseinstellung des 2. Suchen Sie die Z-Ebene, in der sich die Zellen befinden durch die Nutzung der automatischen Belichtungsfunktion und berechnet den Offset für jede Wellenlänge von Interesse. Für diese Analyse wurden die Aufnahmen für DAPI (W1), Cy3 (W2) und FITC (W3). Wählen Sie die maximale Intensität Ebene, auf der die Negativkontrollen zeigen kein Signal für die Bildaufnahme. Bestätigen Sie die Einstellung für die pos geeignet istitive Brunnen. </li><li> Erwerben Platte. Machen Sie Bilder und speichern sie in der Bildaufnahme und Analyse-Software-Datenbank. </li><li> Sobald Bilder erworben wurden, offene Bildaufnahme und Analyse offline Software und Überprüfung Platte Daten aus den obigen Bilder erworben. </li><li> Wählen Sie das Multi-Wellenlängen-Scoring-Analyse. Konfigurieren Sie die minimale und maximale Intensität für jede Wellenlänge. HINWEIS: DAPI Erkennung sollte die Färbung um jeden sichtbaren Kern markieren. Cy3 sollten die positiven Zellen mit Ki67 Immunreaktivität (IR) zu erkennen und sollte IR unter den negativen Kontrollen nicht erkennen. Cy3 Ki67 IR, die ungefähre minimale Breite betrug 7 &amp; mgr; m, ungefähre Maximalbreite betrug 30 &amp; mgr; m, wird die Intensität über dem lokalen Hintergrund betrug 150 Graustufen und die minimale Buntbereich betrug 50 &amp; mgr; m 2. </li><li> Führen Analyse für alle Positionen. Exportieren Sie die Daten in Spreadsheet anzuzeigen. </li></ol> 5. Zelltracking <ol><li> Bild öffnen Acquisition und Analyse-Programm und klicken Sie auf &quot;Bewertung Platte Daten [DB] ...&quot;, die Auswahl der Platte von Interesse. </li><li> Die Daten anzuzeigen, wie &quot;Time vs. Well&quot;. </li><li> Wählen Sie eine der Webseiten, die im Abschnitt &quot;Seiten&quot; auf der linken Maustaste auf die gewünschte Auswahl. Wählen Sie &quot;Übertragene ...&quot; unter den &quot;Wellenlängen:&quot;. Rechtsklick auf das Ziel auch in der 96-Well-Platte-Vorlage und klicken Sie auf &quot;Bilder laden&quot;. </li><li> Verfolgen Sie die Zellen, indem Sie auf den &quot;Apps&quot; und dann &quot;Track-Objekte&quot;. </li><li> Verwenden Sie &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot;, um das Format, um die Daten, zum Beispiel Microsoft Excel exportieren. </li><li> Wählen Sie die Tracking-Daten zu exportieren, zum Beispiel, vergangene Zeit, Objektnummer, Entfernung, Zeit-Intervall, Geschwindigkeit, absoluten Winkel, Entfernung zum Ursprung, Delta x und Delta y. </li><li> Tag jede Zelle von Interesse mit &quot;Strg-Taste + linke Maustaste&quot; auf den Zielzellen. </li><li> Track-Zellen. Stoppen Sie gegebenenfalls / ändern unsachgemäße Tracking von Zellen mit der Taste &quot;Esc&quot; und passen Sie die Einstellungen. </li><li> Nach Zellverfolgung abgeschlossen ist, speichern Sie Daten mit &quot;Protokolldaten&quot;. </li></ol>

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Adulte mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine attraktive Zelltyp für die Entwicklung einer experimentellen Strategie, die eine zelluläre und Genabgabe basierte Therapie. MSCs sind multipotent, zur Differenzierung zu Zellen mesodermalen Linie und zeigen erhebliche Plastizität, Differenzierungs / Transdifferenzierung zu neuronalen und glialen Linien mit der entsprechenden Induktions Paradigmen 17,18. Weiterhin MSCs transplantiert wurden und wirksam erwiesen in präklinischen Studien für eine Reihe von Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Bedingungen 19. Die therapeutische Wirksamkeit von MSCs ist gut aufgrund ihrer günstigen anti-proliferative, anti-entzündliche und anti-apoptotischen Aktivitäten 20 bekannt. MSCs sind ebenfalls bekannt, verschiedene neurotrophe und Wachstumsfaktoren, die trägt wahrscheinlich zu den neuroprotektiven Eigenschaften mit naiven MSCs nach der Transplantation an den Stellen der Verletzung oder Erkrankung 21 verbunden zu produzieren und zu sezernieren. Importantly können MSCs genetisch unterstützte Abgabe von neurotrophen Faktoren für kombinierte zellulare und Gentherapie-Anwendungen modifiziert werden, und sind in einer Reihe von Tiermodellen der Verletzung oder Krankheit des ZNS 11,19,22 eingesetzt. In der Entwicklung eines kombinierten Zell- und Gentherapie-basierte Strategie ist es wichtig, dass die Gesundheit der Zellen sorgfältig vor der umfassenden Nutzung für die in vitro und insbesondere in vivo Anwendungen bewertet. Wie Proof of Concept, untersuchten wir mehrere Populationen entwickelt und Steuer MSC Linien, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen auf Zell Gesundheit und Fitness mit einem High Content Screening (HCS) Ansatz zu studieren. In der Regel bezieht sich auf Zell HCS bildbasierten Hochdurchsatzscreening 14. Dieses Screening-Ansatz ermöglicht eine quantitative Beurteilung der zellulären Phänotypen auf mehreren Ebenen von räumlichen (Zelle auf subzellulärer) und zeitliche (Millisekunden bis Tagen) reslösung in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Mit diesem Ansatz haben wir mögliche Unterschiede in der Substratpräferenz von folgenden Parametern aufgerufen: Zellproliferation, Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), Zelltod und Zellbeweglichkeit / Migration. Die Experimente wurden in 96-well-Zellkulturplatte Format ausgelegt. Innerhalb einer einzigen Platte wir routinemäßig auf die einzelnen Parameter für die verschiedenen MSC Populationen lentiviralen-transduzierten Zellen untersucht mögliche Substratspezifische Unterschiede in Bezug und verglichen die entwickelt MSCs mit der ursprünglichen, nicht-transduzierten MSCs. Dies ergab ein Mittel, um direkt mit einer Reihe von In-vitro-Assays wie Zellproliferation mit Ki67 Immunmarkierung, Live / Dead-Zelllebensfähigkeitstest mit Propidiumiodid-Färbung, und das Zellverhalten, indem Sie Zeitraffer Digital Imaging vergleichen Sie die Ergebnisse für die verschiedenen Subtypen MSC . Als eine Erweiterung dieser HCS kann man auch durchführen ELISAs auf konditionierten Medienproben aus einzelnen w gesammeltenells quantitativ zu bestimmen Sekretion von neurotrophen Faktoren. Konditionierte Medien aus verschiedenen MSC-Subtypen können auch in in vitro Bioassays zur biologischen Aktivität von sezernierten Faktoren 11,23 bestimmen. Diese Art von HCS-Plattform kann auch für in vitro-Messungen von Neuritenwachstum aus primären neuronalen Kulturen und neuronale Stammzelllinien 24 verwendet werden. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Subpopulationen der genetisch veränderten MSCs ähnelnde Verhalten im Vergleich zu den nicht modifizierten MSCs. Der Einfluss verschiedener Kultursubstrate auf Zellwachstum und Zellmigration war nicht dramatisch verschieden zwischen den MSC-Subtypen sowie Kultursubstraten. Als solche hat die extrazellulären Matrixsubstrate getestet anscheinend nicht eine kritische Rolle bei der Modulation dieser Aspekte des Zellverhaltens für diese unterschiedlichen Engineered MSCs spielen. Diese Studie zeigt die Verwendung eines HCS System zum Analysieren von different Aspekte des Zellverhaltens. Jedoch ist es nicht ungewöhnlich, dass Einschränkungen bei der Bildanalyse zugeordnet stoßen. Gelegentlich, während die Analyse der Fluoreszenzbilder, war es etwas schwierig, den richtigen Schwellenwert, ab dem immun oder gefärbten Zellen würde gezählt als positiv bezeichnet / gefärbt werden zu bestimmen. Somit subjektiven Bias zu minimieren, wird die Bestimmung von Schwellenwerten war abhängig von einem Vergleich mit den Kontrollen (negative Kontrollen für die Fluoreszenz-Bildgebung wurden parallel bei allen Verarbeitung durch das Weglassen der primären oder sekundären Antikörper durchgeführt). Eine weitere Einschränkung wurde bei der Analyse der Zellmigration mit Zeitraffer Digital Imaging gestoßen. In einigen Fällen war die Bildverarbeitungssoftware nicht in der Lage, zwischen zufälligen Brownsche Bewegung einer Zelle gegenüber einer Zelle tatsächlich Migration nur eine sehr kurze Strecke zu unterscheiden. Zusätzliche Beschränkungen waren deutlich in Situationen, in denen die Analysesoftware nicht in der Lage, das Vorhandensein von multip unterscheidenle Zellen in unmittelbarer Nähe zu einem anderen. Um diese Einschränkung zu erforderlichen manuellen Zellenauswahl während der Analyse eher als eine vollautomatische Analyse zu überwinden. Zell Plattierungsdichte kann auch in Schrägzellmigration von Daten zwischen Populationen von Zellen, die größer ist bevorzugt in Klumpen gegen Zellen, die isoliert von einander wachsen wachsen Anzeigen führen. Diese Arten von Unterschiede sind zum Teil eher ein Spiegelbild der Zell-Substrat-gegen Zell-Zell-Vorlieben. Mit einem HCS-System, um Bilder zu erfassen und führen Sie Datenanalysen bietet ein effizientes und schnelles Mittel, um mehrere Zellparameter zu bewerten. Darüber hinaus wurden im Zeitraffer digitale Videos für 30 verschiedene Bedingungen (6 Substraten und 5 verschiedene MSC-Subtypen) routinemäßig für die Zeiträume von Stunden bis Tagen (48 Stunden) während der Verwendung der Klimakammer erworben. Diese Daten wurden anschließend verwendet, zu berechnen und zu bestimmen, Unterschiede in der Zellmigration Raten in verschiedenen Zelllinien auf verschiedenen ECMMolekülen. In diesem Bericht haben wir die Implementierung einer High Content Screening-Plattform, um die Zell Gesundheit und Funktion beurteilen hervorgehoben. Diese Art der Analyse ist für die Entwicklung von Strategien zur rationellen Gestaltung von Zelltypen, wie auch Polymersubstrate gerichtet Zellwachstum und die neuronale Regeneration zu erleichtern. Dies ist ein wesentlicher Schritt in Richtung Anwendung von stammzellbasierten Abgabe therapeutischer Faktoren vor umfangreiche präklinische Studien in vivo mittels Zelltransplantation Strategien.

Eines der Hauptprobleme bei der Durchführung nützliche Therapien zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems ist bei der Entwicklung wirksamer Methoden, die weitere Degeneration verhindern und Wiederherstellung der Funktion zu erleichtern. Eine innovative Strategie Genmanipulation Stammzellen ex vivo, für die Herstellung von neuroprotektiven Faktoren, vor ihrer Transplantation. Diese Kombination von zellbasierte Therapie in Verbindung mit einer Art von Gentherapie, ein leistungsfähiges Verfahren für die Behandlung von Krankheit oder Verletzung induzierten neuronalen Zelltod im Nervensystem. Neurotrophe Faktoren sind entscheidend für Wachstum und Überleben von sich entwickelnden Neuronen sowie Wartung und Plastizität von reifen Nervenzellen. Eine Reihe von Studien haben eine bedeutende Rolle von neurotrophen Faktoren bei der Förderung der anfänglichen Wachstum und die Differenzierung von Neuronen im zentralen und peripheren Nervensystems (ZNS und PNS) gezeigt, und sie können auch dazu anregen Regeneration in vitro und in einemnimal Modelle von Nervenverletzungen ein. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ist hoch im ZNS exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung des Nervensystems, die synaptische Plastizität und Reparatur 2. Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) fördert das Überleben vieler Arten von Neuronen, einschließlich dopaminerger und Motoneuronen 3. Somit ist es eine wichtige Strategie zur neuronalen Reparatur exogenen Quellen von neurotrophen Faktoren auf die verletzte oder erkrankte Bereiche des Nervensystems. Multiknochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) ein großes Potential für die Lieferung von therapeutischen Proteinen, um die beschädigte oder erkrankte Nervensystems zu behandeln. Transplantation von MSCs beträchtliche Aufmerksamkeit in den Bemühungen des Patienten kompatibel zellbasierten Therapien zu entwickeln zogen, da sie eine Reihe von Vorteilen, einschließlich: 1) der relativen Leichtigkeit der Isolierung und Wartung, 2) multipotente Fähigkeit, 3) kleiner ethische Bedenken und 4 haben) Überlebensfähigkeit und wandern nach der Transplantation und 5) Potenzial für autologe Transplantation 4,5. Vielversprechende Ergebnisse wurden bei Verwendung von naiven und gentechnisch MSCs in Tiermodellen für eine Vielzahl von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks 6,7, Schlaganfall 8,9, Myelinmangel 10 und Netzhautdegeneration 11-13 berichtet. Koppeln Zelltransplantation mit der Lieferung von neurotrophen Faktoren aus gentechnisch veränderten Stammzellen ist ein neuartiges und wichtiges neuronales Reparaturstrategie. Ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung von zellbasierten therapeutischen Faktor-Delivery-Systeme, die normale Gesundheit der gentechnisch veränderten Zellen zu bestimmen. Als solches ist das Hauptziel dieser Studie war es, allgemeine Wachstumsparameter von gentechnisch veränderten adulten Stammzellen zu bewerten. Ein wichtiger Ansatz zur raschen Einschätzung mehrerer Zellparametern ist es, zelluläre bildbasierten Hochdurch screenin beschäftigeng (HTS), die oft als High Content Screening (HCS) Verfahren 14 bezeichnet. Diese Technologie ermöglicht die automatisierte Bildaufnahme und Analyse, und dieser Ansatz ist besonders gut für die Stammzellenforschung Anwendungen geeignet. In diesem Projekt haben wir eine Profiling-Plattform, die für die schnelle Charakterisierung und Optimierung von Zellsubstrat Vorlieben und Zellfunktionen mit gentechnisch veränderten adulten Stammzellen unter Verwendung einer HCS-System ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>96-Well-Platten ausgewählt für die Verwendung in ImageXpress</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper</td><td>Abcam (Cambridge, MA)</td><td>Ab16667</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>C7661</td><td>Kollagen aus Rattenschwanz</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>ECL (Entaktin-Kollagen-Laminin)</td> <td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklon (Logan, UT)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Hyklon (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemistry Store (Ames, IA)</td><td>12003510</td><td>100%, 200 proof</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s modifiziertes Dulbeccos Medium (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>Für PO4 Puffer</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P288</td><td>Für PO4Puffer</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (Maus)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Maus-MSCs von adulten C57BL/6-Mäusen</td><td>Tulane Cent für die Gentherapie (New Orleans, LA)</td><td></td><td>Isoliert aus Knochenmark</td></tr><tr><td>Gentechnisch veränderte MSCs (GFP, BDNF, GDNF/ GDNF)</td><td>Diese Zellen wurden aus unserer früheren Studie gewonnen: Ye et. al. (in Vorbereitung)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>4% PFA in 0,1 M PO4 Puffer</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>12440&ndash; 046</td><td></td></tr><tr><td>Hybridom-qualifizierter FBS-Hyclone</td><td>(Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pferdeserum Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td><td>ImageXpress micro</td><td>High-Content-Screening-System</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>Bildaufnahme und -analyse Software</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-charakterisierung von adulten stammzellen für die zuführung von therapeutischen faktoren für neuroprotektive strategien engineered

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymale Stammzellen (MSCs), die aus dem Knochenmark gewonnen werden, sind eine mächtige zelluläre Ressource und wurden in zahlreichen Studien als potenzielle Kandidaten zur Entwicklung von Strategien zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten verwendet. Das Ziel dieser Studie war es, MSCs als zelluläre Vehikel zu entwickeln und zu charakterisieren, die für die Verabreichung therapeutischer Faktoren als Teil einer neuroprotektiven Strategie zur Rettung des geschädigten oder erkrankten Nervensystems entwickelt wurden. In dieser Studie verwendeten wir Maus-MSCs, die genetisch mit lentiviralen Vektoren modifiziert wurden, die den brain-derived neurotrophic factor (BDNF) oder den glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) zusammen mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) kodierten. 
Bevor wir mit in vivo Transplantationsstudien fortfuhren, war es wichtig, die manipulierten Zellen zu charakterisieren, um festzustellen, ob die genetische Modifikation Aspekte des normalen Zellverhaltens verändert hat oder nicht. Verschiedene Kultursubstrate wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Zelladhäsion, Proliferation, das Überleben und die Zellmigration der vier Subpopulationen der gentechnisch hergestellten MSCs zu unterstützen. Es wurde ein High-Content-Screening (HCS) durchgeführt und eine Bildanalyse durchgeführt. 
Zu den untersuchten Substraten gehörten: Poly-L-Lysin, Fibronektin, Kollagen Typ I, Laminin, Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL). Die Ki67-Immunmarkierung wurde zur Untersuchung der Zellproliferation und die Propidiumiodid-Färbung zur Untersuchung der Zellviabilität verwendet. Die Zeitraffer-Bildgebung wurde mit einem Durchlicht-/Klimakammersystem auf dem High-Content-Screening-System durchgeführt.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Subpopulationen der genetisch veränderten MSCs ähnliche Verhaltensweisen zeigten, die im Allgemeinen mit denen der ursprünglichen, nicht veränderten MSCs vergleichbar waren. Der Einfluss verschiedener Kultursubstrate auf das Zellwachstum und die Zellmigration unterschied sich nicht dramatisch zwischen den Gruppen, die die verschiedenen MSC-Subtypen sowie die Kultursubstrate verglichen. 
Diese Studie bietet eine experimentelle Strategie, um manipulierte Stammzellen und ihr Verhalten schnell zu charakterisieren, bevor sie in Langzeit-In-vivo-Transplantationsstudien zur Rettung und Reparatur des Nervensystems eingesetzt werden.

MSC Wachstumsparameter wurden durch Kultivierung der verschiedenen Populationen von MSCs auf unterschiedlichen Substraten untersucht. Die fünf verschiedenen Populationen von MSC-Subtypen (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden in 96-Well-Gewebekulturplatten mit unterschiedlichen vorbeschichtet plattiert Substrate, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach vier Tagen Kultivierung wurden die Platten fixiert und immunmarkierten und / oder mit den entsprechenden Reagenzien gefärbt und unter Verwendung des HCS System dann untersucht und Analysen mit der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm durchgeführt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Fig. 1: 96-Well-Platte Vorlage für experimentelle Design 96-Well-Platten wurden mit verschiedenen Substraten und Vertiefungen beschichtet wurden mit Engineered Stammzellen geimpft, wie in der Schablone gezeigt. Als Beispiel wird nur wells in Reihen BF wurden in diesem Experiment verwendet. Reihen A, G und H wurden leer gelassen. Abkürzungen - MSCs: mesenchymale Stammzellen; GFP-MSCs: grün fluoreszierende Protein-exprimierenden MSC; BDNF-GFP-MSCs: brain derived neurotrophic factor-GFP-exprimierenden MSC; GDNF-GFP-MSCs; Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor-GFP-exprimierenden MSCs; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; BDNF und GDNF- GFP exprimierende MSCs; ECL: Entactin-Collagen IV-Laminin). Anti-Ki67 Immunmarkierung, gefolgt von DAPI Gegenfärbung wurde verwendet, um zu bewerten, ob die verschiedenen Substrate beeinflußt Proliferation der verschiedenen Populationen von Engineered MSCs (2A). Die Expression des Antigens Ki67 läuft bevorzugt in der späten G 1, S, G 2 und M-Phasen des Zellzyklus und wird nicht in den Zellen in der Ruhephase (G 0) erkannt wird, und ist daher geeignet als zellulärer Marker für die Proliferation 15 . 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) ist eine häufig verwendete nuklar und Chromosomengegenfärbung, die blaue Fluoreszenz bei der Bindung an AT Regionen der DNA 16 abgibt. Die Gesamtzahl der Zellen in einem Bereich, kann durch Zählen der Anzahl von DAPI Kerne bestimmt werden. Wie in 2B dargestellt ist, obwohl es Variationen in den Prozentsätzen von proliferierenden MSCs, alle Substrate dennoch beträchtliche Zellproliferation für jede der MSC Subtypen unterstützt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2: Ki67 Zellproliferationsassay. (A) verschmolzen, doppelklicken Fluoreszenzbild von Ki67 Immunmarkierung (rot) und DAPI (blau) Kernfärbung. Viele der MSCs wurden mit dem Ki67-Antikörper (rot) immunmarkiert. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. (B) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Ki67 immunolabeled MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, KollagenTyp I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Propidiumiodid (PI) Färbung wurde verwendet, um zu beurteilen, ob verschiedene Substrate beeinflussen das Überleben der Zellen (Abbildung 3). Propidiumiodid ist eine häufig verwendete Rot-Fluoreszenz Kern- und Chromosomen-Gegenfärbung. Propidiumiodid ist Membran impermeant und allgemein von lebensfähigen Zellen ausgeschlossen sind, und ist daher nützlich, um tote Zellen zu erkennen in einer Population. Der Anteil von toten Zellen in einer gegebenen Bedingung bestimmt, wenn sie mit einer allgemeinen Kern Markierung, wie DAPI kombiniert, um alle Zellen innerhalb eines Feldes zu identifizieren. Der Anteil der PI-positiven Zellen war niedrig auf allen untersuchten Substraten (Abbildung 3). Als positive Kontrolle für die PI-Reagenz wurden einige Vertiefungen, die MSCs in 70% Ethanol inkubiert wurde, was üblicherweise für die meisten Zellen zu töten, was zu einem hohen Prozentsatz an PI-markierten Zellen, wie in 3B und 3C dargestellt (Ethanol behandelt positive Steuerung). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Propidiumiodid Zelltod-Assay. (A) verschmolzen, Doppelfluoreszenzbild für Propidiumiodid (rot) und DAPI (blau) Färbung. Obwohl die Kerne aller lebensfähigen Zellen wurden mit DAPI (blau) gefärbt wurde keine Propidiumiodidfärbung im MSCs. (B) praktisch alle MSCs wurden mit Propidiumiodid nach Exposition mit 70% igem Ethanol gefärbt erkannt. Maßstabsbalken in A und B = 100 &amp; mgr; m. (C) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Propidiumiodid (PI) gefärbt MSC SubtypS auf Polystyrol (PS), Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV) gezüchtet. Ethanol Steuerung: Diese Bedingung diente als positive Kontrolle für die PI Färbereagenz. Die meisten Zellen zu PI-Färbung nach Ethanol-Behandlung unterzogen sind tot und damit positiv für den PI-Reagenz gefärbt. N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Um den möglichen Einfluss von verschiedenen Substraten auf das Verhalten von technischen MSCs, Zellmigration wurde mit Zeitraffer digitale Mikroskopie und den Durchlicht / Klimakammer-System auf dem HCS-System analysiert untersuchen (siehe Zusatz Video 1). Mehrere Standorte / Vertiefung wurden Zeitraffer abgebildetund verwendet, um die Zellmigrationsraten für die verschiedenen Subpopulationen von MSCs wachsen auf den verschiedenen Substraten mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software zu berechnen. Im Allgemeinen, wie in 4C gezeigt, alle Subtypen von MSCs zeigte die schnellste Migrationsrate auf die extrazelluläre Matrix-beschichteten Oberflächen (Fibronectin, Kollagen, Laminin und ECL) und dem langsamsten auf nicht-beschichteten Polystyroloberflächen. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Abb. 4: Zellverfolgung und Migration MSCs verfolgt mit der Bildaufnahme und Analyse-Software. Überlagerten Bilder der Durchlicht und Fluoreszenzbilder von (A) dem Beginn der Zeitraffer-Imaging und (B) 29 Stunden später am Ende des Zeitraffer-Imaging-Sitzung (siehe Zusatz Video 1). Zellmigration Spuren durch die farbige li angegebennes. Maßstab:. 50 um (C) Balkendiagramm, das durchschnittliche Migrationsraten (als &amp; mgr; m / h ausgedrückt) zum MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, oder Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL) Substrate für 2 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt den Mittelwert von mindestens 10 abgebildet Zellen von 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse liefern erste Hinweise, dass diese Subpopulationen von gentechnisch MSCs ähnliche Wachstumseigenschaften anzuzeigen. Diese Ergebnisse liefern überzeugende Beweise, dass der lentivirale vermittelten genetischen Veränderungen dieser MSCs induzierte keine dramatischen nachweisbare schädliche Auswirkungen auf die Wachstumsparameter untersucht mit dieser Screening-Plattform. STADT Video 1. Zeitraffer-Digital-Video von MSC-Tracking mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm. Die Migration ist für zwei MSCs [wie 1 (grün Spurlinie) und 2 (Blau-Tracking-Linie) angegeben] dargestellt. Video während einer 29 Stunden-Zeitraum erfasst. Bilder wurden alle 5 Minuten eingefangen. Fluoreszenzbilder der GFP-exprimierenden MSC wurde für Zeitraffer-Bildgebung bei der Erstellung des Videos verwendet. Kalibrierung bar = 50 &amp; mgr; m. Diese Art der Analyse ist für die Untersuchung der Zellverhalten, einschließlich der Zellmigration und der Zellteilung.

Diese Studie beschreibt eine experimentelle Plattform zur schnellen Charakterisierung von gentechnisch veränderten Stammzellen und ihrem Verhalten vor ihrer Anwendung in Langzeit-In-vivo-Transplantationsstudien zur Rettung und Reparatur des Nervensystems.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die schnelle Charakterisierung gentechnisch veränderter Stammzellen mit Hilfe eines High-Content-Screening- oder HCS-Systems. Dies wird erreicht, indem zunächst Experimente für eine 96-Well-Platte entworfen und vorbereitet werden und dann die verschiedenen Populationen der gentechnisch hergestellten Stammzellen plattiert werden. Als nächstes wird das High-Content-Screening-System für die Bildgebung lebender Zellen vorbereitet und dann die Zeitraffer-Bildgebung für den gewünschten Zeitraum gestartet.Nach Abschluss der Zeitraffer-Bildgebung wird die Kulturplatte für Zellfärbeverfahren wie Propidiumiodid, Färbung für den Zelltod oder KI 67-Immunmarkierung zur Charakterisierung der Zellproliferation vorbereitet. Schließlich wird die 96-Well-Platte wieder in das High-Content-Screening-System für die Fluoreszenzbildgebung und Bildaufnahme geladen. Letztendlich wird die Bildanalysesoftware verwendet, um Datenanalysen zur Bestimmung verschiedener Zellwachstumsparameter durchzuführen.Diese Methodik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Stammzellbiologie zu lösen, wie z. B. die Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die die Differenzierung von Stammzellen stimulieren. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf zellbasierte therapeutische Strategien, da es wichtig ist, die Zelltypen zu charakterisieren, bevor sie in vivo eingesetzt werden. Diese Methode kann Einblicke in das Zellverhalten geben und kann auf praktisch jeden anderen Zelltyp angewendet werden, der in Kultur gut wächst.Darüber hinaus können diese Ansätze möglicherweise auf ganze Organismen wie Zebrafischlarven angewendet werden. Erstellen Sie zunächst eine Karte der 96-Well-Platte, wie hier gezeigt, in der die verschiedenen Substrate und Zelltypen aufgeführt sind, die unter einer sterilen Kulturhaube untersucht werden sollen. Bereiten Sie eine Workstation mit verschiedenen Substraten und einer 96-Well-Platte vor.Fügen Sie jedem 100 Mikroliter Substratlösung hinzu, gut gemäß der Karte. Verwenden Sie dann einen Streifen Perfil, um den Deckel zu verschließen, und lagern Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem mesenchymale Stammzellen der Maus isoliert und mit lentiviralen Vektoren gemäß dem Textprotokoll infiziert wurden, entfernen Sie die Substratlösungen von der 96-Well-Platte und verwenden Sie etwa 200 Mikroliter steriles PBS, um die Wells zweimal zu waschen. Nach der letzten Spülung bei 200 Mikrolitern Zellkulturmedium die Platte in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid äquilibrieren.In der Zwischenzeit werden die MSC unter sterilen Bedingungen geerntet, indem zunächst das Wachstumsmedium, das jetzt als konditioniertes Medium bezeichnet wird, aus dem Kolben in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aufgefangen wird. Geben Sie dann acht Milliliter steriles PBS in den Kolben und schwenken Sie es vorsichtig, bevor Sie den Puffer aspirieren. Um die Zellen aus dem Kolben zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin und 0,01 % EDTA-Lösung hinzu. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie acht Milliliter des konditionierten Mediums hinzu, bevor Sie die Zellsuspension sammeln und die Zellen mit etwa 300 Zellen pro Vertiefung neu plattieren.Gemäß dem Textprotokoll inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang, damit sich die MSCs während der Inkubation der Zellen an das Substrat anheften können. Starten Sie das HCS-System, und warten Sie zwei Stunden, bis es ausgeglichen ist. Stellen Sie den Klimaregler auf 37 Grad Celsius ein und schalten Sie vorsichtig die Mischgasflasche mit 5 % Kohlendioxid in der Luft ein, um die Klimakammer des HCS-Systems, die eine konstante Luftquelle liefert, zu versorgen.Nehmen Sie nach der zweistündigen Inkubationszeit die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie direkt in die Klimakammer des HCS-Systems. Nachdem Sie die Platte 30 Minuten lang ausgeglichen haben, starten Sie die Software, um die Platteneinstellungen zu konfigurieren. Sobald die Bildgebungsparameter gemäß dem Textprotokoll eingestellt wurden, verwenden Sie den Laser-Autofokus, um auf den Well-Boden zu fokussieren, und nehmen Sie Testbilder von mehreren Stellen und mehreren Wells auf, um eine optimierte Fokusebene zu finden.Sobald der Fokus festgelegt ist, beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern alle fünf Minuten für alle 60 Wells für 48 Stunden. Entfernen Sie am Ende des Experiments die 96-Well-Platte unter sterilen Bedingungen aus dem HCS-System, entnehmen Sie konditionierte Mediumproben aus jeder Vertiefung und übertragen Sie sie auf eine frische 96-Well-Platte. Diese Proben können später für einen ELIZA verwendet werden, um einen KI 67-Zellproliferationsassay durchzuführen.Verwenden Sie 0,1 molaren Phosphatpuffer, um die Zellkulturen eine Minute lang zu spülen. Verwenden Sie nach Wiederholung des Waschvorgangs 4%para-Formaldehyd oder PFA bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um die Kulturen nach der Fixierung zu fixieren. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS dreimal für jeweils sieben Minuten.Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll blockiert haben, tragen Sie jeweils 100 Mikroliter Primärantikörperlösung auf. Decken Sie die Platte gut ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach dreimaligem Waschen der Zellen für sieben Minuten.Bei jeder Wäsche ist ein Sekundärantikörper aufzutragen. Stellen Sie die Zellen in die Dunkelheit und inkubieren Sie sie nach weiteren drei Wäschen 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Decken Sie die Platte ab und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius.Um eine automatisierte Bildgebung durchzuführen, laden Sie die immunmarkierte Platte in das HCS-System und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang äquilibrieren. Öffnen Sie die Bilderfassungs- und -analysesoftware des HCS-Systems. Wählen Sie die Aufnahmeeinstellungen für das 10-fach-Objektiv mit Kamerabiegung bei eins und einer Verstärkungseinstellung von zwei.Verwenden Sie die Funktion für die automatische Belichtung, um die Z-Ebene zu ermitteln, in der sich die Zellen befinden, und um den Versatz für jede Wellenlänge zu berechnen, die für die hier gezeigte Analyse von Interesse ist. Erfassen Sie Bilder für DAP, EGFP und S3. Wählen Sie die maximale Intensitätsstufe, bei der die negativen Kontrollvertiefungen kein Signal für die Bildaufnahme anzeigen. Verwenden Sie die gleichen Schwellenwerteinstellungen für positive Vertiefungen.Erfassen Sie abschließend Bilder und speichern Sie sie in einer Datenbank, bevor Sie eine Bildanalyse durchführen. Gemäß dem Textprotokoll, wie hier gezeigt, wurden fünf verschiedene Populationen von MSC-Subtypen in 96 Well-Gewebekulturplatten plattiert, die mit unterschiedlichen Substraten in dieser Abbildung vorkodiert waren, anti-KI 67, das proliferierende Zellen identifiziert, und DAPI wurde verwendet, um zu bewerten, ob die verschiedenen Substrate die Proliferation der verschiedenen Populationen von manipulierten MSCs beeinflussten, wie hier dargestellt. Obwohl es Unterschiede in den Prozentsätzen der proliferierenden MSCs gab, unterstützten alle Substrate eine beträchtliche Zellproliferation für jeden MSC-Subtyp. Dieses Diagramm zeigt, dass der Prozentsatz der Zellen mit Propidiumiodid- oder PI-Färbung, die tote Zellen in einer Population identifiziert, auf allen untersuchten Substraten gering ist. Zellen, die mit 70%Ethanol behandelt wurden, was die meisten Zellen abtötet, eine hohe Rate an PI-Markierung aufwies und als Positivkontrolle dient, um das Verhalten von MSCs auf verschiedenen Substraten zu untersuchen.Die Zellmigration über einen Zeitraum von 29 Stunden wurde mittels digitaler Zeitraffermikroskopie analysiert. Der Migrationspfad für Zelle eins und Zelle zwei ist durch die grüne bzw. blaue Linie gekennzeichnet. Wie hier gezeigt, zeigten alle Subtypen von MSCs die schnellste Migrationsrate auf der extrazellulären Matrix, beschichteten Oberflächen und die langsamste auf unbeschichteten Polystyroloberflächen.Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, das Experiment sorgfältig für ein Multi-Well-Plattenformat zu planen und zu entwerfen, z. B. eine 96-Well-Platte. Andere Methoden, wie z.B. Eliza S, können auf Bedingungsmedien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Produktion und Sekretion von therapeutischen Faktoren durch die gentechnisch veränderten Stammzellen nach ihrer Entwicklung zu beantworten. High-Content-Screening-Verfahren haben Forschern in den Bereichen Stammzellbiologie und Wirkstoffforschung den Weg geebnet, komplexe biologische Systeme mit hohem Durchsatz zu erforschen.

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Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Quelle: Sharma, A. D., et.al. Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen, die für die Verabreichung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien entwickelt wurden. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Prozess der Charakterisierung transgener mesenchymaler Stammzellen, die so verändert wurden, dass sie therapeutische neurotrophe Faktoren exprimieren. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der Zellen mit primären...

Charakterisierung von gentechnisch veränderten mesenchymalen Stammzellen für neurotherapeutische Anwendungen

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Hier präsentieren wir eine Methode für eine menschliche in Vitro Modell der Stretch Verletzungen in einem 96-Well-Format auf einer Zeitskala für Trauma auswirken. Dazu gehören Methoden für die Herstellung von dehnbaren Platten, Quantifizierung der mechanischen Beleidigung, Kultivierung und verletzte Zellen, Bildgebung und hohe Inhaltsanalyse, Verletzungen zu quantifizieren.

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Charakterisierung von Stammzellen mittels High-Content-Screening für neuroprotektive Strategien. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellverhalten und Proliferation in Echtzeit.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

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