Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die schnelle Charakterisierung gentechnisch veränderter Stammzellen mit Hilfe eines High-Content-Screening- oder HCS-Systems. Dies wird erreicht, indem zunächst Experimente für eine 96-Well-Platte entworfen und vorbereitet werden und dann die verschiedenen Populationen der gentechnisch hergestellten Stammzellen plattiert werden. Als nächstes wird das High-Content-Screening-System für die Bildgebung lebender Zellen vorbereitet und dann die Zeitraffer-Bildgebung für den gewünschten Zeitraum gestartet.

Nach Abschluss der Zeitraffer-Bildgebung wird die Kulturplatte für Zellfärbeverfahren wie Propidiumiodid, Färbung für den Zelltod oder KI 67-Immunmarkierung zur Charakterisierung der Zellproliferation vorbereitet. Schließlich wird die 96-Well-Platte wieder in das High-Content-Screening-System für die Fluoreszenzbildgebung und Bildaufnahme geladen. Letztendlich wird die Bildanalysesoftware verwendet, um Datenanalysen zur Bestimmung verschiedener Zellwachstumsparameter durchzuführen.

Diese Methodik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Stammzellbiologie zu lösen, wie z. B. die Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die die Differenzierung von Stammzellen stimulieren. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf zellbasierte therapeutische Strategien, da es wichtig ist, die Zelltypen zu charakterisieren, bevor sie in vivo eingesetzt werden. Diese Methode kann Einblicke in das Zellverhalten geben und kann auf praktisch jeden anderen Zelltyp angewendet werden, der in Kultur gut wächst.

Darüber hinaus können diese Ansätze möglicherweise auf ganze Organismen wie Zebrafischlarven angewendet werden. Erstellen Sie zunächst eine Karte der 96-Well-Platte, wie hier gezeigt, in der die verschiedenen Substrate und Zelltypen aufgeführt sind, die unter einer sterilen Kulturhaube untersucht werden sollen. Bereiten Sie eine Workstation mit verschiedenen Substraten und einer 96-Well-Platte vor.

Fügen Sie jedem 100 Mikroliter Substratlösung hinzu, gut gemäß der Karte. Verwenden Sie dann einen Streifen Perfil, um den Deckel zu verschließen, und lagern Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem mesenchymale Stammzellen der Maus isoliert und mit lentiviralen Vektoren gemäß dem Textprotokoll infiziert wurden, entfernen Sie die Substratlösungen von der 96-Well-Platte und verwenden Sie etwa 200 Mikroliter steriles PBS, um die Wells zweimal zu waschen. Nach der letzten Spülung bei 200 Mikrolitern Zellkulturmedium die Platte in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid äquilibrieren.

In der Zwischenzeit werden die MSC unter sterilen Bedingungen geerntet, indem zunächst das Wachstumsmedium, das jetzt als konditioniertes Medium bezeichnet wird, aus dem Kolben in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aufgefangen wird. Geben Sie dann acht Milliliter steriles PBS in den Kolben und schwenken Sie es vorsichtig, bevor Sie den Puffer aspirieren. Um die Zellen aus dem Kolben zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin und 0,01 % EDTA-Lösung hinzu. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie acht Milliliter des konditionierten Mediums hinzu, bevor Sie die Zellsuspension sammeln und die Zellen mit etwa 300 Zellen pro Vertiefung neu plattieren.

Gemäß dem Textprotokoll inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang, damit sich die MSCs während der Inkubation der Zellen an das Substrat anheften können. Starten Sie das HCS-System, und warten Sie zwei Stunden, bis es ausgeglichen ist. Stellen Sie den Klimaregler auf 37 Grad Celsius ein und schalten Sie vorsichtig die Mischgasflasche mit 5 % Kohlendioxid in der Luft ein, um die Klimakammer des HCS-Systems, die eine konstante Luftquelle liefert, zu versorgen.

Nehmen Sie nach der zweistündigen Inkubationszeit die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie direkt in die Klimakammer des HCS-Systems. Nachdem Sie die Platte 30 Minuten lang ausgeglichen haben, starten Sie die Software, um die Platteneinstellungen zu konfigurieren. Sobald die Bildgebungsparameter gemäß dem Textprotokoll eingestellt wurden, verwenden Sie den Laser-Autofokus, um auf den Well-Boden zu fokussieren, und nehmen Sie Testbilder von mehreren Stellen und mehreren Wells auf, um eine optimierte Fokusebene zu finden.

Sobald der Fokus festgelegt ist, beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern alle fünf Minuten für alle 60 Wells für 48 Stunden. Entfernen Sie am Ende des Experiments die 96-Well-Platte unter sterilen Bedingungen aus dem HCS-System, entnehmen Sie konditionierte Mediumproben aus jeder Vertiefung und übertragen Sie sie auf eine frische 96-Well-Platte. Diese Proben können später für einen ELIZA verwendet werden, um einen KI 67-Zellproliferationsassay durchzuführen.

Verwenden Sie 0,1 molaren Phosphatpuffer, um die Zellkulturen eine Minute lang zu spülen. Verwenden Sie nach Wiederholung des Waschvorgangs 4%para-Formaldehyd oder PFA bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um die Kulturen nach der Fixierung zu fixieren. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS dreimal für jeweils sieben Minuten.

Nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll blockiert haben, tragen Sie jeweils 100 Mikroliter Primärantikörperlösung auf. Decken Sie die Platte gut ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach dreimaligem Waschen der Zellen für sieben Minuten.

Bei jeder Wäsche ist ein Sekundärantikörper aufzutragen. Stellen Sie die Zellen in die Dunkelheit und inkubieren Sie sie nach weiteren drei Wäschen 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Decken Sie die Platte ab und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius.

Um eine automatisierte Bildgebung durchzuführen, laden Sie die immunmarkierte Platte in das HCS-System und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang äquilibrieren. Öffnen Sie die Bilderfassungs- und -analysesoftware des HCS-Systems. Wählen Sie die Aufnahmeeinstellungen für das 10-fach-Objektiv mit Kamerabiegung bei eins und einer Verstärkungseinstellung von zwei.

Verwenden Sie die Funktion für die automatische Belichtung, um die Z-Ebene zu ermitteln, in der sich die Zellen befinden, und um den Versatz für jede Wellenlänge zu berechnen, die für die hier gezeigte Analyse von Interesse ist. Erfassen Sie Bilder für DAP, EGFP und S3. Wählen Sie die maximale Intensitätsstufe, bei der die negativen Kontrollvertiefungen kein Signal für die Bildaufnahme anzeigen. Verwenden Sie die gleichen Schwellenwerteinstellungen für positive Vertiefungen.

Erfassen Sie abschließend Bilder und speichern Sie sie in einer Datenbank, bevor Sie eine Bildanalyse durchführen. Gemäß dem Textprotokoll, wie hier gezeigt, wurden fünf verschiedene Populationen von MSC-Subtypen in 96 Well-Gewebekulturplatten plattiert, die mit unterschiedlichen Substraten in dieser Abbildung vorkodiert waren, anti-KI 67, das proliferierende Zellen identifiziert, und DAPI wurde verwendet, um zu bewerten, ob die verschiedenen Substrate die Proliferation der verschiedenen Populationen von manipulierten MSCs beeinflussten, wie hier dargestellt. Obwohl es Unterschiede in den Prozentsätzen der proliferierenden MSCs gab, unterstützten alle Substrate eine beträchtliche Zellproliferation für jeden MSC-Subtyp. Dieses Diagramm zeigt, dass der Prozentsatz der Zellen mit Propidiumiodid- oder PI-Färbung, die tote Zellen in einer Population identifiziert, auf allen untersuchten Substraten gering ist. Zellen, die mit 70%Ethanol behandelt wurden, was die meisten Zellen abtötet, eine hohe Rate an PI-Markierung aufwies und als Positivkontrolle dient, um das Verhalten von MSCs auf verschiedenen Substraten zu untersuchen.

Die Zellmigration über einen Zeitraum von 29 Stunden wurde mittels digitaler Zeitraffermikroskopie analysiert. Der Migrationspfad für Zelle eins und Zelle zwei ist durch die grüne bzw. blaue Linie gekennzeichnet. Wie hier gezeigt, zeigten alle Subtypen von MSCs die schnellste Migrationsrate auf der extrazellulären Matrix, beschichteten Oberflächen und die langsamste auf unbeschichteten Polystyroloberflächen.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, das Experiment sorgfältig für ein Multi-Well-Plattenformat zu planen und zu entwerfen, z. B. eine 96-Well-Platte. Andere Methoden, wie z.B. Eliza S, können auf Bedingungsmedien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Produktion und Sekretion von therapeutischen Faktoren durch die gentechnisch veränderten Stammzellen nach ihrer Entwicklung zu beantworten. High-Content-Screening-Verfahren haben Forschern in den Bereichen Stammzellbiologie und Wirkstoffforschung den Weg geebnet, komplexe biologische Systeme mit hohem Durchsatz zu erforschen.