Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve
19. Mai 2015
Direkte Injektion in den Sehnerv der Ratte ist nützlich für die regenerative Forschung. Wir demonstrieren eine minimal-invasive Technik zur direkten Injektion in einen Sehnerv der Ratte, bei der der Schädel nicht geöffnet werden muss. Mit dieser Methode werden chirurgische Komplikationen minimiert und die Genesung ist schneller.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen minimal-invasiven Ansatz zur Injektion von Medikamenten oder Stammzellen in den Sehnerv einer lebenden Ratte zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem die Ratte zuerst betäubt, auf dem Präparierstand positioniert und eine Naht in die Bindehaut eingeführt wird, um das Auge zu manipulieren. Später besteht der zweite Schritt darin, den Augenhöhlenkamm hinter dem Auge zu präparieren, um den Sehnerv freizulegen.
Als nächstes wird die Glaspipette in den Sehnerv eingeführt, und das Medikament oder die Stammzellen werden injiziert, bevor die Operationsstelle geschlossen und die Ratte aus der Narkose wiederbelebt wird. Schließlich wird nach einer gewissen Zeit die Ratte getötet, der Sehnerv präpariert und die Auswirkungen der chirurgischen Injektion oder Transplantation können mikroskopisch sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass dieser Ansatz minimalinvasiv ist und es der Ratte ermöglicht, so lange zu überleben, wie Sie es benötigen.
Untersuchen Sie die Auswirkungen einer chirurgischen Injektion oder Transplantation. Das Verfahren wird von Kate Schwartz, einer Technikerstudentin aus meinem Labor, vorgeführt. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Narkose mit zwei bis 3 % Fluor durch.
Bestätigen Sie das angemessene Maß an Anästhesie durch Zehenklemmen und Atemfrequenz. Vergewissern Sie sich, dass die Ratte bei einem Zeh nicht zusammenzuckt. Kneifen. Sichern Sie das Tier nach Bedarf, um Kopfbewegungen während des Eingriffs zu vermeiden.
Geben Sie dann einen Tropfen Lidocain auf das chirurgische Auge. Verwenden Sie alle 10 Minuten künstliche Tränen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Geben Sie eine präoperative Injektion von Buprenorphin in einer Menge von 0,01 Milligramm pro Kilogramm subkutan und dann alle sechs bis acht Stunden nach Bedarf.
Halten Sie das Tier mit einem Heizkissen warm. Befeuchten Sie das Kopffell mit Alkohol. Achten Sie darauf, eine Exposition der Augen zu vermeiden.
Achten Sie darauf, sterile Werkzeuge und sterile Techniken zu verwenden, um das Risiko postoperativer Infektionen zu minimieren. Legen Sie dann eine Vier-Oh-Naht in die laterale Bindehaut und binden Sie sie mit genügend Naht, um eine sanfte Traktion zu ermöglichen. Machen Sie einen etwa einen Zoll großen Schnitt in der Haut über dem Augenhöhlenkamm.
Mit einem Skalpell der Größe 10. Ziehen Sie die Haut und die darunter liegende Faszie zurück und präparieren Sie die Faszien vorsichtig. Legen Sie eine Naht in die zurückgezogene Haut, um den oberen Orbitasack freizulegen und übermäßige Blutungen in die Operationsstelle zu verhindern.
Vermeiden Sie es, Blutgefäße zu durchtrennen, während Sie die Faszien präparieren. Mit sanftem Zug an der Bindehaut, bei dem das Auge nach unten und aus der Augenhöhle gezogen wird, kommt der obere Augenhöhlenmuskel zum Vorschein. Um den Sehnerv freizulegen, muss das retroorbitale Fett entfernt und dieser Muskel durchtrennt werden.
Das Fett kann verworfen werden und sollte nach der Injektion nicht ersetzt werden. Von diesem Punkt an sollte die Faszie des Sehnervs als Bündel des Sehnervs selbst sichtbar sein, zusammen mit Blutgefäßen, die mit Dura umwickelt sind. Um die tiefere Dissektion durchzuführen, machen Sie einen kleinen Schnitt in der DRA mit dem Skalpell oder einer abgeschrägten 31-Gauge-Nadel, um das Stechen weniger traumatisch zu machen, und bereiten Sie eine gezogene Glasmikropipette mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern vor, um Stabilität zu gewährleisten.
Montieren Sie die Mikropipette auf einen Mikromanipulator und befestigen Sie sie an einer 20-cm³-Kunststoffspritze. Ziehen Sie in 0,5 bis 1 Mikroliter rekonstituierte Kügelchen oder Stammzellen in die retrograde Mikropipette hoch, zusammen mit 0,5 Mikrolitern Methylblaulösung, bevor und nachdem die Glaspipette mit Farbstoff beladen wurde. Senken Sie mit einer 1-cm³-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel die Spitze der Mikropipette auf den Sehnerv direkt über der eingekerbten Dura.
Eine winzige, aber zügige Bewegung der Glasspitze in den Sehnerv führt zu den geringsten Schäden, wenn ein langsamer und konstanter Druck auf den Kolben ausgeübt wird. Der Evans-Blau-Farbstoff sollte den Bereich des injizierten Sehnervs hervorheben. Der Farbstoff sollte im Sehnerv lokalisiert bleiben, ohne im Subarachnoidalraum auszutreten.
Befolgen Sie die zweite Bande von Evan's Blue Dye, um festzustellen, wann die Stammzellinjektion abgeschlossen ist. Wenn das notwendige Volumen in den Sehnerv injiziert ist, lassen Sie den Kolben los. Halten Sie die Mikropipette fünf Minuten lang ruhig im Sehnerv, um einen Hochdruckauswurf beim Herausziehen der Mikropipette nach Abschluss der Injektion zu verhindern.
Entfernen Sie die Mikropipette zusammen mit allen Wattespitzen, die zur Blutstillung verwendet wurden. Nähen Sie die Haut mit 3.0 Seide und entfernen Sie die Bindehautnaht. Halten Sie Ratten auf einem Heizkissen warm, bis sie aus der Narkose kommen.
Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein liegend zu halten. Wenn das Tier Anzeichen von Schmerzen zeigt, einschließlich übermäßiger Lethargie, Ataxie oder Atembeschwerden, ist bis zu dreimal täglich eine geeignete Analgesie mit intramuskulärem Buprenorphin zu verabreichen. Nach dem Experiment wurden Ratten getötet und mit Paraldehyd durchblutet.
Die Sehnerven wurden sorgfältig präpariert und für den Kryostatenschnitt montiert: Hier ist ein Beispiel für einen Rattenloch-Sehnerv mit geringerer Leistung, in den Evans blauer Farbstoff injiziert wurde. Um die Stelle zu visualisieren, zeigt der Pfeil die genaue Position der Injektion an. Diese Dissektion wurde innerhalb weniger Tage nach der Injektion durchgeführt, was durch die eingeschränkte Diffusion des Farbstoffs durch den Nerv nach seiner Entwicklung angezeigt wird.
Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Neurologie den Weg, neue Wege zur Regeneration des Sehnervs zu erforschen und möglicherweise das verlorene Sehvermögen in diesem Rattenmodell der demyelinisierenden Erkrankung wiederherzustellen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine minimalinvasive Technik für die direkte Injektion in den Ratten-Optikusnerv vor, die darauf abzielt, die regenerative Forschung zu verbessern. Die Methode minimiert chirurgische Komplikationen und fördert eine schnellere Erholung der Versuchstiere.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Regenerative Medizin
- Tierchirurgie
Hintergrund
- Die direkte Injektion in den Sehnerv ist entscheidend für die Untersuchung regenerativer Prozesse.
- Herkömmliche Methoden beinhalten oft invasive Eingriffe, die zu Komplikationen führen können.
- Mit dieser Technik soll das Überleben und die Erholung der Versuchstiere verbessert werden.
- Das Verständnis der Auswirkungen von Injektionen auf den Sehnerv ist für zukünftige Therapien von entscheidender Bedeutung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer weniger invasiven Methode zur Injektion von Arzneimitteln oder Stammzellen in den Sehnerv.
- Minimierung chirurgischer Risiken und Verbesserung der Erholungszeiten in Tiermodellen.
- Erleichterung der Untersuchung regenerativer Effekte nach der Injektion.
Verwendete Methoden
- Vornarkose des Rattens vor dem Eingriff.
- Positionierung der Ratte auf einem Präparationsständer für optimalen Zugang.
- Präparation des Orbitarandes, um den Sehnerv freizulegen.
- Injektion des Medikaments oder der Stammzellen mittels einer Glaspipette.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine erfolgreiche Injektion, ohne den Schädel zu öffnen.
- Ratten erholen sich im Vergleich zu herkömmlichen Methoden schneller.
- Die postoperative Untersuchung zeigt, dass die Wirkungen der Injektionen sichtbar gemacht werden können.
- Die Methode unterstützt das Überleben der Ratte über längere Beobachtungszeiträume hinweg.
Schlussfolgerungen
- Diese minimalinvasive Technik eignet sich für Injektionen in den Sehnerv.
- Sie verringert Komplikationen und verbessert den Erholungsprozess.
- Der Ansatz ist vorteilhaft für zukünftige regenerative Forschung in der Neurowissenschaft.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese minimalinvasive Technik ermöglicht die direkte Applikation therapeutischer Wirkstoffe in den optischen Nerv der Ratte ohne Öffnung des Schädels und unterstützt damit Längsschnittstudien in der regenerativen Neurologie. Durch die Erhaltung der Tierüberlebensfähigkeit und die Verringerung des chirurgischen Traumas wird die Durchführbarkeit von Experimenten mit chronischer Dosierung und Stammzelltransplantation verbessert. Der Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung für Strategien zur Reparatur des Sehnervs und verringert die Risiken translationaler Ansätze in Modellen demyelinisierender Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch direkte Applikation von Stammzellen oder Wirkstoffen am Sehnerv.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch lokal begrenzte Intervention ohne störende systemische Effekte.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem die Injektionsstellen und die Verteilung von Tracern mittels Evans-Blau-Färbung sichtbar gemacht werden können.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Schafft eine standardisierte, reproduzierbare chirurgische Plattform für die Applikation von Substanzen oder Zellen in den Sehnerv.
- Quantifizierbare Ausgabe: Ermöglicht die Beurteilung des Injektionserfolgs durch Lokalisation des Farbstoffs und mikroskopische Untersuchungen nach der Operation.
- Skalierbarkeit: Unterstützt wiederholte Eingriffe aufgrund einer schnellen Erholung und geringer Invasivität.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert eine Verletzung des Sehnervs und Demyelinisierung und steht somit im Einklang mit der therapeutischen Entwicklung zur Wiederherstellung des Sehvermögens.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke zwischen Entdeckung und präklinischer Validierung, indem chronische Beobachtungen regenerativer Effekte ermöglicht werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Kriterien basierend auf histologischer Bestätigung der Injektionsgenauigkeit und des Gewebeantwortverhaltens.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Technik integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Validierung und ermöglicht die iterative Entwicklung von Neurotherapeutika.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem Wirkstoffe direkt dem Sehnerv zugeführt werden, um die Zielstrukturen zu untersuchen.
- Screening: Verbessert die Zuverlässigkeit von Tests durch eine gleichmäßige, minimalinvasive Applikation ohne chirurgische Variabilität.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Auswertungen mittels Farbstoffretention und histologischer Schnitte zur Beurteilung der Injektionswirksamkeit.
- Translationale Forschung: Ermöglicht einen kontinuierlichen präklinischen Ablauf, indem Überlebensphasen lang genug sind, um regenerative Effekte zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Methode für mehrere Studien zur Reparatur des Sehnervs.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Zielmodulation und verringert mechanistische Unschärfen in Studien zum Sehnerv.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit der intrazerebralen Applikation in Nagetiermodellen.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, indem frühzeitige Validierung von Applikationspräzision und Gewebetoleranz ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung neuroregenerativer Kandidaten basierend auf der Durchführbarkeit der Applikation.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie und Anästhesieprotokollen an Nagetieren.
- Benötigt eine Mikrospritze, Glas-Mikropipetten und stereotaktische Manipulationsgeräte.
- Setzt eine standardisierte postoperative Versorgung einschließlich Analgesie und Thermoregulation voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Nagetierstämme oder Nervendurchmesser.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer terminale Dissektion zur Überprüfung der Injektionsstelle, wodurch eine longitudinale in-vivo-Bildgebung ausgeschlossen ist.
