Name: Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie eine minimal-invasive Injektionstechnik für den Nervus opticus bei Ratten. Diese Methode minimiert chirurgische Komplikationen und ermöglicht schnellere Erholung für regenerative Neurowissenschaften.

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Diese Studie wurde unterstützt von NeuralStem, Inc. und Johns Hopkins Project RESTORE.

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden von der Johns Hopkins Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Anästhesiegeräte erfordern jährliche Inspektion und Kalibrierung nach Bedarf. 1. Anästhesie und Lagerung <ol><li> Anästhesie. <ol><li> Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Narkose mit 2-3% Isofluran. Bestätigen angemessene Höhe der Anästhesie durch toe Prise und Atemfrequenz. Überprüfen Sie, dass die Ratte nicht in Reaktion auf eine Zehe Prise zusammenzucken. HINWEIS: Ein Zucken zeigt Anästhesie, die zu spät ist und kann mehr Anästhesie vor Beginn oder eine höhere Isofluoran Konzentration erfordern. Ein Atemfrequenz weniger als 1 Atemzug alle 2 Sek zu langsam ist, die die Narkose ist zu hoch und kann Aufhellung der Isofluoran Konzentration erfordern. </li><li> Sichern Sie das Tier wie nötig, um die Kopfbewegung während des Verfahrens zu verhindern. Geben Sie einen Tropfen von Lidocain auf der chirurgischen Augen. Verwenden Sie künstliche Tränen alle 10 min bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Gebeneine Injektion von Buprenorphin 0,01 mg / kg SC präoperativ und dann alle 6-8 h je nach Bedarf. </li></ol></li><li> Positionierung. <ol><li> Zeigen Ratten in einen stereotaktischen Rahmen und warm halten mit einem Heizkissen. Befeuchten Sie die Kopfhaut Pelz mit Alkohol kümmert, um die Exposition der Augen zu vermeiden. Verwenden Sie sterile Instrumente und sterile Technik, um das Risiko von postoperativen Infektionen zu minimieren. </li></ol></li></ol> 2. Eye Control <ol><li> Legen Sie eine 4-0 Naht in der seitlichen Bindehaut und binden Sie es mit genügend Naht auf sanfte Traktion ermöglichen. </li></ol> 3. Dissection <ol><li> Initial Dissection. <ol><li> Machen Sie eine ~ 1 Zoll Schnitt in der Haut über der Orbital Grat mit einer Größe 10 Skalpell, wie in Abbildung 1 gezeigt. Ziehen Sie die Haut und das darunter liegende Faszie und sorgfältig sezieren entfernt die Faszie. Um starke Blutungen in das Operations vermeiden, vermeiden, schneiden die Blutgefäße während sezieren die Faszie. Verwenden Sie strategisch placed Baumwolle Tipps, um Hämostase bereitzustellen. </li></ol></li><li> Deeper Dissection. HINWEIS: Bei leichten Zug auf der Bindehaut zieht das Auge nach unten und aus der Steckdose, wird der Muskel orbitalis superior in den Blick geraten. Um den optischen Nerv freizulegen, muss dieser Muskel geschnitten werden und die retroorbitalen Fett entfernt. Das Fett kann verworfen werden und nicht nach der Injektion ersetzt. Ab diesem Zeitpunkt sollte der Sehnerv Faszien als ein Bündel des Sehnerven selbst sichtbar sein, zusammen mit Blutgefäßen in Dura verpackt (Abbildung 1). <ol><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Dura mit dem Skalpell oder eine 31 Gauge Nadel abgeschrägt, um piercing weniger traumatisch. </li></ol></li></ol> 4. Pipettieren Injector <ol><li> Ziehen einer Glasmikropipette mit einem Durchmesser von 50-100 um. Um Stabilität zu gewährleisten, montieren Sie die Mikropipette auf einem Mikromanipulator und heften sich an einer Hamilton-Spritze mit einer Infusionspumpe angeschlossen. </li><li> Ziehen Sie die Perlen (oder Stammzellen)in einem 0,5-1,0 ul Volumen in der Mikropipette zusammen mit 0,5 &amp; mgr; l Volumen der Methylenblaulösung vor und nach Retrogradation rekonstituiert. HINWEIS: Eine Infusionsrate auf 0,5 bis 2 &amp; mgr; l pro min eingestellt verhindert Trauma des Sehnervs. </li></ol> 5. Injection <ol><li> Senken Sie die Spitze der Mikropipette auf den Sehnerv direkt über der Dura geklaut. HINWEIS: Eine kleine, aber rege Bewegung der Glasspitze in den Sehnerv Ergebnisse im geringsten Schaden. Da die Infusionspumpe beginnt, sollte die Methylenblau-Farbstoff den Bereich des Sehnervs injiziert markieren. Der Farbstoff sollte innerhalb des Sehnervs ohne Austreten in den Subarachnoidalraum lokalisiert bleiben. </li><li> Folgen Sie dem zweiten Band von Methylenblau, um festzustellen, wenn die Stammzellinjektion abgeschlossen ist und schalten Sie die Infusionspumpe aus, wenn die zweite Dosis von Methylenblau eingespritzt wird. Halten Sie die Mikropipette immer noch innerhalb des Sehnerven für 2 Minuten für jeweils 1 &amp; mgr; l Volumen eingespritzt, um zu verhindern HochDruckausstoß beim Zurückziehen der Mikropipette. HINWEIS: Ein alternativer Ansatz ist, um die Pipettenspitze mit einer Luftspritze, die manuell bearbeitet werden kann angeschlossen werden. So oder so, dass kein übermäßiger Kraft, um Schäden an den Sehnerven zu minimieren. Wir empfehlen, die Injektion nicht mehr als 2 &amp; mgr; l Volumen in jedem Sehnerv. </li></ol> 6. Folgen Sie up <ol><li> Unmittelbar. <ol><li> Wenn die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Mikropipette zusammen mit allen Baumwollspitzen verwendet werden, um die Blutstillung bereitzustellen. Naht der Haut mit 3-0 Seide und entfernen Sie den Bindehautnaht. </li><li> Halten Ratten warmen auf einem Heizkissen, bis sie aus der Narkose hervorgehen. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </li><li> Wird das Tier Anzeichen von Schmerzen, einschließlich übermäßige Lethargie, Ataxie, oder arbeiteten breathin Ausstellerg, zu verwalten angemessenen Schmerzmitteln mit intramuskulären Buprenorphin (0,05 mg / kg) bis zu dreimal täglich. </li></ol></li><li> Langfristig. <ol><li> Für die nächsten 24-48 Stunden, beobachten die Ratte für Komplikationen der Operation, einschließlich Schwellung oder Entlassung aus der Wunde oder anderen Anzeichen von Schmerzen, wie vocalizing, gebeugt Aussehen, nicht-Pflege, oder nicht essen. Betrachten Sie Rücksprache mit einem Tierarzt oder ethische Euthanasie wie nötig. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+and+future+prospects+for+stem+cell+rescue+and+regeneration+of+the+retina+and+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+ophthalmology+Journal+canadien+d%27ophtalmologie%22%5BJournal%5D)">Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve.</a> Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine aussagekräftigen Angaben zu berichten.

Die direkte Injektion von Stammzellen in den Sehnerv oder andere Produkte, die die Regeneration erleichtern sollen, stellt im Vergleich zu anderen Mitteln der Injektion in das ZNS ein bequemes Modell dar. Diese Technik nimmt weniger Zeit in Anspruch, erfordert weniger Vollnarkose, vermeidet das Bohren oder Entfernen von Schädel- oder Knochengewebe, reduziert die Komplikationsrate und ermöglicht eine schnellere Genesung nach der Operation. 
Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehör...

Der Sehnerv ist ein idealer Ort für das zentrale Nervensystem (ZNS) regenerative Forschung einschließlich ophthalmologische Erkrankungen wie Sehnervenentzündung, Glaukom und Trauma. Injektionen mit einer Vielzahl von Stammzellen wurden entweder Wirksamkeit gezeigt oder als vielversprechend bei der Ersetzung verlorener Myelin Erhöhung axonalen Zahl und / oder Prävention von degenerativen Erkrankungen. 1,2 Der menschliche Sehnerv enthält etwa 1,2 Millionen parallel Axone Weg von der Netzhaut zum chiasm mit einem Durchmesser von etwa 3,0-3,5 mm. 3 bei Erkrankungen des Menschen im Labor Modell wurde die Ratte häufig verwendet worden. Erwachsene Ratten Sehnerv enthält ungefähr 100.000 Axone innerhalb eines Durchmessers von etwa 0,5 mm. 4 eine der Hauptbeschränkungen bei der ZNS-regenerative Forschung direkten Zugriff ohne Knochen. Komplikationen und Operationsrisiken für das Tier sind höher, wenn der Schädel oder Wirbeln entfernt werden. Ähnlich zu den Vorteilenminimalinvasive Ansätze in der Wirbelsäule, 5 direkte Sehnerv Injektionen ohne Öffnen der Schädel Angebot reduziert Komplikationen und eine schnellere Erholung. Diese Technik wurde in früheren Studien verwendet worden. 6 In diesem Manuskript und begleitende Video zeigen wir eine minimal-invasives Verfahren zur Gewinnung von Stammzellen in der Ratte Sehnerv injizieren.

<table><tbody><tr><td>Lewis Ratte</td><td>Charles River</td><td>4</td><td>Jeder Rattenstamm funktioniert.</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>Surgivet</td><td>CDS9000</td><td>CDS 9000 Anästhesiegerät für Kleintiere -</td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td> zur Stangenmontage <td>Stoelting</td><td>53129</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>National Optical</td><td>409-411-1105</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtquelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Dissektion und stereotaktisches Instrument</td><td>Stoelting</td><td>51400</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Kopf</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>18150-6</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpellklingen</td><td>Harvard Apparatur</td><td>810-15-021</td><td></td></tr><tr><td>Iridektomieschere</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften Uniband LA-4XF</td><td></td></tr></tbody></table>

minimal-invasive technik für die injektion in ratten-optic nerve

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

Der Sehnerv der Ratte ist ein nützliches Modell für die Forschung zur Stammzellregeneration. Die direkte Injektion in den Sehnerv der Ratte ermöglicht die Verabreichung in das zentrale Nervensystem in einer minimal-invasiven Operation ohne Knochenentfernung. Diese Technik beschreibt einen Ansatz zur Visualisierung und direkten Injektion des Sehnervs nach einer kleinen faszialen Dissektion aus dem Orbitakam, bei dem eine konjunktivale Traktionsnaht verwendet wird, um das Auge sanft nach unten und außen zu ziehen. Repräsentative Beispiele eines injizierten Sehnervs zeigen die erfolgreiche Injektion von gefärbten Kügelchen.

Am Ende des Experiments wurden die Ratten getötet und mit 4% Paraformaldehyd perfundiert. Die Sehnerven wurden sorgfältig seziert und für Kryostat Schnitte angebracht. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel einer Ratte ganzen Sehnerven bei geringer Leistung, bei dem Evans-Blau-Farbstoff wurde, um die Website zu visualisieren injiziert. Der Pfeil bezeichnet die genaue Lage der Injektion. Diese Präparation wurde in wenigen Minuten von der Injektion durchgeführt, wie durch die beschränkte Diffusion des Farbstoffes...

Direkte Injektion in den Sehnerv der Ratte ist nützlich für die regenerative Forschung. Wir demonstrieren eine minimal-invasive Technik zur direkten Injektion in einen Sehnerv der Ratte, bei der der Schädel nicht geöffnet werden muss. Mit dieser Methode werden chirurgische Komplikationen minimiert und die Genesung ist schneller.

Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine minimalinvasive Methode zur Injektion von Wirkstoffen oder Stammzellen in den Sehnerv einer lebenden Ratte bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Ratte anästhesiert, auf dem Präparationsständer positioniert und ein Faden in die Bindehaut eingebracht wird, um das Auge zu manipulieren. Im weiteren Verlauf besteht der zweite Schritt darin, entlang des Orbitarandes hinter dem Auge zu dissezieren, um den Sehnerv freizulegen. Anschließend wird die Glaspipette in den Sehnerv eingeführt, und die Substanz oder Stammzellen werden injiziert, bevor die Operationsstelle verschlossen und die Ratte aus der Narkose aufgeweckt wird. Letztendlich wird nach einer bestimmten Zeitspanne die Ratte getötet, der Sehnerv präpariert und die Wirkung der chirurgischen Injektion oder Transplantation mittels Mikroskopie sichtbar gemacht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie minimalinvasiv ist, wodurch die Ratte so lange überleben kann, wie erforderlich.Untersuchen Sie die Wirkungen chirurgischer Injektion oder Transplantation. Die Durchführung der Prozedur demonstriert Kate Schwartz, eine studentische Technikerin aus meinem Labor. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Anästhesie mit zwei bis 3 % Isofluran durch.Überprüfen Sie die angemessene Anästhesietiefe durch Zehenquetschung und Atemfrequenz. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf eine Zehenquetschung reagiert. Sichern Sie das Tier entsprechend, um Kopfbewegungen während des Eingriffs zu vermeiden.Tragen Sie dann einen Tropfen Lidocain auf das Operationsauge auf. Verwenden Sie alle 10 Minuten künstliche Tränen, um Austrocknung während der Anästhesie zu verhindern. Verabreichen Sie eine präoperative Injektion von Buprenorphin subkutan mit 0,01 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht und danach alle sechs bis acht Stunden nach Bedarf.Halten Sie das Tier mit einer Heizplatte warm. Benetzen Sie das Kopfhaar mit Alkohol, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Augen nicht benetzt werden.Verwenden Sie unbedingt sterile Instrumente und eine sterile Technik, um das Risiko postoperativer Infektionen zu minimieren. Bringen Sie anschließend einen 4-0-Nahtfaden in der lateralen Bindehaut an und knoten Sie ihn mit ausreichend langem Fadenende, um sanfte Zugkraft ausüben zu können. Führen Sie einen etwa einen Zoll langen Schnitt in der Haut über dem Orbitarand durch.Unter Verwendung eines Skalpells der Größe 10. Ziehen Sie die Haut und die darunterliegende Faszie zurück und dissezieren Sie vorsichtig die Faszie ab. Setzen Sie einen Faden in die zurückgezogene Haut, um die Exposition des oberen Orbitalsacks zu ermöglichen und eine übermäßige Blutung in die Operationsstelle zu verhindern.Vermeiden Sie es, Blutgefäße beim Präparieren der Faszie zu verletzen. Durch vorsichtige Zugkraft auf die Bindehaut, wodurch das Auge nach unten und aus der Augenhöhle herausgezogen wird, wird der obere Augenhöhlenmuskel sichtbar. Um den Sehnerv freizulegen, muss das retroorbitale Fettgewebe entfernt und dieser Muskel durchtrennt werden.Das Fett kann verworfen werden und sollte nach der Injektion nicht ersetzt werden. Ab diesem Punkt sollte die Fascia des Sehnervs als Bündel des Sehnervs selbst zusammen mit in der Dura eingehüllten Blutgefäßen sichtbar sein. Um die tiefere Präparation durchzuführen, erzeugen Sie einen kleinen Einschnitt in der DRA mithilfe eines Skalpells oder einer abgeschrägten Nadel der Größe 31 Gauge, um die Punktion weniger traumatisch zu gestalten. Bereiten Sie zudem eine gezogene Glas-Mikropipette mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern vor, um Stabilität zu gewährleisten.Befestigen Sie die Mikropipette an einem Mikromanipulator und verbinden Sie sie mit einer 20-cc-Kunststoffspritze. Ziehen Sie mit der Mikropipette retrograd 0,5 bis einen Mikroliter Perlen oder in dieser Menge rekonstituierte Stammzellen sowie jeweils 0,5 Mikroliter Methylenblau-Lösung vor und nach dem Befüllen der Glaspipette mit Farbstoff auf. Senken Sie mit Hilfe einer 1-cc-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel die Spitze der Mikropipette auf den Sehnerv direkt oberhalb der angeritzten Dura.Eine winzige, aber zügige Bewegung der Glaspipette in den Sehnerv führt bei langsamer und konstanter Druckanwendung auf den Kolben zu einer möglichst geringen Schädigung. Der Evans-Blau-Farbstoff sollte den Bereich des injizierten Sehnervs hervorheben. Der Farbstoff sollte lokal im Sehnerv verbleiben, ohne in den Subarachnoidalraum auszutreten.Folgen Sie der zweiten Bande von Evan's Blue Dye, um festzustellen, wann die Stammzelleninjektion abgeschlossen ist. Wenn das erforderliche Volumen in den Sehnerv injiziert wurde, lassen Sie den Kolben los. Halten Sie die Mikropipette nach der Injektion fünf Minuten lang ruhig im Sehnerv, um eine Ausstoßung unter hohem Druck beim Herausziehen der Mikropipette zu verhindern.Entfernen Sie die Mikropipette zusammen mit allen Baumwollspitzen, die zur Blutstillung verwendet wurden. Nähen Sie die Haut mit 3.0 Seide und entfernen Sie die Bindehautnaht. Halten Sie die Ratten auf einer Heizplatte warm, bis sie aus der Narkose aufwachen.Das Tier darf nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustlage beizubehalten. Wenn das Tier Anzeichen von Schmerzen zeigt, einschließlich übermäßiger Lethargie, Ataxie oder gestörter Atmung, verabreichen Sie entsprechende Analgesie mittels intramuskulärem Buprenorphin bis zu dreimal täglich. Nach dem Experiment wurden die Ratten getötet und mit Paraldehyd perfundiert.Die Sehnerven wurden sorgfältig präpariert und zur Kryostatschnittenherstellung aufgebaut; hier ist ein Beispiel eines gesamten Ratten-Sehnervs bei geringerer Vergrößerung dargestellt, in den Evan's-Blau-Farbstoff injiziert wurde. Um die Injektionsstelle sichtbar zu machen, markiert der Pfeil die exakte Position der Injektion. Diese Präparation erfolgte innerhalb weniger Tage nach der Injektion, was durch die begrenzte Diffusion des Farbstoffs entlang des Nervs nach dessen Entwicklung angezeigt wird.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der regenerativen Neurologie, neue Ansätze zur Regeneration des Sehnervs und zur möglichen Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens in diesem Rattenmodell einer demyelinisierenden Erkrankung zu erforschen.

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Intravitrealen Injektion zur Einrichtung Ocular Krankheiten Modell

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Dieses Video zeigt die Prozedur des chirurgischen Zugangs zum Sehnerv bei einem anästhesierten Tier und die präzise Abgabe von Lysolecithin, um eine fokale Demyelinisierung zu induzieren und neuropathologische Zustände für weitere Studien zu schaffen.

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Subretinale Injektionen sind die gebräuchlichste Technik zur Verabreichung großer therapeutischer Wirkstoffe wie Proteine und viraler Vektoren an Photorezeptoren und das retinale Pigmentepithel. Eine alternative Methode bei Mäusen, die erfolgreich auf den subretinalen Raum mit minimalen Kollateralschäden und schnellen Erholungszeiten abzielt, wird hier beschrieben.

Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum<i&gt; über</i&gt; A Transcleral dorsalen Zugang

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Intrakamerale Injektion bei Ratten mit geringem Risiko für Nebenwirkungen

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Direktes Vagusnerv-Injektionsprotokoll für Ratten

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